Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp phục vụ điều trị bệnh đái tháo đường

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI………………IPHẦN I. MỞ ĐẦU……………………………………………………..11. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC CỦA ĐỀ TÀI .......................................................................... 21.1. Tình hình bệnh ĐTĐ trên thế giới ....................................................... 21.2. Tình hình bệnh ĐTĐ ở Việt Nam ........................................................ 31.3. Thuốc điều trị bệnh ĐTĐ ..................................................................... 41.4. Cấu trúc, sự hình thành và tác dụng của insulin .................................. 51.5. Sản xuất insulin điều trị bệnh ĐTĐ ..................................................... 72. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI ........................................................................ 123. LUẬN GIẢI VỀ VIỆC ĐẶT RA MỤC TIÊU VÀ NHỮNG NỘI DUNG CẦN NGHIÊN CỨU ........................................... 143.1. Tạo dòng biểu hiện mini-proinsulin ................................................... 143.2. Nghiên cứu công nghệ lên men, thu sinh khối và đồng nhất sinh khối E. coli iitái tổ hợp quy mô 100 lít dịch lên men .............................................. 183.3. Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có hoạt tính từ MPI ............................................................................ 193.4. Nghiên cứu công nghệ tinh chếinsulin người tái tổ hợp ...................................................................... 223.5. Thử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp ............................................. 233.6. Nghiên cứu đặc tính và kiểm soát chất lượng insulin tái tổ hợp .............................................................. 233.7. Bước đầu nghiên cứu hiệu quả chế phẩm insulin điều trị ĐTĐthực nghiệm trên mô hình chuột ......................................................... 24PHẦN II. NỘI DUNG KHOA HỌC CÔNG NGHỆĐÃ THỰC HIỆN…………………………………………...25CHƯƠNG 1. TẠO DÕNG BIỂU HIỆN MINI-PROINSULIN ................ 261.1. Tạo dòng mang gen mã hóa MPI ....................................................... 261.2. Tạo dòng E. coli biểu hiện MPI dạng thể vùi trong tế bào chất ........................................................... 671.2A. Tạo dòng E. coli biểu hiện 6xHis-MPI dạng thể vùi trong tế bào chất ................................................. 701.2B. Tạo dòng E. coli biểu hiện 10xHis-MPI dạng thể vùi trong tế bào chất ................................................. 921.3. Tạo dòng E. coli biểu hiện MPI dạng tan trong tế bào chất .............................................................................. 1151.4. Tạo dòng E. coli biểu hiện MPI dạng tan trong chu chất .................................................................................. 150iiiCHƯƠNG 2. NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ LÊN MEN, THUSINH KHỐI, ĐỒNG NHẤT SINH KHỐI E. coliTÁI TỔ HỢP QUY MÔ 100 LÍT DỊCH LÊN MEN ....... 1842.1. Nghiên cứu công nghệ lên men và cảm ứngtổng hợp MPI ................................................................................... 1852.2. Khảo sát phương thức thu sinh khối tế bào (Quy mô 1 lít – 100 lít lên men) ...................................................... 2742.3. Khảo sát phương thức phá tế bào tạo dịch đồng nhất hoặc phân đoạn chu chất ................................................. 289CHƯƠNG 3. NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ TẠO INSULIN CÓ HOẠT TÍNH TỪ MPI ................................ 3073.1. Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có hoạt tính từ MPI dạng thể vùi .......................................................... 3093.1A. Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có hoạt tính từ 6xHis-MPI dạng thể vùi ................................... 3163.1B. Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có hoạt tính từ 10xHis-MPI dạng thể vùi ................................. 3373.2. Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có hoạt tính từ 6xHis-FTNh-MPI dạng tan .......................................... 3623.3. Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có hoạt tính từ DsbA-6xHis-MPI dạng tan ........................................... 375CHƯƠNG 4. NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ TINH CHẾMPI TÁI TỔ HỢP ............................................................... 3874.1. Công nghệ tinh chế insulin tái tổ hợp từ6xHis-MPI quy mô phòng thí nghiệm ............................................. 387 iv4.2. Công nghệ tinh chế insulin tái tổ hợp từ6xHis-MPI quy mô pilot .................................................................. 4074.3. Công nghệ tinh chế insulin tái tổ hợp từ10xHis-MPI quy mô phòng thí nghiệm ........................................... 4204.4. Công nghệ tinh chế insulin tái tổ hợp từ10xHis-MPI quy mô pilot ................................................................ 426CHƯƠNG 5. THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH INSULIN TÁI TỔ HỢP .............................................................................. 4325.1. Giới thiệu chung ............................................................................... 4325.2. Nội dung thực hiện ........................................................................... 4355.3. Vật liệu và phương pháp .................................................................. 4355.4. Kết quả và biện luận ......................................................................... 4365.5. Kết luận ............................................................................................ 441CHƯƠNG 6. NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH VÀ KIỂM SOÁTCHẤT LƯỢNG INSULIN TÁI TỔ HỢP ............................. 4426.1. Xác định trình tự axít amin của MPI và insulin bằng phương pháp khối phổ MS/MS, TOFMS ........................................................ 4426.2. Xác định cấu hình lập thể của MPI và insulinbằng ELISA và phương pháp phổ CD ...................................... 4546.3. Xác định hàm lượng insulin so với insulin chuẩn bằng HPLC và RP-HPLC .............................................. 4616.4. Xác định hoạt tính riêng của insulin theo Dược điển Hoa Kỳ USP ........................................................... 473 v6.5. Xác định dư lượng của nội độc tốvi khuẩn bằng phương pháp LAL ............................................ 4816.6. Thử nghiệm tính an toàn trên chuột ......................................... 4896.7. Đánh giá chất lượng insulin theo tiêu chuẩn quốc tế .................................................................... 495CHƯƠNG 7. BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ CHẾ PHẨMINSULIN ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNGTHỰC NHGIỆM TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT……………5147.1. Nghiên cứu tạo mô hình thực nghiệm chuột bị đái tháo đường……………………………………………...5147.2. Nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính làm giảm đường huyết củainsulin trên mô hình chuột bị ĐTĐ thực nghiệm…………………….5217.3. Đánh giá tồn lưu hoạt tính của chế phẩm insulin theo thời gian……..531PHẦN III. CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC, KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................... 539TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................... 548PHỤ LỤC .................................................................................................... 565PHỤ LỤC 1. Vật liệu và phương pháp sử dụng cho quy trình tạo dòng biểu hiện mini-proinsulin ......................... 566PHỤ LỤC 2. Vật liệu và phương pháp sử dụng trong nghiên cứu công nghệ lên men, thu sinhkhối và đồng nhất sinh khối E. coli tái tổ hợp quy mô 100 lít dịch lên men ................................... 594 viPHỤ LỤC 3. Vật liệu và phương pháp sử dụng cho quy trình công nghệ tạo insulin có hoạt tính từ MPI ..................... 629PHỤ LỤC 4. Vật liệu và phương pháp sử dụng cho quy trình tinh chế insulin tái tổ hợp từ MPI .................................. 642PHỤ LỤC 5. Vật liệu và phương pháp sử dụng trongthử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp ................................... 649PHỤ LỤC 6. Vật liệu và phương pháp sử dụng trongnghiên cứu đặc tính và kiểm soát chất lượng insulin tái tổ hợp ................................................... 653PHỤ LỤC 7. Vật liệu và phương pháp sử dụng trongnghiên cứu hiệu quả chế phẩm insulin nguyên liệu điều trị bệnh ĐTĐ ............................................... 655PHỤ LỤC 8. Dược điển Anh ........................................................................ 657DANH MỤC SẢN PHẨM DẠNG 2 (Tập tài liệu đính kèm). DANH MỤC SẢN PHẨM DẠNG 3 (Tập tài liệu đính kèm).KẾT QUẢ ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC (Tập tài liệu đính kèm).viiQUY TRÌNH TỔNG QUÁT SẢN XUẤT INSULIN

Trang 1

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐH QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC.04/06-10

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI/DỰ ÁN

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HỢP PHỤC VỤ ĐIỀU

Trang 2

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐH QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC.04/06-10

BÁO CÁO TỔNG HỢP

KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI/DỰ ÁN

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HỢP PHỤC VỤ ĐIỀU TRỊ

Trang 3

i

MỤC LỤC

Trang

Mục lục……… i

Quy trình tổng quát sản xuất insulin…… ……….vii

Danh mục hình……… xii

Danh mục bảng……… xxxi

Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt……… .xxxvi

Danh mục chủng E coli đã sử dụng……… xxxix

Danh mục vector đã sử dụng……… xlii BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI………I PHẦN I MỞ ĐẦU……… 1

1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC CỦA ĐỀ TÀI 2

1.1 Tình hình bệnh ĐTĐ trên thế giới 2

1.2 Tình hình bệnh ĐTĐ ở Việt Nam 3

1.3 Thuốc điều trị bệnh ĐTĐ 4

1.4 Cấu trúc, sự hình thành và tác dụng của insulin 5

1.5 Sản xuất insulin điều trị bệnh ĐTĐ 7

2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 12

3 LUẬN GIẢI VỀ VIỆC ĐẶT RA MỤC TIÊU VÀ NHỮNG NỘI DUNG CẦN NGHIÊN CỨU 14

3.1 Tạo dòng biểu hiện mini-proinsulin 14 3.2 Nghiên cứu công nghệ lên men, thu

sinh khối và đồng nhất sinh khối E coli

Trang 4

ii

tái tổ hợp quy mô 100 lít dịch lên men 18 3.3 Nghiên cứu công nghệ tạo insulin

có hoạt tính từ MPI 19 3.4 Nghiên cứu công nghệ tinh chế

insulin người tái tổ hợp 22 3.5 Thử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp 23 3.6 Nghiên cứu đặc tính và kiểm soát

chất lượng insulin tái tổ hợp 23 3.7 Bước đầu nghiên cứu hiệu quả chế phẩm insulin điều trị ĐTĐ

thực nghiệm trên mô hình chuột 24

PHẦN II NỘI DUNG KHOA HỌC CÔNG NGHỆ

ĐÃ THỰC HIỆN……… 25 CHƯƠNG 1 TẠO DÕNG BIỂU HIỆN MINI-PROINSULIN 26

1.1 Tạo dòng mang gen mã hóa MPI 26

1.2 Tạo dòng E coli biểu hiện MPI

dạng thể vùi trong tế bào chất 67

1.2A Tạo dòng E coli biểu hiện 6xHis-MPI

1.2B Tạo dòng E coli biểu hiện 10xHis-MPI

1.3 Tạo dòng E coli biểu hiện MPI dạng tan

trong tế bào chất 115

1.4 Tạo dòng E coli biểu hiện MPI dạng tan

trong chu chất 150

Trang 5

iii

CHƯƠNG 2 NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ LÊN MEN, THU

SINH KHỐI, ĐỒNG NHẤT SINH KHỐI E coli

TÁI TỔ HỢP QUY MÔ 100 LÍT DỊCH LÊN MEN 184

2.1 Nghiên cứu công nghệ lên men và cảm ứng

tổng hợp MPI 185 2.2 Khảo sát phương thức thu sinh khối tế bào

(Quy mô 1 lít – 100 lít lên men) 274 2.3 Khảo sát phương thức phá tế bào tạo dịch

đồng nhất hoặc phân đoạn chu chất 289

CHƯƠNG 3 NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ TẠO

INSULIN CÓ HOẠT TÍNH TỪ MPI 307

3.1 Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có

hoạt tính từ MPI dạng thể vùi 309 3.1A Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có

hoạt tính từ 6xHis-MPI dạng thể vùi 316 3.1B Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có

hoạt tính từ 10xHis-MPI dạng thể vùi 337 3.2 Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có

hoạt tính từ 6xHis-FTNh-MPI dạng tan 362 3.3 Nghiên cứu công nghệ tạo insulin có

hoạt tính từ DsbA-6xHis-MPI dạng tan 375

CHƯƠNG 4 NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ TINH CHẾ

MPI TÁI TỔ HỢP 387

4.1 Công nghệ tinh chế insulin tái tổ hợp từ

6xHis-MPI quy mô phòng thí nghiệm 387

Trang 6

iv

4.2 Công nghệ tinh chế insulin tái tổ hợp từ

6xHis-MPI quy mô pilot 407

4.3 Công nghệ tinh chế insulin tái tổ hợp từ 10xHis-MPI quy mô phòng thí nghiệm 420

4.4 Công nghệ tinh chế insulin tái tổ hợp từ 10xHis-MPI quy mô pilot 426

CHƯƠNG 5 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH INSULIN TÁI TỔ HỢP 432

5.1 Giới thiệu chung 432

5.2 Nội dung thực hiện 435

5.3 Vật liệu và phương pháp 435

5.4 Kết quả và biện luận 436

5.5 Kết luận 441

CHƯƠNG 6 NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH VÀ KIỂM SOÁT CHẤT LƯỢNG INSULIN TÁI TỔ HỢP 442

6.1 Xác định trình tự axít amin của MPI và insulin bằng phương pháp khối phổ MS/MS, TOFMS 442

6.2 Xác định cấu hình lập thể của MPI và insulin bằng ELISA và phương pháp phổ CD 454

6.3 Xác định hàm lượng insulin so với insulin chuẩn bằng HPLC và RP-HPLC 461

6.4 Xác định hoạt tính riêng của insulin theo Dược điển Hoa Kỳ USP 473

Trang 7

v

6.5 Xác định dư lượng của nội độc tố

vi khuẩn bằng phương pháp LAL 481 6.6 Thử nghiệm tính an toàn trên chuột 489 6.7 Đánh giá chất lượng insulin theo

tiêu chuẩn quốc tế 495

CHƯƠNG 7 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ CHẾ PHẨM

INSULIN ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG THỰC NHGIỆM TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT………514

7.1 Nghiên cứu tạo mô hình thực nghiệm

chuột bị đái tháo đường……… 514 7.2 Nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính làm giảm đường huyết của

insulin trên mô hình chuột bị ĐTĐ thực nghiệm……….521 7.3 Đánh giá tồn lưu hoạt tính của chế phẩm insulin theo thời gian…… 531

PHẦN III CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC, KẾT LUẬN

VÀ KIẾN NGHỊ 539 TÀI LIỆU THAM KHẢO 548

PHỤ LỤC 565

PHỤ LỤC 1 Vật liệu và phương pháp sử dụng cho

quy trình tạo dòng biểu hiện mini-proinsulin 566 PHỤ LỤC 2 Vật liệu và phương pháp sử dụng trong

nghiên cứu công nghệ lên men, thu sinh

khối và đồng nhất sinh khối E coli

tái tổ hợp quy mô 100 lít dịch lên men 594

Trang 8

vi

PHỤ LỤC 3 Vật liệu và phương pháp sử dụng cho quy

trình công nghệ tạo insulin có hoạt tính từ MPI 629 PHỤ LỤC 4 Vật liệu và phương pháp sử dụng cho quy

trình tinh chế insulin tái tổ hợp từ MPI 642 PHỤ LỤC 5 Vật liệu và phương pháp sử dụng trong

thử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp 649 PHỤ LỤC 6 Vật liệu và phương pháp sử dụng trong

nghiên cứu đặc tính và kiểm soát chất lượng insulin tái tổ hợp 653 PHỤ LỤC 7 Vật liệu và phương pháp sử dụng trong

nghiên cứu hiệu quả chế phẩm insulin nguyên liệu điều trị bệnh ĐTĐ 655 PHỤ LỤC 8 Dược điển Anh 657

DANH MỤC SẢN PHẨM DẠNG 2 (Tập tài liệu đính kèm)

DANH MỤC SẢN PHẨM DẠNG 3 (Tập tài liệu đính kèm)

KẾT QUẢ ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC (Tập tài liệu đính kèm).

Trang 9

vii

QUY TRÌNH TỔNG QUÁT SẢN XUẤT INSULIN

Trang 10

viii

Trang 11

ix

Trang 12

x

Trang 13

xi

Trang 14

TEV protease 17

Hình 6 Sơ đồ dung hợp MPI và FTNh với vị trí cắt trypsin

giữa FTNh và MPI 18

Hình 7 Sơ đồ công nghệ sau lên men để thu nhân insulin

có hoạt tính từ 3 loại MPI khác nhau 22

PHẨN 2 NỘI DUNG KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐÃ THỰC

HIỆN

Hình 1.1.1 Bảng mã di truyền và tần số sử dụng 28 Hình 1.1.2 Sơ đồ tổng hợp gen bằng phương pháp PCR tái tổ hợp 34 Hình 1.1.3 Sơ đồ các bước thiết kế gen mã hóa MPI thay đổi codon 43 Hình 1.1.4 Giao diện trang web của ngân hàng gen NCBI

xuất mã số trình tự gen mã hóa insulin người 44

Hình 1.1.5 Sơ đồ các bước tổng hợp đoạn DNA

mang gen mã hóa MPI bằng PCR tái tổ hợp 45

Hình 1.1.6 Sơ đồ cấu trúc chủng E coli DH5α mang plasmid pBIns 48

Trang 15

xiii

Hình 1.1.7 Chương trình chạy PCR tổng hợp gen mã hóa MPI 49

Hình 1.1.8 Trình tự nucleotide của gen mã hóa insulin người 52

Hình 1.1.9 Trình tự nucleotide và axít amin của proinsulin người 53

Hình 1.1.10 Codon đã được tối ưu hóa bằng phần mềm GeneDesigner 54

Hình 1.1.11 Sự tương đồng giữa gen mã hóa MPI và gen mã hóa proinsulin người 55

Hình 1.1.12 Độ phù hợp tương đối của các codon của gen mã hóa MPI 55

Hình 1.1.13 Tần số sử dụng của các codon của gen mã hóa MPI 56

Hình 1.1.14 Trình tự đoạn DNA chứa gen mã hóa MPI 57

Hình 1.1.15 Vị trí và chiều dài của 4 oligonucleotide được phân đoạn từ đoạn DNA mang gen mã hóa MPI 58

Hình 1.1.16 Giao diện của OligoCalc xuất các thông số của hai oligonucleotide Ins1F/Ins2 60

Hình 1.1.17 Giao diện của OligoCalc xuất các thông số của hai oligonucleotide Ins3F/Ins4R 60

Hình 1.1.18 Giao diện của OligoCalc xuất các thông số của sản phẩm PCR1 61

Hình 1.1.19 Đoạn DNA mang gen mã hóa MPI được tổng hợp bằng phương pháp PCR tái tổ hợp 62

Hình 1.1.20 Kết quả điện di sản phẩm PCR được khuếch đại bởi cặp mồi Ins1F/Ins4R 63

Hình 1.1.21 Kết quả biến nạp hỗn hợp sản phẩm nối pBluescript và đoạn DNA mang gen mpi vào tế bào E coli DH5α 64

Hình 1.1.22 Kết quả phân tích sản phẩm cắt của plasmid pBIns bằng NcoI và XhoI trên gel agarose 1% 65

Hình 1.1.23 Kết quả giải trình tự plasmid pBIns và so sánh mức độ tương đồng với trình tự lý thuyết 66

Trang 16

xiv

Hình 1.2.1 Sơ đồ thiết kế cấu trúc biểu hiện đoạn DNA mang

gen 6xhis-mpi trên plasmid pET43Ins và sản phẩm

biểu hiện 6xHis-MPI 68

Hình 1.2.2 Sơ đồ thiết kế cấu trúc biểu hiện đoạn DNA

mang gen 10xhis-mpi trên plasmid pHTI

và sản phẩm biểu hiện 10xHis-MPI 69

Hình 1.2.3 Sơ đồ dòng hóa gen 6xhis-mpi vào plasmid

pET43.1a tạo plasmid pET43Ins 73

Hình 1.2.4 Chương trình cài đặt máy điều nhiệt

cho phản ứng PCR khuẩn lạc 75

Hình 1.2.5 Các bước tạo dòng E coli BL21(DE3)/pET43Ins

biểu hiện 6xHis-MPI ở dạng thể vùi 76

Hình 1.2.6 Kết quả biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E coli DH5α 80 Hình 1.2.7 Kết quả sàng lọc dòng tế bào E coli DH5α

mang plasmid tái tổ hợp bằng PCR khuẩn lạc với cặp mồi Ins1F/Ins4R 82

Hình 1.2.8 Kết quả chọn lọc dòng E coli DH5 mang

plasmid pET43Ins bằng phương pháp cắt giới hạn 82

Hình 1.2.9 Kết quả so sánh trình tự gen 6xhis-mpi

trên pET43Ins và pBIns 83

Hình 1.2.10 Kết quả tách chiết và kiểm tra vector pET43Ins 85 Hình 1.2.11 Kết quả biến nạp vector pET43Ins vào chủng

E coli BL21(DE3) trên môi trường LB-Amp100 86

Hình 1.2.12 Kiểm tra vector pET43Ins thu nhận

từ dòng E coli BL21(DE3)/pET43Ins 88

Hình 1.2.13 Kết quả phân tích sự biểu hiện 6xHis-MPI 90 Hình 1.2.14 Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện protein

6xHis-MPI bằng phần mềm Quantity-One 91

Trang 17

xv

Hình 1.2.15 Sơ đồ dòng hóa gen 10xhis-mpi vào

plasmid pET43.1a tạo plasmid pHTI 95

Hình 1.2.16 Điều kiện phản ứng PCR khuếch đại gen mpi từ pBIns 96 Hình 1.2.17 Chương trình cài đặt máy điều nhiệt

cho phản ứng PCR khuẩn lạc 98

Hình 1.2.18 Các bước tạo dòng E coli BL21(DE3)/pHTI

biểu hiện 10xHis-MPI ở dạng thể vùi 99

Hình 1.2.19 Phân tích điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gene

10xhis-mpi bằng cặp mồi HTI-F/HTI-R từ pBIns 103

Hình 1.2.20 Kết quả biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E coli DH5α 104 Hình 1.2.21 Kết quả sàng lọc dòng E coli DH5α mang

plasmid tái tổ hợp pHTI bằng PCR

khuẩn lạc với cặp mồi HTI-F/HTI-R 105

Hình 1.2.22 Kết quả chọn lọc dòng E coli DH5α mang plasmid

pHTI dự tuyển bằng phương pháp cắt giới hạn 106

Hình 1.2.23 Kết quả giải trình tự pHTI và so sánh với lý thuyết về

độ tương đồng với gen mpi 107

Hình 1.2.24 Kết quả tách chiết và kiểm tra vector pHTI 109 Hình 1.2.25 Kết quả biến nạp vector pHTI vào chủng E coli

BL21(DE3) trên môi trường LB-Amp100 110

Hình 1.2.26 Kiểm tra vector pHTI thu nhận từ

dòng E coli BL21(DE3)/pHTI 112

Hình 1.2.27 Kết quả phân tích sự biểu hiện 10xHis-MPI 114 Hình 1.2.28 Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện protein

10xHis-MPI bằng phần mềm Quantity-One 115

Hình 1.3.1 Sự hình thành siêu phân tử của protein ngoại lai

dưới tác dụng của phần dung hợp FTNh 118

Hình 1.3.2 Mô hình phễu gấp cuộn 119

Trang 18

xvi

Hình 1.3.3 Vòng đời của các protein trong tế bào 120 Hình 1.3.4 Mô hình minh họa chu trình ATPase của DnaK 121 Hình 1.3.5 Sơ đồ thiết kế cấu trúc biểu hiện đoạn DNA mang gen

6xhis-ftn h -mpi trên plasmid pET-FI và sản phẩm

biểu hiện 6xHis-FTNh-MPI 123

Hình 1.3.6 Sơ đồ dòng hóa gen ftn h và mpi vào plasmid pET28a

tạo plasmid pET-FI 127

Hình 1.3.7 Sơ đồ dòng hóa gen dnak vào plasmid pET-43.1a

tạo plasmid p43DnaK 128

Hình 1.3.8 Chương trình cài đặt máy luân nhiệt cho phản ứng PCR

khuếch đại gen mpi, dnak và ftn h 130

Hình 1.3.9 Sơ đồ cấu trúc chủng E coli BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK

biểu hiện protein dung hợp 6xHis-FTNh-MPI

dạng tan trong tế bào chất 131

Hình 1.3.10 Chương trình cài đặt máy điều nhiệt cho phản ứng PCR

kiểm tra sự hiện diện của plasmid pET-FI và p43DnaK trong dòng E coli BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK 133

Hình 1.3.11 Sản phẩm khuếch đại gen ftn h và mpi 135

Hình 1.3.12 Biến nạp sản phẩm nối mpi và pFTNH đã

xử lý Hind III và XhoI vào tế bào E coli DH5α 136

Hình 1.3.13 Kết quả kiểm tra dòng E coli DH5 mang

plasmid pET-FI bằng phương pháp cắt giới hạn 138

Hình 1.3.14 So sánh độ tương đồng và sự đồng khung dịch mã

của gen 6xhis-ftn h-mpi 139

Hình 1.3.15 Cấu trúc plasmid pET-FI 140 Hình 1.3.16 Điện di phân tích sản phẩm khuếch đại gen dnak

từ bộ gen E coli BL21(DE3) 140

Hình 1.3.17 Kết quả biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E coli DH5α 141

Trang 19

xvii

Hình 1.3.18 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid p43DnaK

dự tuyển được mang bởi dòng E coli DH5 142

Hình 1.3.19 Cấu trúc plasmid p43DnaK 143 Hình 1.3.20 Kết quả tách chiết và kiểm tra vector

pET-FI và p43DnaK 143

Hình 1.3.21 Kết quả đồng biến nạp hai plasmid pET43DnaK

và pET-FI vào chủng biểu hiện E coli BL21(DE3) 145

Hình 1.3.22 Phân tích sản phẩm khuếch đại gen mpi

và dnak từ khuẩn lạc E coli BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK dự tuyển 146

Hình 1.3.23 Kết quả phân tích sự biểu hiện 6xHis-FTNh-MPI 148 Hình 1.3.24 Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện protein

6xHis-FTNh-MPI bằng phần mềm Quantity-One 150

Hình 1.4.1 Con đường oxi hóa và đồng phân hóa trong

chu chất của E Coli 152

Hình 1.4.2 Cấu trúc DsbA 153 Hình 1.4.3 Con đường hình thành cầu nối disulfide của

protein nhờ DsbA trong chu chất 154

Hình 1.4.4 Khoảng không gian chu chất ở tế bào Gram (-) 155 Hình 1.4.5 Sơ đồ thiết kế cấu trúc biểu hiện đoạn DNA mang gen

dsbA-6xhis-mpi trên plasmid p39TI và sản phẩm

biểu hiện DsbA-6xHis-MPI 158

Hình 1.4.6 Sơ đồ thiết kế plasmid tái tổ hợp p39TI 161 Hình 1.4.7 Chương trình PCR khuếch đại gen mpi 162 Hình 1.4.8 Các bước tạo dòng E coli BL21(DE3)/p39TI biểu

hiện DsbA-6xHis-MPI ở dạng tan trong chu chất 166

Hình 1.4.9 Sản phẩm khuếch đại gen mpi 170 Hình 1.4.10 Biến nạp sản phẩm nối mpi và pET-39b đã xử lý

Trang 20

xviii

Kpn I và EcoR I vào tế bào E coli DH5α 171

Hình 1.4.11 Kết quả sàng lọc dòng E coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp bằng PCR khuẩn lạc với cặp mồi TEVIns-F/TEVIns-R 172

Hình 1.4.12 Kết quả chọn lọc dòng E coli DH5 mang plasmid p39TI bằng phương pháp cắt giới hạn 173

Hình 1.4.13 Kết quả so sánh trình tự gen mpi trên p39TI và lý thuyết 174

Hình 1.4.14 Kết quả tách chiết và kiểm tra vector p39TI 175

Hình 1.4.15 Điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại gen mpi từ p39TI 176

Hình 1.4.16 Kết quả biến nạp vector p39TI vào chủng E coli BL21(DE3)trên môi trường LB-Kan50 177

Hình 1.4.17 Kiểm tra vector p39TI thu nhận từ dòng E coli BL21(DE3)/p39TI 178

Hình 1.4.18 Kết quả phân tích sự biểu hiện DsbA-6xHis-MPI của chủng E coli BL21(DE3)/p39TI 180

Hình 1.4.19 Kết quả phân tích sự biểu hiện DsbA-6xHis-MPI của chủng E coli BL21(DE3)/p39TI ở các phân đoạn khác nhau 181

Hình 1.4.20 Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện protein DsbA-6xHis-MPI bằng phần mềm Quantity-One 182

Hình 2.1.1 Sơ đồ các bước của quá trình lên men tăng dần thể tích 188

Hình 2.1.2 Mô hình biểu diễn sự động học của nồng độ tế bào và của cơ chất trong quá trình nuôi cấy theo thời gian 189

Hình 2.1.3 Động học tăng trưởng của vi sinh vật trong lên men mẻ 190

Hình 2.1.4 Động học tăng trưởng tế bào trong nuôi cấy mẻ- bổ sung với tốc độ bổ sung chất dinh dưỡng khác nhau 196

Trang 21

xix

Hình 2.1.5 Kết quả kiểm tra và xác nhận sự biểu hiện của

6xHis-MPI trên môi trường LB+Amp lỏng bằng phương pháp SDS-PAGE và lai Western blot 202

Hình 2.1.6 Kết quả động học tăng trưởng

của chủng E coli BL21(DE3)/pET43Ins trên 10 loại môi trường đang khảo sát 205

Hình 2.1.7 Xác nhận sự biểu hiện của protein 6xHis-MPI 206 Hình 2.1.8 Ảnh hưởng của pH môi trường lên sự tăng trưởng

của chủng E coli BL21(DE3)/pET43Ins

và sự tạo thành 6xHis-MPI 208

Hình 2.1.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ nạp giống cấp 1

lên sự tăng trưởng của chủng E coli BL21(DE3)/pET43Ins và sự tạo thành 6xHis-MPI 210

Hình 2.1.10 Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sự tăng trưởng

của chủng E coli BL21(DE3)/pET43Ins

Hình 2.1.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng lên sự tăng

trưởng của chủng E coli BL21(DE3)/pET43Ins

Hình 2.1.12 Sự tăng trưởng của chủng E coli

BL21(DE3)/pET43Ins trong hệ thống lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4 216

Hình 2.1.13 Hình thái khuẩn lạc của chủng E coli

BL21(DE3)/pET43Ins trong hệ thống lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4 217

BL21(DE3)/pET43Ins và sự tạo thành 6xHis-MPI trong hệ thống lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4 218

Trang 22

xx

BL21(DE3)/pHTI và sự biểu hiện 10xHis-MPI trong hệ thống lên men 50 lít x 2 220

Hình 2.1.16 Kết quả kiểm tra và xác nhận sự biểu hiện của

10xHis-MPI trên môi trường LB+Amp lỏng bằng phương pháp SDS-PAGE và lai Western blot 222

Hình 2.1.17 Kết quả động học tăng trưởng của chủng E coli

BL21(DE3)/pHTI trên 10 loại môi trường đang khảo sát 224

Hình 2.1.18 Xác nhận sự biểu hiện của protein 10xHis-MPI 226 Hình 2.1.19 Ảnh hưởng của pH môi trường lên sự tăng

trưởng của chủng E coli BL21(DE3)/pHTI

Hình 2.1.20 Ảnh hưởng của tỷ lệ nạp giống cấp 1 lên

sự tăng trưởng của chủng E coli BL21(DE3)/pHTI

của chủng E coli BL21(DE3)/pHTI

Hình 2.1.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng lên sự tăng trưởng

của chủng E coli BL21(DE3)/pHTI

BL21(DE3)/pHTI trong hệ thống lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4 235

Trang 23

xxi

BL21(DE3)/pHTI trong hệ thống lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4 235

BL21(DE3)/pHTI và sự tạo thành 10xHis-MPI trong

hệ thống lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4 237

BL21(DE3)/pHTI và sự biểu hiện 10xHis-MPI trong hệ thống lên men 50 lít x 2 239

Hình 2.1.27 Kết quả động học tăng trưởng của chủng

E coli BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK trên 10 loại môi trường đang khảo sát 242

Hình 2.1.28 Ảnh hưởng của pH môi trường lên sự tăng trưởng của

chủng E coli BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK

và sự tạo thành 6xHis-FTNh-MPI 244

Hình 2.1.29 Ảnh hưởng của tỷ lệ nạp giống cấp 1 lên sự tăng

trưởng của chủng E coli BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK

của chủng E coli BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK

Hình 2.1.31 Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng lên sự tăng trưởng

của chủng E coli BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK

BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK trong hệ thống lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4 252

Trang 24

xxii

BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK trong hệ thống lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4 253

BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK và sự tạo thành 6xHis-FTNh-MPI trong hệ thống lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4 254

BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK và sự biểu hiện 6xHis-FTNh-MPI trong hệ thống lên men 50 lít x 2 257

Hình 2.1.36 Kết quả động học tăng trưởng của chủng E coli

BL21(DE3)/p39TI trên 10 loại môi trường đang khảo sát 260

Hình 2.1.37 Ảnh hưởng của pH môi trường lên sự tăng trưởng

của chủng E coli BL21(DE3)/p39TI

và sự tạo thành DsbA-6xHis-MPI 261

Hình 2.1.38 Ảnh hưởng của tỷ lệ nạp giống cấp 1 lên sự

tăng trưởng của chủng E coli BL21(DE3)/p39TI

của chủng E coli BL21(DE3)/p39TI và sự tạo thành DsbA-6xHis-MPI 265

Hình 2.1.40 Ảnh hưởng của nhiệt đô cảm ứng lên sự tăng

trưởng của chủng E coli BL21(DE3)/p39TI

BL21(DE3)/p39TI trong hệ thống lên men

5 lít với 5 lít môi trường MT4 269

Trang 25

xxiii

BL21(DE3)/p39TI trong hệ thống lên men

5 lít với 5 lít môi trường MT4 270

BL21(DE3)/p39TI và sự tạo thành DsbA-6xHis-MPI trong hệ thống lên men 5 lít với 5 lít môi trường MT4 271

BL21(DE3)/p39TI và sự biểu hiện DsbA-6xHis-MPI

trong hệ thống lên men 50 lít x 2 273 Hình 2.2.1 Mô hình minh họa chức năng kép của FTNh

khi được sử dụng như một protein dung hợp 278

Hình 2.2.2 Đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa khối lượng

sinh khối tươi, lực ly tâm và thời gian ly tâm 283

Hình 2.2.3 Đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa khối lượng

sinh khối tươi, lực ly tâm và thời gian ly tâm 287

Hình 2.3.1 Tế bào E coli quan sát dưới kính hiển vi 291 Hình 2.3.2 Cấu tạo vách tế bào vi khuẩn gram âm 292 Hình 2.3.3 Vi khuẩn E coli trước (trái) và sau khi

phá tế bào bằng phá tế bào 293

Hình 2.3.4 Kết quả điện di kiểm tra khả năng phá tế bào

thu nhận 10xHis-MPI bằng máy sonicate 398

Hình 2.3.5 Kết quả điện di khảo sát số chu kì phá tế bào 399 Hình 2.3.6 Kết quả khảo sát khả năng phá tế bào với

áp lực 14000psi 300

Hình 2.3.7 Kết quả khảo sát khả năng phá tế bào với áp lực 16000psi 300 Hình 2.3.8 Kết quả khảo sát khả năng phá tế bào với áp lực 18000psi 301 Hình 2.3.9 Kết quả khảo sát khả năng phá tế bào với áp lực 20000psi 301 Hình 2.3.10 Kết quả khảo sát khả năng phá tế bào với áp lực 22000psi 301

Trang 26

xxiv

Hình 2.3.11 Kết quả biểu hiện protein DsbA-6xHis-MPI

trong chu chất bằng các phương pháp shock thẩm thấu khác nhau 303

Hình 2.3.12 Đường tương quan tuyến tính giữa các dãy nồng độ

protein đã biết (µg/ml) với mật độ quang ∆OD 595 304

Hình 3.1.1 Cấu trúc của insulin dạng dimer và hexamer 314 Hình 3.1.2 Sơ đồ tinh chế protein dung hợp với thể 6xHis

trên hệ thống cột sắc ký ái lực Ni-NTA 315

Hình 3.1.3 Sơ đồ thu nhận insulin có hoạt tính từ 6xHis-MPI 319 Hình 3.1.4 Kiểm tra độ tinh sạch của 6xHis-MPI

sau khi tinh chế qua cột Ni-NTA 326

Hình 3.1.5 Kết quả kiểm tra phản ứng phân cắt 6xHis-MPI bằng CNBr 327 Hình 3.1.6 Kết quả tinh chế MPI từ dịch phân cắt 6xHis-MPI bằng CNBr 329 Hình 3.1.7 Kết quả ELISA xác nhận cấu hình tái gấp cuộn của MPI 330 Hình 3.1.8 Kết quả ELISA khảo sát pH dung dịch tái gấp cuộn 331 Hình 3.1.9 Kết quả phân tích dung dịch MPI tái gấp cuộn

bằng RP-HPLC 333

Hình 3.1.10 Kết quả kiểm tra sự cắt loại petide C bằng

điện di SDS-PAGE 335

Hình 3.1.11 Kết quả phân tích dịch cắt loại đoạn peptide C

bằng trypsin theo phương pháp RP-HPLC 335

Hình 3.1.12 Sự biến động hàm lượng đường trong máu chuột

sau khi xử lý bằng insulin tái tổ hợp 337

Hình 3.1.13 Sơ đồ thu nhận insulin có hoạt tính từ 10xHis-MPI 339 Hình 3.1.14 Kết quả biểu hiện 10xHis-MPI ở quy mô 5l của chủng

E coli BL21(DE3)/pHTI 343

Hình 3.1.15 Kết quả thu nhận 10xHis-MPI bằng sắc ký ái lực 345

Trang 27

xxv

Hình 3.1.16 Ảnh hưởng của pH lên sự tái gấp cuộn của 10xHis-MPI 348 Hình 3.1.17 Ảnh hưởng của tỉ lệ cystin/cystein lên sự tái gấp cuộn

của 10xHis-MPI 349

Hình 3.1.18 Ảnh hưởng của nồng độ cặp cystin/cystein lên

sự tái gấp cuộn của 10xHis-MPI 350

Hình 3.1.19 Ảnh hưởng của nồng độ cuối của 10xHis-MPI

lên sự tái gấp cuộn 351

Hình 3.1.20 Ảnh hưởng của dung dịch đệm và cofactor

lên phản ứng của trypsin 353

Hình 3.1.21 Ảnh hưởng của pH lên phản ứng cắt 10xHis-MPI

bởi trypsin và carboxypeptidase B 354

Hình 3.1.22 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên phản ứng cắt 10xHis-MPI

Hình 3.1.23 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng cắt 10xHis-MPI

Hình 3.1.24 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất lên phản ứng

cắt 10xHis-MPI bởi trypsin và carboxypeptidase B 358

Hình 3.1.25 Thu nhận insulin tái tổ hợp từ 10xHis-MPI 359 Hình 3.1.26 Kiểm tra cấu hình insulin tái tổ hợp

bằng phương pháp ELISA 360

Hình 3.1.27 Sắc ký đồ và điện di Tricine SDS-PAGE kết quả

tinh sạch insulin tái tổ hợp bằng sắc ký trao đổi cation 360

Hình 3.2.1 Mô hình minh họa chức năng kép của FTNh

khi được sử dụng như một protein dung hợp 363 Hình 3.2.2 Quy trình thu nhận insulin có hoạt tính từ 6xHis-FTNh-MPI 365 Hình 3.2.3 Kết quả tinh chế 6xHis-FTNh-MPI bằng cột Ni-NTA 370 Hình 3.2.4 Kết quả điện di SDS-PAGE và nhuộm bạc phân tích

Trang 28

xxvi

sản phẩm cắt trypsin theo thời gian 371

Hình 3.2.5 Kết quả ELISA phát hiện insulin tái tổ hợp 372 Hình 3.2.6 Kết quả phân tích RP-HPLC mẫu insulin tái tổ hợp

so với mẫu insulin chuẩn và các enzyme trypsin, carboxypeptidase B 373

Hình 3.3.1 Quy trình thu nhận insulin có hoạt tính từ DsbA-6xHis-MPI 379 Hình 3.3.2 Kết quả tinh chế DsbA-6xHis-MPI trong điều kiện

tự nhiên bằng hệ thống Ni-NTA 383

Hình 3.3.3 Kết quả ELISA phát hiện insulin từ mẫu phản ứng cắt

DsbA-6xHis-MPI tạo insulin 384

Hình 3.3.4 Kết quả phân tích RP-HPLC mẫu insulin tái tổ hợp

so với insulin chuẩn 385

Hình 4.1.1 Các bước tinh chế trao đổi ion 389 Hình 4.1.2 Các bước tinh chế bằng sắc ký ái lực 390 Hình 4.1.3 Các bước tinh chế bằng sắc ký kị nước 391 Hình 4.1.4 Các bước tinh chế bằng sắc ký lọc gel 392 Hình 4.1.5 Kết quả kiểm tra phản ứng phân cắt 6xHis-MPI bằng CNBr 399 Hình 4.1.6 Kết quả tinh chế MPI từ dịch phân cắt 6xHis-MPI 400 Hình 4.1.7 Kết quả phản ứng cắt loại chuỗi C khỏi MPI bằng

trypsin/carboxypeptidase B 402

Hình 4.1.8 Kết quả đổi dung dịch bằng phương pháp lọc tiếp tuyến 403 Hình 4.1.9 Sắc ký đồ kết quả tinh chế insulin bằng sắc ký trao đổi ion 403 Hình 4.1.10 Hình điện di Tricine SDS-PAGE kết quả tinh chế bằng

sắc ký trao đổi ion 404

Hình 4.1.11 Hình điện di Tricine SDS-PAGE kết quả tinh thể hóa insulin 405 Hình 4.1.12 Hình điện di SDS-PAGE kết quả tinh chế bằng sắc ký lọc gel 406 Hình 4.1.13 Phân tích kết quả tinh chế insulin từ 6xHis-MPI quy mô

phòng thí nghiệm bằng sắc ký RP-HPLC 407

Trang 29

Hình 4.2.6 Hình điện di Tricine SDS-PAGE kết quả tinh thể hóa insulin 418 Hình 4.2.7 Sắc ký đồ kết quả tinh chế bằng sắc ký lọc gel 418 Hình 4.2.8 Điện di Tricine SDS-PAGE kết quả tinh chế bằng

sắc ký lọc gel 419

Hình 4.2.9 Phân tích kết quả tinh chế insulin từ 6xHis-MPI

quy mô pilot bằng sắc ký RP-HPLC 420

Hình 4.3.1 Quy trình tinh chế insulin từ 10xHis-MPI 422 Hình 4.3.2 Kết quả tinh sạch insulin tái tổ hợp từ 10xHis bằng

sắc ký trao đổi cation 423

Hình 4.3.3 Kết quả tinh sạch insulin tái tổ hợp từ 10xHis-MPI bằng

sắc ký lọc gel 425

Hình 4.4.1 Quy trình tinh chế insulin từ 10xHis-MPI 427 Hình 4.4.2 Kết quả tinh sạch insulin tái tổ hợp từ 10xHis-MPI bằng

Hình 4.4.3 Sắc ký đồ RP-HPLC tinh chế insulin 430 Hình 4.4.4 Hình điện di và kết quả phân tích Quantity-One kết quả

tinh chế RP-HPLC 431

Hình 5.1 Cấu trúc hóa học của streptozotocin 434 Hình 5.2 Kết quả kiểm tra hoạt tính insulin tái tổ hợp trước khi tinh chế

bằng phương pháp ELISA 436

Trang 30

xxviii

Hình 5.3 Kết quả thử nghiệm ELISA của các mẫu sau tinh chế với

kháng thể OXI005 437

Hình 5.4 Sự biến động hàm lượng đường trong máu chuột

sau khi xử lý bằng insulin tái tổ hợp 439

Hình 6.1.1 451 Hình 6.1.2 452 Hình 6.1.3 452 Hình 6.1.4 453 Hình 6.2.1 Kết quả ELISA với kháng thể OXI005 kháng insulin có

cấu hình gấp cuộn khảo sát thời gian cắt loại thẻ 6xHis

và peptide C tạo insulin có cấu hình gấp cuộn 459

Hình 6.3.1 Đường chuẩn của phương pháp Bradford 463 Hình 6.3.2 Đường chuẩn phương pháp BCA 464 Hình 6.3.3 Sắc ký đồ RP-HPLC mẫu Insulin chuẩn có nồng độ 1mg/ml 468 Hình 6.3.4 Sắc ký đồ RP-HPLC mẫu Insulin chuẩn có nồng độ 2mg/ml 469 Hình 6.3.5 Sắc ký đồ RP-HPLC mẫu Insulin chuẩn có nồng độ 3mg/ml 469 Hình 6.3.6 Sắc ký đồ RP-HPLC mẫu Insulin chuẩn có nồng độ 4mg/ml 470 Hình 6.3.7 Sắc ký đồ RP-HPLC mẫu Insulin chuẩn có nồng độ 5mg/ml 470 Hình 6.3.8 Đường chuẩn RP-HPLC 471 Hình 6.3.9 Sắc ký đồ RP-HPLC mẫu Insulin sau tinh chế có

Trang 31

insulin tái tổ hợp và insulin chuẩn 530 Hình 7.3.1 Tồn lưu hoạt tính của các loại insulin theo thời gian 536

PHẦN PHỤ LỤC

Hình PL-1.1 Plasmid pBlueScript II KS (+) 571 Hình PL-1.2 Cấu trúc plasmid pET43.1a(+) 572 Hình PL-1.3 Plasmid pET-28a(+) 572 Hình PL-1.4 Plasmid pET-39b(+) 573 Hình PL-1.5 Giao diện phân tích vạch protein của Quantity-One 573 Hình PL-1.6 Plasmid pET43Ins 583 Hình PL-1.7 Plasmid pHTI 584 Hình PL-1.8 Cấu trúc plasmid pET-FI 588 Hình PL-1.9 Cấu trúc plamid tái tổ hợp p39TI 590 Hình PL-2.1 Hệ thống ly tâm Avanti J-HC (A) và ống ly tâm (B) 594 Hình PL-2.2 Hệ thống lọc tiếp tuyến 594 Hình PL-2.3 Hệ thống máy phá tế bào 594 Hình PL-2.4 Hệ thống lên men 1 lít BioTron –LiFlusGX 05-08GX-08 600 Hình PL-2.5 Hệ thống lên men tự động dung tích 1 lít 604

Trang 32

xxx

Hình PL-2.6 Sơ đồ đường nước giải nhiệt từ chiller

đến hệ thống lên men 604

Hình PL-2.7 Bình đựng hóa chất, bơm nhu động trước

và sau khi lắp với dây silicon 605

Hình PL-2.8 Giao diện chính của hệ thống lên men tự động 606 Hình PL-2.9 Giao diện Set Up 606 Hình PL-2.10 Giao diện pH Set Up 607 Hình PL-2.11 Giao diện Alarm Set up 607 Hình PL-2.12 Giao diện pH Calibration 608 Hình PL-2.13 Giao diện pH ReCalibration 609 Hình PL-2.14 Giao diện DO Calibration 610 Hình PL-2.15 Giao diện Temperature Calibration 611 Hình PL-2.16 Giao diện Pump Calibration 611 Hình PL-2.17 Giao diện calib bơm có vận tốc cố định 612 Hình PL-2.18 Giao diện calib bơm có vận tốc thay đổi 613 Hình PL-2.19 Hệ thống lên men tự động BioTron –LiFlusGX

05-08GX-08 dung tích 5 lít 617

Hình PL-2.20 Hệ thống lên men 100 lít 618 Hình PL-2.21 Đường tương quan tuyến tính giữa các

dãy nồng độ protein đã biết với cường độ màu xây dựng bằng phần mềm Quantity One 623

Trang 33

xxxi

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1.1 Sự tăng mức độ biểu hiện các loại protein khi codon

được thay đổi để phù hợp với hệ thống dịch mã

tế bào chủ ngoại lai 31

Bảng 1.1.2 Chiều dài, %GC, và nhiệt độ bắt cặp của phần bổ sung

ở đầu 3’OH của các oligonucleotide 61

Bảng 1.2.1 Sản phẩm mục tiêu 6xHis-MPI của plasmid pET43Ins 68 Bảng 1.2.2 Sản phẩm mục tiêu 10xHis-MPI của plasmid pHTI 69 Bảng 1.2.3 Nồng độ và độ tinh sạch của pET43Ins tách chiết

Bảng 1.3.1 Sản phẩm mục tiêu 6xHis-FTN h -MPI của plasmid pET-FI 122

Bảng 1.3.2 Nồng độ và độ tinh sạch của pET-FI và p43DnaK

tách chiết từ E coli DH5α/pET-FI

và E coli DH5α/p43DnaK tương ứng 144

Bảng 1.4.1 Sản phẩm mục tiêu DsbA-6xHis-MPI của plasmid p39TI 157 Bảng 1.4.2 Nồng độ và độ tinh sạch của p39TI tách chiết

từ E coli DH5α/p39TI 175

Bảng 1.4.3 Nồng độ và độ tinh sạch của p39TI tách chiết

Trang 34

xxxii

từ E coli BL21(DE3)/p39TI 178

Bảng 2.1.1 Nồng độ gây ức chế của một số thành phần

trong môi trường nuôi cấy 196

Bảng 2.1.2 Kết quả sinh khối khô (g/L) của chủng

BL21(DE3)/pET43Ins ở 10 loại môi trường 204

BL21(DE3)/pHTI ở 10 loại môi trường 224

BL21(DE3)/pET-FI+p43DnaK ở 10 loại môi trường 241

BL21(DE3)/p39TI ở 10 loại môi trường 259

Bảng 2.2.1 Lượng sinh khối tươi tế bào sau lên men thu

được ở thời gian và lực ly tâm khác nhau 283

Bảng 2.2.2 Lượng sinh khối tươi tế bào sau lên men thu

được ở thời gian và lực ly tâm khác nhau 283

Bảng 2.3.1 Mật độ quang của các phân đoạn chu chất khi xử lý

bằng các phương pháp shock thẩm thấu khác nhau 304

Bảng 2.3.2 Hàm lượng protein tổng, hàm lượng DsbA-6xHis-MPI

có được trong các phân đoạn chu chất 205

Bảng 3.1.1 Chương trình sắc ký RP-HPLC phân tích MPI và insulin 323 Bảng 3.1.2 Kết quả thu hoạch sinh khối tế bào sau lên men 324 Bảng 3.1.3 Kết quả thu nhận thể vùi chứa 6xHis-MPI

từ sinh khối tế bào 324

Bảng 3.1.4 Kết quả thu nhận và tinh chế sơ bộ 6xHis-MPI

từ thể vùi bằng cột Ni-NTA 325

Bảng 3.1.5 Kết quả thu nhận MPI khi xử lý 6xHis-MPI bằng CNBr 326 Bảng 3.1.6 Kết quả tinh chế thu nhận MPI từ dịch xử lý bằng CNBr 328

Trang 35

xxxiii

Bảng 3.1.7 Kết quả ELISA kiểm tra cấu hình tái gấp cuộn MPI

theo OD 492nm 330

Bảng 3.1.8 Kết quả ghi nhận giá trị OD 492 nm của phản ứng ELISA

khảo sát pH của dung dịch tái gấp cuộn 331

Bảng 3.1.9 Kết quả tái gấp cuộn MPI tạo cấu hình MPI tự nhiên 332 Bảng 3.1.10 Kết quả phân tích MPI tái gấp cuộn bằng RP- HPLC 333 Bảng 3.1.11 Kết quả đánh giá hoạt tính insulin tái tổ hợp trên chuột 336 Bảng 3.1.12 Kết quả thu sinh khối E coli BL21(DE3)/pHTI

và thể vùi 10xHis-MPI 344

Bảng 3.1.13 Kết quả thu nhận 10xHis-MPI dạng biến tính 346 Bảng 3.2.1 Chương trình chạy HPLC phân tích mẫu insulin 369 Bảng 3.2.2 Kết quả đánh giá hoạt tính insulin tái tổ hợp trên chuột 374 Bảng 3.3.1 Chương trình chạy HPLC phân tích mẫu insulin 382 Bảng 3.3.2 Kết quả đánh giá hoạt tính insulin tái tổ hợp trên chuột 386 Bảng 4.1.1 Kết quả cắt loại thẻ 6xHis từ 6xHis-MPI bằng CNBr

qui mô phòng thí nghiệm 398

Bảng 4.1.2 Kết quả tinh chế thu nhận MPI qui mô phòng thí nghiệm 400 Bảng 4.2.1 Kết quả cắt loại thẻ 6xHis từ 6xHis-MPI bằng

CNBr qui mô pilot 411

Bảng 4.2.2 Kết quả tinh chế thu nhận MPI qui mô pilot 413 Bảng 4.4.1 Chương trình chạy sắc ký RP-HPLC 428 Bảng 5.1 Kết quả OD 492 của thử nghiệm ELISA gián tiếp với kháng thể

OXI005 của insulin tái tổ hợp trong và sau quá trình tinh chế 437

Bảng 5.2 Kết quả đánh giá hoạt tính insulin tái tổ hợp trên chuột 438 Bảng 5.3 Kết quả đánh giá hoạt tính insulin tái tổ hợp trong quá trình

tinh chế trên chuột 439

Bảng 5.4 Kết quả đánh giá hoạt tính insulin tái tổ hợp trong quá trình

Trang 36

xxxiv

tinh chế trên chuột 440

Bảng 6.2.1 Chú thích các mẫu cố định lên các giếng trong

thử nghiệm ELISA với kháng thể OXI005 kháng insulin

có cấu hình gấp cuộn 460

Bảng 6.2.2 Kết quả OD 492 của thử nghiệm ELISA gián tiếp với

kháng thể OXI005 kháng insulin có cấu hình gấp cuộn 460

Bảng 6.3.1 Kết quả diện tích peak thu được khi chạy RP-HPLC

ở các nồng độ insulin khác nhau 471

Bảng 6.3.2 Tương quan giữa diện tích peak và nồng độ protein 472 Bảng 6.4.1 So sánh hoạt tính của insulin người được xác định

bằng RP-HPLC và bằng phương pháp sinh học trên thỏ 475

Bảng 6.4.2 Chương trình chạy sắc ký RP-HPLC 476 Bảng 6.4.3 Kết quả diện tích peak thu được khi chạy RP-HPLC

ở các nồng độ insulin 4mg/ml và 0,4mg/ml 479

Bảng 6.6.1 Bảng theo dõi tình trạng chuột sống chết

trong vòng 24-72 giờ 493

Bảng 6.6.2 Kết quả theo dõi tình trạng vị trí tiêm thuốc (SC) trên

chuột sau 14 ngày 494

Bảng 6.6.3 Kết quả thử nghiệm độc tính cấp đường tiêm dưới da (SC)

của insulin tái tổ hợp 495

Bảng 7.1.1 Lượng đường huyết trong máu của chuột ĐTĐ loại 1 khi

xử lý với STZ sau 4 tuần 520

Bảng 7.2.1 Kết quả thử nghiệm đường huyết chuột đối với mẫu

Trang 37

xxxv

theo thời gian 535

Bảng 7.3.3 Tồn lưu hoạt tính của insulin tái tổ hợp theo thời gian 535 Bảng 7.3.4 Biến thiên hoạt tính củacác loại insulin theo thời gian (%) 537

Trang 38

bp base pair (cặp base)

dH 2 O distilled water (nước cất)

DNA Deoxyribose Nucleic Acid

dNTP Deoxynucleoside Triphosphate

DsbA Disulfide bond A

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic acid

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

FPLC Fast protein liquid chromatography

FTN-H Ferritin Heavy chain

GLUT2 Glucose Transporter Type 2

GLUT4 Glucose Transporter Type 4

HRP Horseradish Peroxidase

Ni-NTA Nickel-nitrilotriacetic acid

Trang 39

xxxvii

OD Optical Density (Mật độ quang)

PBST Phosphate Buffer Saline Tween

PCA Phenol Chloroform isoamylalcohol

PCR Polymerase Chain Reaction

polyHis polyHistidine

RP-HPLC Reversed-phase high-performance liquid chromatography

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel

Electrophoresis SEC Size Exclusive Chromatography – Sắc ký lọc gel

TAE Tris Acetate Ethylenediaminetetraacetate

TCA Trichloroacetic Acid

TEMED N, N, N’, N’- Tetramethylethylene Diamine

TEV Tobacco etch virus

TFA Trifluoroacetic Acid

WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế

giới)

Quy định mã hĩa cho amino acid:

Trang 40

xxxviii

Định dạng
Số trang	746
Dung lượng	28,8 MB