CSF bằng Jar fermentor quy mô 50 lít(phụ lục 2.6)
Chúng tôi tiến hành lên men chủng E. coli BL21(DE3)/pET-GCSF ở quy mô 50L bằng hệ thống lên men tự động 100L (Nhật), theo quy trình gồm nhiều bước như sau:
58
Các thông số cài đặt cho quá trình lên men chủng E. coli biểu hiện G- CSF như sau: pH=7,00, DO>20%, nhiệt độ 370C, tốc độ khuấy: 250 vòng/phút, lượng khí đưa vào ở mức tối đa có thể.
Tiến hành thu dịch nuôi cấy và xác định OD600 của dịch nuôi cấy ở thời điểm bắt đầu lên men (lúc 0 giờ).
Trong quá trình lên men, cách 1 giờ tiến hành thu mẫu đo OD600 và xác định giá trị DCW nhằm khảo sát động học tăng trưởng của chủng, kiểm tra và xác nhận sự biểu hiện protein bằng phương pháp SDS-PAGE và lai Western Blot. Sau 24 giờ nuôi cấy, tiến hành ly tâm thu sinh khối.
Kết quả thu được như sau: mật độ tế bào (OD) cao nhất là 39,36 lúc 14h, sinh khối khô 18,77g/L, lượng G-CSF 1,38g/L, hiệu quả thu nhân G-CSF 7,35%.
Cấy 1 khuẩn lạc đơn từ đĩa chủng
Chủng E. coli BL21(DE3)/pET-GCSF
Họat hóa cấp 1
500 ml môi trường LB
Họat hóa cấp 2 bằng BioTron- LiFlus GX GX-05-12302 5L với
môi trường cấp 2
Lên men
50 lít môi trường lên men với tỉ lệ nạp giống 1:10
600 vòng/phút, 370C, 24 giờ, pH 7.0 Thu mẫu qua các giờ nuôi cấy
250 vòng/phút, 370C, qua đêm
400 vòng/phút, 370C, pH 7.0 10-14 giờ
59
Kết luận: Kết quả đạt được chứng tỏ protein G-CSF đã được biểu hiện vượt mức, và quy trình lên men có thể thu nhận được một lượng G-CSF lớn để đáp ứng cho các mục tiêu downstream.
8. Khảo sát phƣơng thức thu sinh khối tế bào quy mô 50 lít (phụ lục 2.7)
Công nghệ sản xuất G-CSF tái tổ hợp có hoạt tính là một quy trình nhiều bước, có thể kể đến những bước cơ bản sau: tạo dòng tế bào biểu hiện G-CSF, lên men thu nhận G-CSF, thu nhận G-CSF ở trạng thái gấp cuộn đúng, tinh chế thu nhận G-CSF ở dạng tinh khiết, kiểm tra hoạt tính G-CSF... Để thu nhận được một lượng lớn protein G-CSF, quy trình công nghệ phải được thực hiện ở quy mô lớn chứ không phải ở các quy mô nhỏ, lẻ trong phòng thí nghiệm. Do vậy đầu tiên cần tiến hành lên men thu nhận G-CSF ở quy mô lớn để thu nhận một lượng lớn G-CSF làm nguyên liệu cho các quá trinh về sau. Một vấn đề được đặt ra khi tiến hành lên men ở quy mô lớn là thu nhận sinh khối từ một thể tích lớn dịch lên men. Do vậy chúng tôi tiến hành khảo sát các phương thức thu nhận sinh khối nhằm tối ưu khả năng thu nhận sinh khối, góp phần nâng cao hiệu suất của toàn bộ quá trình sản xuất G-CSF.
Hiện nay có nhiều phương thức để thu nhận sinh khối tế bào. Tùy thuộc vào mục đích, điều kiện cơ sở vật chất cũng như tùy thuộc vào đặc tính của tế bào để chọn phương thức thu nhận sinh khối thích hợp. Đối với tế bào vi khuẩn E. coli, phương thức thu nhận sinh khối tế bào đơn giản mà có hiệu quả cao, hiện đang được áp dụng rộng rãi là phương pháp ly tâm và phương pháp lọc tiếp tuyến.
Đối với phương pháp ly tâm thì các thông số cần quan tâm khảo sát trong quá trình thu nhận sinh khối đó là thời gian ly tâm, tốc độ và lực ly tâm. Bên cạnh đó, cũng có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả thu nhận sinh khối của phương pháp lọc tiếp tuyến như: kích thước lỗ màng, chiều dài cột lọc, các điều kiện trong quá trình lọc... Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành khảo sát quá trình thu nhận sinh khối bằng phương pháp ly tâm và lọc tiếp tuyến.
60
Nội dung thực hiện trong thí nghiệm được tóm tắt như sau:
- Khảo sát quá trình thu nhận sinh khối bằng phương pháp ly tâm: cho dịch lên men vào các ống ly tâm, điều chỉnh các thong số thời gian, tốc độ, nhiệt độ thích hợp, sau quá trình ly tâm tách riêng phần dịch môi trường mang đi đo OD600, còn phần tủa mang đi xác định trọng lượng sinh khối tươi.
- Khảo sát quá trình thu nhận sinh khối bằng phương pháp lọc tiếp tuyến: trước khi sử dụng tiến hành rửa cột bằng nước cất và NaOCl 100ppm, sau đó mang dịch lên men cho vào hệ thống và bắt đầu lọc, sau khi lọc rửa lại cột lọc bằng NaOH 0,1N trong 15 phút và bảo quản trong EtOH 30%.
Kết luận: Đã khảo sát hai phương pháp thu nhận sinh khối tế bào là phương pháp ly tâm và phương pháp lọc tiếp tuyến. Phương pháp thu nhận sinh khối tế bào thích hợp là kết hợp phương pháp lọc tiếp tuyến với hệ thống Quixstand Benchtop với cột lọc UFP-750-E-4A để giảm thể tích ở giai đoạn ban đầu và sử dụng phương pháp ly tâm để thu nhận sinh khối ở giai đoạn sau.
9. Khảo sát phƣơng thức phá tế bào tạo dịch đồng nhất hoặc thu nhận chu chất (phụ lục 2.8)
Để có thể thu nhận được protein G-CSF có hoạt tính ở bước cuối cùng cần phải xuất phát ở bước đầu tiên với quy mô đủ lớn. Do đó chúng tôi đã tiến hành lên men các chủng tái tổ hợp ở quy mô pilot 1L-5L-50L. Sau khi thu nhận sinh khối lên men, chúng tôi tiến hành phá tế bào hoặc phá màng tế bào.
Tùy thuộc vào các đặc điểm của từng loại tế bào mà có các phương pháp thích hợp tương ứng. Đối với tế bào vi khuẩn, các phương pháp có thể sử dụng để phá tế bào là phá tế bào bằng tác nhân cơ học - sử dụng máy phá tế bào, bằng tác nhân vật lý - sóng siêu âm tạo ra từ máy sonicate, bằng tác nhân hóa học như các hóa chất, dung môi làm tổn thương thành tế bào hay sử dụng tác nhân sinh học là các loại enzyme có tác dụng ly giải thành tế bào... Tuy nhiên, các phương pháp vừa kể thường có giá thành cao hoặc chỉ áp dụng
61
được với lượng mẫu nhỏ. Do đó, với lượng mẫu lớn, việc sử dung công nghệ phá tế bào bằng cách bơm dòng dịch treo tế bào dưới áp lực cao qua một khe phá nhỏ, là công nghệ tiên tiến nhất hiện nay là một giải pháp tối ưu.
Để phá vỡ màng tế bào, người ta thường dùng phương pháp sốc thẩm thấu. Phương pháp này cho phép tách các phân đoạn protein trong tế bào E. coli (bao gồm phân đoạn protein chu chất, phân đoạn proten tế bào chất, phân đoạn protein tổng số) dựa vào đặc tính thấm chọn lọc của màng vi khuẩn. Đầu tiên, tế bào sẽ được rửa bằng một dung dịch đẳng trương giúp ổn định màng tế bào. Sau đó, ủ tế bào với một dung dịch ưu trương, nước trong tế bào sẽ thoát ra ngoài. Tế bào trở nên nhăn nheo. Đồng thời, màng tế bào bị tác động bởi tác nhân hóa học và cơ học trở nên yếu ớt, dễ vỡ. Cuối cùng, tế bào bị sốc khi cho vào môi trường nước. Sự thay đổi đột ngột từ môi trường ưu trương sang đẳng trương, các phân tử nước thẩm thấu vào tế bào nhanh đủ làm màng ngoài tế bào vỡ giải phóng phần protein trong chu chất ra môi trường.
Nội dung thực hiện:
- Thu nhận sinh khối, xác định mật độ tế bào và sinh khối khô sau quá trình lên men.
- Phá tế bào với các thông số khảo sát là nồng độ dịch huyền phù tế bào và số chu kỳ phá trong dịch lên men dòng tái tổ hợp tổng hợp protein G-CSF dạng thể vùi và dạng thể tan trong tế bào chất nhằm tạo dịch đồng nhất tế bào.
- Thu nhận phân đoạn chu chất từ dịch lên men dòng tái tổ hợp tổng hợp protein G-CSF dạn tan trong chu chất bằng phương pháp sốc thẩm thấu.
- Kiểm tra và phân tích sự hiện diện của protein G-CSF trong mẫu phá tế bào bằng SDS-PAGE và lai Western blot.
Kết luận:
Đã khảo sát phương pháp và các điều kiện tối ưu nhằm đồng nhất mẫu sau lên men và thu nhận dịch có chứa protein G-CSF.
62
- Đối với G-CSF dạng tan và dạng thể vùi trong tế bào chất: sử dụng phương pháp phá tế bào bằng máy phá M-110EH-30 Microfluidizer Processor với 3 chu kỳ phá liên tiếp ở độ pha loãng 1mg sinh khối tươi tế bào huyền phù trong 5ml dung dịch lysis.
- Đối với G-CSF dạng tan trong chu chất: sử dụng phương pháp sốc thẩm thấu nhằm thu nhận phân đoạn chu chất của tế bào.
63
Chƣơng IV.
Nghiên cứu quy trình công nghệ thu nhận và tinh chế G-CSF(phụ lục 3)
Trong nội dung nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành các chuyên mục sau:
- Nghiên cứu quy trình thu nhận và tinh chế G-CSF dạng thể vùi trong tế bào chất E. coli (PL 3.1)
- Nghiên cứu quy trình thu nhận và tinh chế G-CSF dạng tan trong tế bào chất E. coli (PL 3.2)
- Nghiên cứu quy trình thu nhận và tinh chế G-CSF dạng tan trong chu chất E. coli (PL 3.3)
- Nghiên cứu quy trình thu nhận và tinh chế G-CSF được tổng hợp và tiết ngoại bào bởi nấm men P. pastoris (PL 3.4)
- Nghiên cứu quy trình tinh chế G-CSF quy mô phòng thí nghiệm (PL 3.5)
- Nghiên cứu quy trình tinh chế G-CSF quy mô pilot (PL 3.6)
1. Nghiên cứu quy trình thu nhận G-CSF từ dạng thể vùi trong tế bào chất E. coli (phụ lục 3.1) chất E. coli (phụ lục 3.1)
Trong các chiến lược sản xuất protein tái tổ hợp, hệ thống biểu hiện vượt mức trong Escherichia coli là hệ thống có nhiều ưu thế. Tuy nhiên, việc biểu hiện ở mức cao các protein tái tổ hợp trong E. coli lại dẫn đến sự hình thành thể vùi. Những thể vùi này không có hoạt tính sinh học, vì vậy cần phải hòa tan và tiến hành tái gấp cuộn để thu được protein với đầy đủ chức năng sinh học. Vì vậy, việc nghiên cứu để tìm ra các điều kiện tái gấp cuộn protein từ dạng thể vùi giữ vai trò then chốt trong toàn bộ quá trình sản xuất, thu nhận protein tái tổ hợp dạng thể vùi từ E. coli.
Tái gấp cuộn là quá trình chuyển đổi protein từ trạng thái không gấp cuộn thành trạng thái gấp cuộn đúng. Quá trình này diễn ra do những tương tác nội phân tử để hình thành các cầu nối disulfide. Khi những điều kiện tái gấp cuộn đã được thiết lập, ngoài cấu hình đúng của protein mục tiêu, sự tái gấp cuộn còn tạo thành nhiều cấu hình khác nhau gây nên sự kết tụ. Đồng thời sự tái
64
gấp cuộn còn cần được hỗ trợ thêm bởi các tác nhân hỗ trợ, chủ yếu là tác nhân vật lý: nhiệt độ và áp suất, tác nhân hóa học: Urea hoặc guanidine HCl thường được thêm vào trong dung môi tái gấp cuộn ở nồng độ đủ thấp để gấp cuộn hiệu quả, đủ cao để duy trì tính tan và sự linh động của các cấu trúc trung gian.
Do vậy chúng tôi tiên hành khảo sát quy trình thu nhận G-CSF từ dạng thể vùi trong tế bào chất E. coli được thực hiện bằng phương pháp tái gấp cuộn sử dụng nguyên tắc pha loãng nhằm thu nhận G-CSF có hoạt tính sinh học.
Các bước đã thiết lập trong quy trình có thể được tóm tắt như sau:
Xử lý, hòa tan thể vùi G-CSF
Thu nhận sinh khối tế bào từ dịch lên men. Hòa sinh khối tế bào trong dung dịch phá màng theo tỉ lệ 1/10 (w/v). Phá màng tế bào bằng máy hệ thống máy phá tế bào. Sau đó ly tâm ở 4°C để thu phần tủa. Phần tủa thu được là thể vùi protein G-CSF.
Rửa thể vùi G-CSF lần lượt bằng ba loại dung dịch rửa, thu được thể vùi sạch.
Hòa tan thể vùi bằng dung dịch hòa tan.
Kiểm tra sự biểu hiện G-CSF bằng điện di SDS-PAGE và lai Western Blot, cuối cùng là kiểm tra sự tinh sạch protein bằng phần mềm Quantity One.
Tái gấp cuộn thể vùi G-CSF đã hòa tan bằng phương pháp pha loãng,
65
Đánh giá và phân tích protein G-CSF sau quá trình tái gấp cuộn
- Xác định nồng độ và hiệu suất thu hồi protein sau quá trình tái gấp cuộn bằng phương pháp Bradford.
- Kiểm tra cấu hình tự nhiên của protein G-CSF bằng phương pháp điện di Native-PAGE, so sánh với protein G-CSF chuẩn.
- Kiểm tra hoạt tính sinh học của G-CSF bằng thử nghiệm in vitro trên dòng tế bào M-NFS-60.
Kết luận: Đã thu nhận thành công protein G-CSF có hoạt tính sinh học từ dạng thể vùi trong tế bào chất của E. coli với hiệu suất thu hồi protein đạt
55,65%.
Sinh khối khô (g/L) 9,22 ± 0,45
Lượng protein tổng thu được trong các pha chứa G-
CSF của 1L dịch lên men (g) 3,655 ± 0,18
Nồng độ mẫu sau quá trình tái gấp cuộn (μg/ml) 66,08 ± 5,60 Tổng lượng proteinsau quá trình tái gấp cuộn đối với
1L dịch lên men (mg) ~ 261 ± 5,14
Thu dung dịch trong màng.
Ly tâm ở 4°C, thu phần dịch nổi. Bảo quản ở 4°C.
Nạp thể vùi đã hòa tan vào dung dịch tái gấp cuộn, nồng độ cuối đạt 100– 150μg/ml.
Giữ lạnh 4°C, 18 giờ.
Chỉnh hỗn hợp dung dịch về pH4.
66
2. Nghiên cứu quy trình thu nhận G-CSF từ dạng tan trong tế bào chất
E. coli (phụ lục 3.2)
Ferritin đóng vai trò trung tâm trong việc dự trữ và duy trì sự cân bằng nội bào của ion sắt cho sự tăng trưởng và phát triển của hầu hết sinh vật, trong đó có con người. Ngoài ra, các chức năng của ferritin cho thấy đây là một protein bảo vệ tế bào chất nhờ khả năng ngăn cản sự hình thành các gốc oxygen tự do bằng cách cô lập Fe nội bào. Gần đây, Ahn JY và cộng sự (2005) đã phát hiện ra rằng ferritin chuỗi nặng của người (FTNH) khi được sử dụng như một protein dung hợp có tác dụng cải thiện tính tan của một số protein người biểu hiện trong E. coli. Các protein mục tiêu dung hợp với FTNH có hai đặc tính quan trọng là: (i) có tương tác ái lực cao và liên kết không cộng hóa trị với DnaK và (ii) FTNH có thể tự lắp ghép với nhau tạo ra một không gian gấp cuộn (folding chamber) cách ly protein mục tiêu với môi trường tế bào chất của E. coli giúp protein mục tiêu gấp cuộn tốt dưới sự hỗ trợ của DnaK.
Trên cơ sở đó dòng tế bào E. coli có khả năng biểu hiện protein dung hợp FTNH-GCSF dạng tan trong tế bào chất đã được cấu trúc và tiến hành lên men thành công. Nhằm thu nhận lượng lớn protein FTNH-GCSF tan trong tế bào chất, chúng tôi sử dụng máy tạo dịch đồng nhất tế bào kết hợp với ly tâm sau đó để xử lý dịch lên men chủng tái tổ hợp E. coli BL21(DE3)/pDnaK-pFHG ở quy mô 1 lít.
Các bước trong quy trình có thể được tóm tắt như sau:
Xử lý thu nhận pha tan của tế bào chất của dòng tái tổ hợp E. coli BL21(DE3)/pDnaK-pFHG
Lên men dòng tái tổ hợp E. coli BL21(DE3)/pDnaK-pFHG.
Phá màng tế bào bằng máy hệ thống máy phá tế bào. Sau đó ly tâm ở 4°C để thu phần dịch nổi. Phần dịch nổi thu được là pha tan của tế bào E. coli
67
Đánh giá và phân tích sự biểu hiện của protein FTNH-GCSF trong pha tan của tế bào chất
Tiến hành phân tích kết quả biểu hiện protein FTNH-GCSF bằng điện di SDS-PAGE và lai Western Blot.
Xác định lượng protein tổng trong pha tan bằng phương pháp Bradford. Sử dụng phần mềm Quantity One để phân tích tỉ lệ protein mục tiêu có trong mẫu.
Kết luận: Thu nhận thành công protein FTNH-GCSF từ dạng tan trong tế bào chất của chủng E. coli BL21(DE3)/pDnaK-pFHG với các thông số như sau:
Sinh khối khô (g/L) (X) 3,55 ± 0,12
Lượng protein tổng thu được trong các pha chứa G- CSF của 1L dịch lên men (g) (Y)