ngoại bào (phụ lục 1.5)
5.1. Nghiên cứu thiết kế vector tổng hợp và tiết G-CSF ở tế bào P. pastoris
và phân lập dòng (phụ lục 1.5.1)
Pichia pastoris là một trong những hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp phát triển mạnh mẽ nhất hiện nay, với hơn 460 loại protein đã được biểu hiện thành công, trong đó có rất nhiều loại có giá trị cao được sử dụng trong công nghiệp, nông nghiệp, y dược.
Hiện nay có ba loại chủng biểu hiện thường gặp của P. pastoris được phân biệt dựa trên khả năng biến dưỡng methanol tương ứng với số gene AOX
hoang dại còn lại trong bộ gene, ký hiệu Mut-, Muts, Mut+. Chủng Mut+
là chủng có khả năng phát triển tốt trên môi trường methanol tương tự chủng hoang dại trong tự nhiên, chủng Muts
là chủng phát triển chậm trên môi trường có methanol, còn chủng Mut-
là chủng không phát triển được trên môi trường có methanol. Trong số ba loại chủng này, căn cứ vào hiệu suất của đa số các mẻ lên men trong thực tế sản xuất, chủng P. pastoris GS115 - đại diện cho loại chủng Mut+
- được sử dụng phổ biến nhất do có sức sống tốt, hiệu suất lên men cao.
Nhìn chung cấu trúc cơ bản của plasmid biểu hiện protein tái tổ hợp ở P. pastoris bao gồm: promoter AOX - trong đó AOX1 được sử dụng phổ biến hơn cả, trình tự nhận biết của một hay nhiều enzyme cắt giới (multi cloning site – MCS), trình tự tín hiệu dừng phiên mã, và các gene marker.
Các plasmid thế hệ cũ được sử dụng cho P. pastoris thường là dòng plasmid pPIC (pPIC9K, pPIC3. 5K) chứa gene kháng kháng sinh kanamycine
39
ở vi khuẩn và kháng Geneticin G418 ở nấm men. Tuy nhiên quá trình sàng lọc thể biến nạp kháng G418 bắt buộc phải trải qua hai giai đoạn làm tăng kích thước plasmid từ đó gây khó khăn cho việc tạo dòng. Các plasmid thuộc thế hệ plasmid mới như dòng pPICZ có kích thước nhỏ hơn rất nhiều so với thế hệ cũ. Mỗi plasmid có kích thước khoảng 3. 3kb – bằng một nửa plasmid thế hệ trước.
Trên cơ sở trên chúng tôi quyết định chọn vector pPICZαA có chứa promoter AOX1 và gen marker Sh ble kháng zeocin giúp dễ dàng thao tác trong quá trình tạo plasmid tái tổ hợp dùng để biểu hiện G-CSF trong P. pastoris.
Nguyên vật liệu dùng trong thí nghiệm
- Chủng chủ E. coli DH5 được dùng để dòng hóa các gen và tạo các plasmid tái tổ hợp (Takara)
- Plasmid pZERO-GCSF nhận từ chuyên đề “Tạo dòng E. coli mang gen mã hoá G-CSF” có nguồn gốc từ plasmid pZERO-2 được chèn đoạn gen g- csfmY.
- Plasmid pPICZαA (Invitrogen) dùng để biểu hiện protein trong Pichia pastoris.
- Các mồi được dùng cho các phản ứng PCR khuẩn lạc và PCR plasmid là cặp mồi 5’AOX1 và 3’AOX1. Các mồi dùng cho phản ứng PCR kiểm tra chiều là cặp mồi 5’AOX1 và XhoGF-R.
Nội dung thực hiện bao gồm
- Thiết kế plasmid tái tổ hợp có mang đoạn gen g-csfmY được đặt tên là
pPICZ-GCSF: tách chiết plasmid từ chủng chủ E. coli có mang plasmid pZERO-GCSF, thực hiện phản ứng cắt giới hạn nhằm chuẩn bị DNA cho phản ứng nối trong tạo dòng và để kiểm tra các plasmid được chế tạo.
40
- Biến nạp pPICZ-GCSF vào E. coli DH5 khả nạp và chọn lọc các dòng dự tuyển.
- Kiểm tra dòng dự tuyển bằn PCR khuẩn lạc và PCR plasmid và PCR kiểm tra chiều.
- Lưu giữ các dòng đã kiểm tra và cho kết quả giải trình tự chính xác.
Kết luận: Thiết kế thành công vector pPICZ-GCSF dùng để biểu hiện G-CSF dạng tan, tiết ra môi trường ở P. pastoris. Phân lập được dòng tế bào E. coli
DH5α có chứa pPICZ-GCSF.
5.2. Nghiên cứu phân lập dòng P. pastoris biểu hiện G-CSF (phụ lục 1.5.2)
Trong P. pastoris, các gen ngoại lại quan tâm có thể sát nhập ở dạng bền với bộ gen nấm men thông qua sự tái tổ hợp tương đồng hay không tương đồng. Các gen được biểu hiện ở P. pastoris thường cho sự biểu hiện rất cao, đồng thời các protein có thể được biểu hiện ở hệ thống tiết để tiết ra ngoài môi trường giúp cho quá trình phân lập và tinh sạch được dễ dàng hơn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Với những ưu điểm như vậy, rõ ràng P. pastoris là một hệ thống lý tưởng, đáp ứng được các yêu cầu cần thiết cho việc sản xuất G-CSF với giá thành rẻ như: một hệ thống biểu hiện mạnh, có khả năng glycosyl hóa làm tăng tính bền của G-CSF, có khả năng sản xuất G-CSF ở dạng tiết ra ngoài môi trường giúp giảm chi phí sản xuất...
Nguyên vật liệu
- Chủng chủ E. coli DH5 được dùng lưu giữ plasmid pPICZ-GCSF (Takara).
- Chủng Pichia pastoris GS115 [his4], có kiểu hình Mut+
được sử dụng làm chủng chủ biểu hiện G-CSF.
41
- Plasmid pPICZ-GCSF có nguồn gốc từ plasmid pPICZA được chèn đoạn gen g-csfmY. Plasmid này được lưu giữ trong chủng E. coli DH5α/pPICZ- GCSF.
- Các mồi được dùng cho các phản ứng PCR khuẩn lạc là cặp mồi XhoGF- R và XhoGF-F. Các mồi dùng cho phản ứng PCR kiểm tra chiều là cặp mồi 5’AOX1 và 3’AOX1.
Quy trình thí nghiệm được tóm tắt như sau
- Tách chiết và kiểm tra plasmid từ chủng E. coli DH5α/pPICZ-GCSF. - Biến nạp pPICZ-GCSF vào P. pastoris khả nạp và chọn lọc các dòng dự tuyển.
- Kiểm tra dòng dự tuyển bằng PCR khuẩn lạc, PCR bộ gen được tách từ
P. pastoris và kiểm tra cấu hình.
- Cảm ứng biểu hiện G-CSF ở dạng tiết ra ngoài môi trường: Hoạt hóa tăng sinh chủng P. pastoris trong môi trường thích hợp và cảm ứng bằng methanol đạt nồng độ cuối 0,5%
- Kiểm tra protein G-CSF được biểu hiện bằng phương pháp điện di SDS- PAGE và Western Blot.
- Phân tích sự biểu hiện protein G-CSF bằng phần mềm Quantity One.
Kết luận:
- Đã tạo thành công dòng tế bào P. pastoris GS115/GCSF có khả năng biểu hiện G-CSF dạng tan, tiết ra môi trường ở P. pastoris.
- Đã biểu hiện thành công protein G-CSF ở dạng tiết ra môi trường từ chủng P. pastoris GS115/GCSF.
5.3. Nghiên cứu tổng hợp G-CSF bằng dòng P. pastoris (phụ lục 1.5.3)
G-CSF tự nhiên của người (G-CSF) tồn tại ở dạng glycoprotein, không có vị trí N-glycosyl hoá nhưng có một vị trí O-glycosyl hoá tại vị trí Thr133. Sự glycosyl hoá này giúp phân tử protein ổn định và bảo vệ nó khỏi sự kết
42
cụm ở pH trung tính, tuy nhiên sự glycosyl hóa không ảnh hưởng đến việc gắn vào thụ thể hay các hoạt tính của G-CSF trong in vitro.
Do vừa có chứa cầu nối disulfide, vừa có chứa 1 cysteine tự do, đồng thời G-CSF lại có cấu trúc phức tạp, có tính kỵ nước cao nên khi được biểu hiện trong tế bào chất E. coli, G-CSF thường được tạo ra ở dạng thể vùi, đòi hỏi quá trình tái gấp cuộn phức tạp về sau. Quá trình tái gấp cuộn này có hiệu suất rất thấp làm cho hiệu suất thu hồi của quá trình sản xuất giảm, đẩy giá thành sản xuất lên cao.
Hơn nữa với việc G-CSF được sản xuất ở E. coli không được glycosyl hóa nên độ ổn định giảm và protein dễ bị kết cụm. Do vậy khi sử dụng loại G- CSF này để điều trị thường phải sử dụng liên tục, trong một thời gian dài.
P. pastoris là một sinh vật dễ lên men, đây cũng là một thuận lợi của P. pastoris so với S. cerevisiae. Trong dịch lên men có mật độ tế bào cao, ethanol (sản phẩm của sự lên men bằng S. cerevisiae) nhanh chóng làm độc môi trường dẫn đến việc hạn chế sự phát triển cũng như sự tạo thành protein. Còn đối với P. pastoris, chúng có thể phát triển trong dịch lên men có mật độ tế bào rất cao (lên đến 500 OD600 U/ml).
Điều kiện phát triển của P. pastoris là lý tưởng cho sự sản xuất protein ở quy mô lớn, bởi vì các thành phần môi trường rẻ và đã được xác định, bao gồm: nguồn cacbon (glycerol, methanol), biotin, muối, các nhân tố vi lượng và nước. Môi trường này không có các thành phần chưa biết mà có thể chứa các có thể có độc tính, vì vậy nó thích hợp để sản xuất các dược phẩm ở người. Ngoài ra do P. pastoris được lên men trong môi trường có pH thấp và chứa methanol nên nó ít bị nhiễm bởi các vi sinh vật khác. Do vậy so với các hệ thống biểu hiện sinh vật nhân thật khác như baculovirus hay tế bào động vật thì hệ thống biểu hiện ở P. pastoris dễ dàng, nhanh chóng và rẻ tiền hơn.
Hiện đã có hơn 170 protein từ rất nhiều nguồn khác nhau đã được biểu hiện thành công ở Pichia pastoris, một vài trong số đó đã được sử dụng hay
43
đang đuợc kiểm tra thử nghiệm để đưa vào thương mại hóa cho các mục đích trị liệu ở người
Trên cơ sở kết quả đã tạo thành công chủng P. pastoris GS115/GCSF có mang gen g-csfmY dưới sự kiểm soát của promoter AOX1 nên có khả năng biểu hiện protein G-CSF khi được cảm ứng bởi methanol, chúng tôi tiến hành chuyên đề này nhằm khảo sát và kiểm chứng sự biểu hiện của protein G-CSF từ chủng P. pastoris GS115/GCSF. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nguyên vật liệu dùng trong thí nghiệm:
- Chủng Pichia pastoris GS115/GCSF có nguồn gốc là chủng P. pastoris
GS115 đã được chèn plasmid pPICZ-GCSF vào bộ gen, có khả năng biểu hiện G-CSF.
- Môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng, biểu hiện nhiều protein mục tiêu
Nội dung thí nghiệm như sau:
- Cảm ứng biểu hiện G-CSF ở dạng tiết ra ngoài môi trường: Hoạt hóa tăng sinh chủng P. pastoris trong môi trường thích hợp và cảm ứng bằng methanol đạt nồng độ cuối 0,5%
- Kiểm tra protein G-CSF được biểu hiện bằng phương pháp điện di SDS- PAGE và Western Blot.
- Phân tích sự biểu hiện protein G-CSF bằng phần mềm Quantity One
- Lưu giữ các dòng đã kiểm tra.
Kết luận: Đã biểu hiện thành công protein G-CSF ở dạng tiết ra môi trường từ chủng P. pastoris GS115/GCSF.
44
Hình 14. Kết quả kiểm chứng sự biểu hiện protein G-CSF của chủng P. pastoris GS115/GCSF bằng lai Western blot với kháng thể kháng G-CSF.
A, Bản gel SDS-PAGE; B, Bản phim westen blot. 1, Thang phân tử lượng protein; 2, G-CSF chuẩn; 3, Dịch lên men GS115 cảm ứng methanol; 4, Dịch
lên men GS115/pPICZαA cảm ứng methanol; 5, Dịch lên men GS115/GCSF cảm ứng methanol
45
Chƣơng III.
Nghiên cứu quy trình lên men chủng tái tổ hợp tổng hợp G-CSF ở quy mô 50L
Trong nội dung nghiên cứu này chúng tôi thực hiện các chuyên mục sau:
- Nghiên cứu điều kiện lên men có kiểm soát dòng E. coli tái tổ hợp và cảm ứng tổng hợp G-CSF dạng thể vùi trong tế bào chất.
- Nghiên cứu điều kiện lên men có kiểm soát dòng E. coli tái tổ hợp và cảm ứng tổng hợp G-CSF dạng tan trong tế bào chất.
- Nghiên cứu điều kiện lên men có kiểm soát dòng E. coli tái tổ hợp và cảm ứng tổng hợp G-CSF dạng tan trong chu chất.
- Nghiên cứu điều kiện lên men có kiểm soát dòng nấm men P. pastoris tái tổ hợp và cảm ứng tổng hợp và tiết G-CSF ngoại bào.
- Nghiên cứu công nghệ lên men dòng vi sinh vật tái tổ hợp và cảm ứng tổng hợp G-CSF ở quy mô 50 lít.
- Khảo sát phương thức thu sinh khối tế bào.
- Khảo sát phương thức phá tế bào.
1. Nghiên cứu lên men dòng E. coli tái tổ hợp và cảm ứng tổng hợp G-CSF ở dạng thể vùi trong tế bào chất bằng Jar fermentor ở quy mô 1L