(Phụ lục 2.1)
Có hai phương pháp lên men được dùng phổ biến đó là phương pháp lên men mẻ và mẻ có bổ sung cơ chất (còn gọi là fed-batch):
Phương pháp lên men mẻ: Đây là hệ thống nuôi cấy khép kín, giới hạn về dinh dưỡng, nghĩa là cơ chất dinh dưỡng không được bổ sung trong quá trình lên men. Nuôi cấy mẻ là phương pháp đơn giản nhất để sản xuất protein tái tổ hợp. Vi sinh vật nuôi cấy sẽ trải qua bốn pha khác nhau: pha lag - bắt đầu từ lúc cấy vi sinh vật vào môi trường cho đến khi nó bắt đầu phân chia, pha log - ở cuối pha lag, các tế bào đã thích nghi với môi trường phát triển, do vậy trong pha này vi sinh vật tăng trưởng nhanh dần và đạt đến tốc độ tối đa, pha ổn
46
định - ở pha này, cơ chất nhanh chóng được tiêu thụ và các chất gây độc cho tế bào cũng được hình thành làm cho sự phát triển chậm lại hoặc hoàn toàn dừng hẳn, sinh khối trong giai đoạn này chỉ tăng từ từ hoặc giữ ở mức không đổi, pha suy tàn - trong pha này, nguồn dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy gần như cạn kiệt, mật độ tế bào vi sinh vật bị giảm nhanh chóng do sự tích lũy các loại chất độc hoặc do quá trình tự phân bởi chính enzyme của chủng.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi áp dụng phương pháp lên men mẻ để gia tăng mật độ tế bào và cảm ứng tổng hợp G-CSF dạng thể vùi trong tế bào chất, quy trình được tóm tắt bằng sơ đồ như sau:
Hệ thống lên men, môi trường lên men được thanh trùng ở 1210
C, 20 phút trước khi tiến hành lên men.
Sau khi kết thúc quá trình lên men, tiến hành ly tâm thu nhận sinh khối, phá tế bào, dựng đường cong tăng trưởng, kiểm tra và xác nhận sự biểu hiện G-CSF bằng điện di SDS-PAGE và lai Western Blot, xác định phần trăm protein G-CSF trong protein tổng số của tế bào bằng phần mềm Quantity One.
Chủng E. coli BL21(DE3)/pET-GCSF Hoạt hóa cấp 1 5 ml môi trường LB Hoạt hóa cấp 2 50 ml môi trường cấp 2 Lên men
1 lít môi trường lên men với tỉ lệ nạp giống 1:20
300 vòng/phút, 1 vvm, 370C, 24 giờ, pH 7.0,
Thu mẫu qua các giờ nuôi cấy Cấy 1 khuẩn lạc đơn từ đĩa chủng 250 vòng/phút, 370C, amppiciline 100 µg/ml, qua đêm 250vòng/phút, 370C, 6-8 giờ
47
Sinh khối khô (g/L) (X) 9,22 ± 0,45
Lượng protein tổng thu được trong các pha chứa G- CSF của 1L dịch lên men (g) (Y)
3,655 ± 0,18
% G-CSF trên protein tổng (Z) 50,1 ± 0,78
Lượng G-CSF (g/L) (T) 1,831 ± 0,09
Hiệu quả thu nhận G-CSF (%) 19,86 ± 0,005
Kết luận: Lên men thành công dòng tế bào E. coli BL21(DE3)/pET-GCSF có khả năng sản xuất vượt mức G-CSF dạng thể vùi.
2. Nghiên cứu lên men dòng E. coli tái tổ hợp và cảm ứng tổng hợp G-CSF ở dạng tan trong tế bào chất bằng Jar fermentor ở quy mô 1 lít (Phụ CSF ở dạng tan trong tế bào chất bằng Jar fermentor ở quy mô 1 lít (Phụ lục 2.2)
Nhằm thu nhận lượng lớn protein FTNH-GCSF tan trong tế bào chất, chúng tôi thử nghiệm mô hình lên men chủng tái tổ hợp E. coli
BL21(DE3)/pDnaK-pFHG ở quy mô 1 lít. Trước đó, chủng này đã được chứng minh có khả năng biểu hiện protein G-CSF dạng dung hợp với FTNH
48
có thể tan trong tế bào chất với sự hỗ trợ của chaperone DnaK (đồng biểu hiện).
Để đánh giá khả năng tăng trưởng và mức độ biểu hiện FTNH-GCSF của chủng khi nuôi cấy trên môi trường, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nuôi cấy mẻ chủng E. coli BL21(DE3)/pDnaK-pFHG trên môi trường bằng hệ thống lên men tự động BioTron-LiFlus GX GX-05-12302.
Lên men chủng E. coli BL21(DE3)/pDnaK-pFHG để sản xuất protein FTNH-GCSF được thực hiện theo quy trình gồm nhiều bước như sau:
Bình lên men (chứa môi trường và giống), các sensor pH, DO, nhiệt độ, antifoAm, động cơ khuấy đã được kết nối với CPU thông qua các cáp nối, tiến hành cài đặt các giá trị pH, nhiệt độ, DO và tốc độ khuấy cho quá trình nuôi cấy sản xuất E. coli biểu hiện G-CSF như sau: pH=7,00, DO=30%, nhiệt độ
49
370C, tốc độ khuấy: 75 vòng/phút, tốc độ sục khí: 0.5 vvm, bổ sung kanamycine và ampicilline với nồng độ cuối lần lượt là 40µg/ml và 100µg/ml.
Tiến hành thu dịch nuôi cấy và xác định OD600 của dịch nuôi cấy ở thời điểm bắt đầu lên men (lúc 0 giờ). Trong quá trình lên men, cứ cách 1-2 giờ tiến hành thu mẫu đo OD600 và xác định giá trị DCW để khảo sát động học tăng trưởng của chủng. Sau đó đem dịch nuôi cấy ly tâm thu sinh khối để phân tích protein bằng phương pháp SDS-PAGE nhằm kiểm tra sự biểu hiện, và xác nhận lại bằng phương pháp lai Western Blot. Đồng thời dịch nuôi cấy thu được ở thời điểm 24 giờ sau cảm ứng được đem đi phân tích xác định các chỉ số về khối lượng tươi và khối lượng khô (DCW) sau khi kết thúc quá trình lên men.
Sinh khối khô (g/L) (X) 3,55 ± 0,12
Lượng protein tổng thu được trong các pha chứa G- CSF của 1L dịch lên men (g) (Y)
50
% G-CSF trên protein tổng (Z) 33,1 ± 0,37
Lượng G-CSF (g/L) (T) 0,289 ± 0,01
Hiệu quả thu nhận G-CSF (%) 8,17 ± 0,68
Kết luận: Lên men thành công dòng tế bào E. coli BL21(DE3)/pDnaK-pFHG có khả năng sản xuất vượt mức FTNH-GCSF dạng tan trong tế bào chất.
3. Nghiên cứu lên men dòng E. coli tái tổ hợp và cảm ứng tổng hợp G-CSF ở dạng tan trong chu chất bằng Jar fermentor ở quy mô 1 lít (Phụ CSF ở dạng tan trong chu chất bằng Jar fermentor ở quy mô 1 lít (Phụ lục 2.3)
Nhằm tránh bước làm tan protein thể vùi bằng tác chất biến tính mạnh, sau đó phải thực hiện bước tái gấp cuộn để thu được G-CSF có cấu hình tự nhiên có hoạt tính, một phương án khác để sản xuất G-CSF tái tổ hợp trong E. coli là tổng hợp G-CSF dạng tan trong chu chất. Chúng tôi đã tạo được dòng tái tổ hợp E. coli BL21(DE3)/pET28b-GCSF đã được chứng minh là có khả năng tổng hợp G-CSF dạng tan trong chu chất. Để thu được lượng lớn protein G-CSF ở dạng tan trong chu chất, chúng tôi tiến hành lên men chủng tái tổ hợp trên ở quy mô 1 lít bằng Jar Fermentor.
Hệ thống lên men, môi trường, đầu dò pH, DO được mang đi thanh trùng ở 1210C, 20 phút. Các thông số được thiết lập như sau: pH=7,00, DO=30%, nhiệt độ 370C, tốc độ khuấy: 100 vòng/phút, tốc độ sục khí: 0.5 vvm, cách 1-2 giờ tiến hành thu mẫu đo OD600 và xác định giá trị DCW để khảo sát động học tăng trưởng của chủng.
Sau quá trình lên men, tiến hành ly tâm thu sinh khối, phá tế bào bằng phương pháp sốc thẩm thấu nhằm tách các phân đoạn protein trong tế bào E. coli (bao gồm phân đoạn protein chu chất, phân đoạn proten tế bào chất, phân đoạn protein tổng số), kiểm tra và xác nhận sự biểu hiện protein mục tiêu bằng điện di SDS-PAGE và lai Western Blot.
51
Sinh khối khô (g/L) (X) 6,37 ± 0,30
Lượng protein tổng thu được trong các pha chứa G- CSF của 1L dịch lên men (g) (Y)
1,434 ± 0,22
% G-CSF trên protein tổng (Z) 11,0 ± 0,46
Lượng G-CSF (g/L) (T) 0,158 ± 0,02
Hiệu quả thu nhận G-CSF (%) 2,50 ± 0,49
Kết luận: Lên men thành công dòng tế bào E. coli BL21(DE3)/pET28b- GCSFcó khả năng sản xuất vượt G-CSF dạng tan trong chu chất.
4. Nghiên cứu lên men dòng nấm men P. pastoris tái tổ hợp và cảm ứng tổng hợp G-CSF bằng Jar fermentor ở quy mô 1L(phụ lục 2.4)