lục 3.5)
Protein G-CSF mặc dù không có thẻ 6 histidine nhưng các nghiên cứu đã cho thấy trong phân tử protein có 5 acid amin histidine và một acid amin cysteine tự do, đây là các acid amin có ái lực cao với các ion kim loại hóa trị 2, khi protein G-CSF được gấp cuộn đúng có ít nhất 4 acid amin histidine (His43, His52, His156, His170) và cysteine tự do Cys17
được đưa ra ngoài bề mặt, đồng thời vị trí của hai acid amin His52
và His156 là nằm kế cận nhau. Do vậy protein G-CSF khi được gấp cuộn đúng sẽ có ái lực mạnh với các ion kim loại hóa trị 2, do vậy có thể tinh chế protein G-CSF bằng cách phương pháp sắc ký ái lực sử dụng các ion kim loại hóa trị 2. Nên chúng tôi tiến hành khảo sát quy trình tinh chế G-CSF ở quy mô phòng thí nghiệm bằng hệ thống sắc ký IMAC.
Các bước của quy trình được tiến hành như sau:
Khảo sát khả năng gắn của G-CSF lên cột IMAC-Cu và IMAC-Zn
Mẫu sau khi được tái gấp cuộn được chỉnh pH về 7.5, tiếp đến rửa cột bằng nước cất và cân bằng cột bằng dung dịch B1, sau đó cho mẫu qua cột, rửa cột bằng dung dịch B2 và W, sau đó dung ly mẫu bằng dung dịch E (ở
71
cuối mỗi bước đều thu dung dịch sau khi qua cột để tiến hành phân tích về sau)
Khảo sát quá trình tinh chế G-CSF bằng hệ thống Akta FPLC
Mẫu sau khi được tái gấp cuộn được chỉnh pH về 7.5, lắp và rửa cột, cân bằng cột bằng B1, nạp mẫu, thu dung dịch F sau khi mẫu đi qua cột, rửa cột bằng dung dịch W, và dung ly mẫu bằng dung dịch E (ở cuối mỗi bước đều thu dung dịch sau khi qua cột để tiến hành phân tích về sau)
Phân tích và đánh giá kết quả tinh chế G-CSF
Tiến hành điện di SDS-PAGE để đánh giá khả năng gắn lên cột IMAC- Cu và IMAC-Zn và hiệu quả tinh chế protein G-CSF của hệ thốngAkta FPLC
Kết luận: Đã tinh chế thành công G-CSF thu nhận được sau quá trình tái gấp cuộn.
Hình 16. Kết quả tinh chế G-CSF
Giếng 1: thang chuẩn protein; giếng 2: dịch sau tái gấp cuộn; giếng 3: peak 1; giếng 4: peak 2