Toàn văn Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ♣♦♣ HOÀNG VĂN QUỐC CHƯƠNG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HP LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2010 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ♣♦♣ HOÀNG VĂN QUỐC CHƯƠNG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HP Chuyên ngành: Vi sinh học Mã số: 1.05.12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. TRẦN LINH THƯỚC Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2010 -i- Luận án Tiến só Lời cảm ơn LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin chân thành gởi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Phó giáo sư, Tiến só Trần Linh Thước. Thầy đã tận tụy hướng dẫn, giúp đỡ em trong quá trình học tập, tạo điều kiện tốt nhất cho em để hoàn thành luận án. Không có sự hỗ trợ của Thầy, em không thể hoàn thành được luận án này. Xin trân trọng cảm ơn Thầy! Em xin cảm ơn PGS.TS. Phạm Thành Hổ, đã thường xuyên quan tâm, động viên và cung cấp những thông tin q báu cho em trong quá trình học tập và thực hiện luận án. Xin gởi lời cảm ơn đến PGS.TS. Phan Văn Chi, Phó viện trưởng Viện khoa học Công nghệ Việt Nam, đã giúp đỡ chúng tôi phân tích trình tự mini-proinsulin. Xin cảm ơn TS. Peer Nobert Jorgensen, công ty Norvonordisk, Đan Mạch, đã cung cấp cho chúng tôi các kháng thể sử dụng trong quá trình nghiên cứu. Em xin gởi lời cảm ơn đến tất cả q Thầy Cô trong Khoa sinh học, Trường Đại học khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí minh, đã cung cấp cho em những kiến thức bổ ích trong suốt quá trình học tập ở Trường. Xin cảm ơn tất cả các bạn, các em trong phòng thí nghiệm công nghệ sinh học phân tử (Lab A) ĐH KHTN tp HCM. Cảm ơn các bạn Hoàng, Trang, Thảo, Trí… cảm ơn các em Nam, Nhung, Nghóa, Đạt, Đức, Trâm, Ngân… đặc biệt cảm ơn Hoa, đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian thực hiện luận án. Không có sự giúp đỡ của các bạn, các em, tôi không thể hoàn thành được luận án này. Cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Và trên hết, xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Đặc biệt cảm ơn Vợ và các con đã mang lại cho tôi niềm hạnh phúc, sự yên tâm trong quá trình thực hiện luận án. Tp Hồ Chí Minh, Tháng 01 năm 2010 -ii- Luận án Tiến só Mục lục MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC HÌNH viii DANH MỤC BẢNG xi ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 5 1.1. Insulin và vai trò đối với cơ thể 5 1.2. Bệnh tiểu đường 8 1.3. Các phương pháp sản xuất insulin 10 1.3.1. Sản xuất insulin từ tụy tạng động vật 10 1.3.2. Sản xuất insulin người bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA 12 1.4. Sản xuất protein tái tổ hợp trong tế bào E. coli 18 1.4.1. Đặc điểm của E. coli trong sản xuất protein tái tổ hợp 18 1.4.2. Các chủng E. coli thường dùng trong sản xuất protein tái tổ hợp 20 1.5. Các hệ thống vector biểu hiện trong E. coli 24 1.5.1. Hệ thống pGEX biểu hiện protein dung hợp với GST 24 1.5.2. Hệ thống pET biểu hiện protein dung hợp với 6xHis 25 1.5.3. Hệ thống biểu hiện dung hợp với MBP - Hệ thống pMAL 27 1.5.4. Hệ thống IMPACT biểu hiện protein dung hợp với CBP 27 1.6. Phương pháp lên men vi sinh vật 28 1.6.1. Các phương pháp lên men sản xuất protein tái tổ hợp 28 1.6.2. Đặc điểm lên men mẻ 29 1.6.3. Đặc điểm lên men liên tục 32 1.6.4. Đặc điểm lên men mẻ-bổ sung 32 1.6.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến lên men mẻ-bổ sung chủng E. coli để sản xuất protein tái tổ hợp 34 1.7. Các bước xử lý sau lên men để thu nhận mini-proinsulin và insulin có hoạt tính 39 1.7.1. Thu nhận và làm tan thể vùi chứa mini-proinsulin 39 1.7.2. Tái gấp cuộn mini-proinsulin tái tổ hợp 40 1.7.3. Cắt loại đoạn peptide C để thu nhận insulin có hoạt tính 43 1.7.4. Các bước xử lý để thu nhận protein mục tiêu từ protein dung hợp 44 -iii- Luận án Tiến só Mục lục 1.7.5. Các phương pháp tinh chế trung gian và tinh chế hoàn tất trong sản xuất insulin từ mini-proinsulin 45 1.8. Qui trình sản xuất insulin tái tổ hợp theo mô hình mini-proinsulin 47 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 49 2.1. Dụng cụ và thiết bò 49 2.1.1. Thiết bò chính dùng trong sinh học phân tử 49 2.1.2. Thiết bò dùng trong thao tác nuôi cấy vi sinh 49 2.1.3. Thiết bò dùng cho tinh chế protein 49 2.1.4. Thiết bò dùng xác đònh hàm lượng đường huyết 50 2.2. Hóa chất và môi trường 50 2.2.1. Hóa chất 50 2.2.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh 55 2.3. Nguyên vật liệu 55 2.3.1. Chủng vi sinh vật 55 2.3.2. Plasmid 56 2.3.3. Mồi dùng cho tổng hợp gen, tạo dòng và giải trình tự 56 2.3.4. Thang phân tử lượng dùng trong điện di 57 2.3.5. Các kháng thể sử dụng cho Western Blot và ELISA 57 2.4. Phương pháp 58 2.4.1. Thiết kế, tổng hợp gen mpi mã hóa 6xHis-MPI trong E. coli bằng phương pháp PCR tái tổ hợp 58 2.4.2. Tạo dòng gen mpi trong plasmid pBlue (pBIns) 61 2.4.3. Tái tạo dòng gen mpi vào vector biểu hiện pET-43.1a 62 2.4.4. Cảm ứng biểu hiện và xác nhận sự biểu hiện của 6xHis-MPI 63 2.4.5. Hoạt hóa chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins 66 2.4.6. Khảo sát các điều kiện cảm ứng tối ưu sự biểu hiện 6xHis-MPI của chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins 66 2.4.7. Khảo sát thay thế trypton bằng pepton trong môi trường LB nuôi cấy E. coli BL21(DE3)/pET43Ins 68 2.4.8. Khảo sát sự biểu hiện 6xHis-MPI của chủng E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins được nuôi cấy trong môi trường LBp và LB 68 2.4.9. Khảo sát điều kiện nuôi cấy E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins mật độ cao bằng phương pháp mẻ-bổ sung ở qui mô phòng thí nghiệm 69 2.4.10. Khảo sát điều kiện lên men E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins bằng nuôi cấy mẻ-bổ sung ở qui mô pilot 30L 70 2.4.11. Phương pháp thu sinh khối và đồng nhất tế bào 71 2.4.12. Thu nhận và làm tan thể vùi chứa 6xHis-MPI 72 2.4.13. Thu nhận và tinh chế sơ bộ 6xHis-MPI bằng sắc ký cột Ni-NTA 72 2.4.14. Phương pháp cắt loại bỏ 6xHis bằng CNBr để thu nhận MPI 72 -iv- Luận án Tiến só Mục lục 2.4.15. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng lên sự tái gấp cuộn của MPI 73 2.4.16. Tủa mini-proinsulin và insulin bằng ion kẽm kim loại 75 2.4.17. Phương pháp xử lý MPI bằng trypsin/carboxypeptidase B để thu nhận insulin có hoạt tính 75 2.4.18. Kiểm tra cấu hình của MPI và insulin bằng phương pháp ELISA 76 2.4.19. Phân tích MPI và insulin bằng sắc ký RP-HPLC 77 2.4.20. Giải trình tự amino acid của MPI bằng khối phổ 77 2.4.21. Phương pháp đònh lượng protein 77 2.4.22. Phương pháp xác đònh tính hoạt tính của insulin tái tổ hợp 79 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 80 3.1. Tạo dòng tế bào E. coli có khả năng biểu hiện mini-proinsulin dung hợp với 6xHis (6xHis-MPI) 80 3.1.1. Tổng hợp gen mpi mã hóa mini-proinsulin biểu hiện trong E. coli 80 3.1.2. Tạo dòng gen mpi vào plasmid pBlue 81 3.1.3. Tạo dòng tế bào E. coli BL21(DE3)/pET43Ins biểu hiện MPI ở dạng dung hợp 6xHis-MPI 83 3.1.4. Kiểm tra trình tự amino acid của 6xHis-MPI 87 3.2. Lên men E. coli BL21(DE3)/pET43Ins tổng hợp 6xHis-MPI tái tổ hợp ở qui mô phòng thí nghiệm và qui mô pilot 89 3.2.1. Hoạt hóa, nhân giống và kiểm tra khả năng biểu hiện 6xHis-MPI của chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins 89 3.2.2. Khảo sát các điều kiện biểu hiện tối ưu 6xHis-MPI của E. coli BL21(DE3)/pET43Ins 91 3.2.3. Xác đònh điều kiện nuôi cấy mật độ cao chủng E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins ở qui mô phòng thí nghiệm 95 3.2.4. Nuôi cấy E. coli BL21(DE3)/pET43Ins theo phương thức mẻ- bổ sung ở qui mô 30 L để tổng hợp 6xHis-MPI 101 3.3. Thu nhận MPI có cấu hình tự nhiên 104 3.3.1. Thu nhận thể vùi chứa 6xHis-MPI 104 3.3.2. Thu nhận 6xHis-MPI từ thể vùi 105 3.3.3. Thu nhận MPI từ 6xHis-MPI 107 3.4. Thu nhận insulin từ MPI 111 3.4.1. Tái gấp cuộn MPI 111 3.4.2. Cắt loại peptide C bằng trypsin 116 3.5. Kiểm tra hoạt tính của insulin tái tổ hợp trên chuột 118 3.6. Sơ đồ qui trình công nghệ sản xuất insulin ở qui mô pilot 119 KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 122 -v- Luận án Tiến só Mục lục DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 124 TÀI LIỆU THAM KHẢO 125 PHỤ LỤC 132 -vi- Luận án Tiến só Danh mục chữ viết tắt DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 6xHis: 6 Histidine aH-LB p : Môi trường H-LB p có bổ sung khoáng APS: Ammonium persulfate Arg: Arginine (amino acid) ATP: Adenosine triphosphate BTĐ: Bệnh tiểu đường CDNB: 1-chloro-2-dinitrobenzene CNBr: Cyanogen bromide DCW: Hàm lượng tế bào khô DOC: Hàm lượng ôxi hòa tan DTT: Dithiothreitol EDTA: Ethylenediamine tetraacetic acid ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay FDA: Cục quản lý dược phẩm Mỹ FPLC: Fast performance liquid chromatography GST: Glutathione S- Transferase H-LB p : Môi trường LB p nồng độ cao HRP: Horseradish Peroxidase IDA: Iminodiacetic acid IPTG: Isopropyl-β-D-thiogalactoside kDa: KiloDalton LB: Luria bertani, môi trường nuôi cấy E. coli LB p : Môi trường LB thay thế trypton bằng pepton -vii- Luận án Tiến só Danh mục chữ viết tắt Lys: Lysine (amino acid) MBP: Maltose binding protein MCS: Multicloning site MPI: Mini-proinsulin Ni-NTA: Nikel- nitrilotriacetic acid OPD: o-Phenylenediamine PBS-T: Phosphate Buffered Saline Tween PDI: Protein disulfide isomerase RP-HPLC: Sắc ký lỏng cao áp ngược pha SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SEC: Size exclusive chromatography , sắc ký lọc gel TEMED: (N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine) TFA: Trifluoroacetic acid WHO: Tổ chức Y tế Thế giới -viii- Luận án Tiến só Danh mục Hình DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc của insulin 5 Hình 1.2. Các bước tạo insulin in vivo ở người 7 Hình 1.3. Cơ chế điều hòa hàm lượng đường trong máu 8 Hình 1.4. Cấu trúc không gian của insulin heo (bên trái), của người (bên phải). 10 Hình 1.5. Biến đổi insulin heo thành insulin người 11 Hình 1.6. Hình thái tế bào E. coli. 19 Hình 1.7. Cơ chế biểu hiện gen bởi hệ thống vector pET trong tế bào E. coli (DE3)pLysS 21 Hình 1.8. Sơ đồ hệ thống vector biểu hiện pGEX 2TK. 24 Hình 1.9. Cấu trúc vector biểu hiện pET 43-1a(+) 26 Hình 1.10. Tương tác giữa protein dung hợp chứa 6xHis và giá thể gắn Nikel 26 Hình 1.11. Sơ đồ biểu hiện và thu nhận các protein có gắn thẻ MBP 27 Hình 1.12. Sơ đồ biểu hiện và tinh chế sử dụng hệ thống gắn thẻ Chitin. 28 Hình 1.13. Mô hình biểu diễn sự động học của nồng độ tế bào và của cơ chất trong quá trình nuôi cấy theo thời gian của các phương pháp lên men. 29 Hình 1.14. Động học tăng trưởng của vi sinh vật trong lên men mẻ 30 Hình 1.15. Động học tăng trưởng tế bào trong nuôi cấy mẻ- bổ sung với tốc độ bổ sung chất dinh dưỡng khác nhau 36 Hình 1.16. Cấu trúc của proinsulin. Sau khi cắt đoạn peptide C sẽ được insulin có hoạt tính 44 Hình 1.17. Sơ đồ Tinh chế protein dung hợp với thể 6xHis trên hệ thống cột sắc ký ái lực Ni-NTA 46 Hình 1.18. Cấu trúc của insulin dạng dimer (A) và hexamer (B) 47 Hình 1.19. Sơ đồ khái quát qui trình sản xuất insulin tái tổ hợp theo mô hình mini- proinsulin bằng hệ thống vector pET trong E. coli. 48 Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc hệ thống biểu hiện gen mpi. 58 Hình 2.2. Sơ đồ trình tự amino acid của 6xHis-MPI. 59 Hình 2.3. Sơ đồ minh họa sự tổng hợp gen mpi bằng phương pháp PCR hai bước. 60 Hình 3.1. Kết quả phân tích gen mpi tổng hợp bằng PCR tái tổ hợp trên gel agarose. 80 Hình 3.2. Kết quả chọn lọc dòng vi khuẩn E. coli DH5 α mang pBIns bằng phương pháp cắt giới hạn 81 [...]... phương pháp sản xuất insulin người bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA và đã được chấp nhận sử dụng từ năm 1982 1.3.2 Sản xuất insulin người bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA Insulin người tái tổ hợp được sản xuất theo hai phương án: (1) Biểu hiện hai chuỗi A, B độc lập sau đó thực hiện phản ứng tạo cầu nối disulfide hình thành phân tử insulin (phương án hai chuỗi); (2) Sản xuất proinsulin tái tổ hợp sau đó dùng... insulin/ năm (100U =3,5 mg) Năm 2001, giấy phép độc quyền sản xuất insulin tái tổ hợp chính thức hết hiệu lực, mở ra cơ hội lớn cho các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam, có thể tiếp cận được công nghệ hiện đại để phát triển qui trình sản xuất insulin người tái tổ hợp trong nước, mang lại triển vọng góp phần giải quyết khó khăn trên Mặc dù bản quyền sản xuất insulin bằng công nghệ DNA tái tổ. .. cho phép lưu hành Hiện nay có nhiều công ty dược phẩm trên thế giới sản xuất insulin tái tổ hợp như: Eli Lilly, Novo disk, Sanofi Aventis … với nhiều loại sản phẩm insulin khác nhau Công nghệ sản xuất insulin hiện nay thường được tiếp cận theo hai phương pháp: phương pháp một chuỗi polypeptide và phương pháp hai chuỗi polypeptide Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp bằng phương pháp một chuỗi polypeptide... vụ thực hiện đề tài cấp nhà nước Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp điều trò bệnh đái tháo đường”, mã số Luận án Tiến só Đặt vấn đề -4- KC.04.09/06-10 Nội dung nghiên cứu của luận án là thực hiện một phần trong nội dung của đề tài cấp nhà nước này Về mặt khoa học, mục tiêu của luận án nhằm bước đầu nghiên cứu qui trình tổng hợp insulin người tái tổ hợp theo phương pháp một chuỗi polypeptide... coli tái tổ hợp biểu hiện mini-proinsulin, lên men, tái gấp cuộn mini-proinsulin và xử lý để tạo insulin có hoạt tính Ý nghóa thực tiễn của đề tài là ứng dụng công nghệ gen, công nghệ lên men và công nghệ protein để tạo ra chế phẩm insulin có hoạt tính dùng làm thuốc trò bệnh tiểu đường Luận án tập trung nghiên cứu cụ thể các vấn đề sau: - Tạo chủng E coli tái tổ hợp có mang vector biểu hiện mini-proinsulin... bằng công nghệ DNA tái tổ hợp đã hết hạn tuy nhiên các công ty dược phẩm vẫn tiếp tục giữ những bí quyết công nghệ có tính thế mạnh của công ty nên rất khó tiếp cận để có được qui trình công nghệ đầy đủ nhằm sản xuất insulin Do vậy, cần phải nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ riêng dựa trên những thông tin đã công bố và trình độ công nghệ sẵn có để tiến đến việc sản xuất insulin trong nước đáp ứng... hiệu (trypsin/carboxypeptidase) cắt bỏ đoạn peptide C tạo insulin có hoạt tính (phương án một chuỗi) Gần đây, thay cho proinsulin trong phương án một chuỗi, người ta biểu hiện mini-proinsulin (có đoạn C ngắn hơn so với trường hợp proinsulin) để sản xuất insulin 1.3.2.1 Sản xuất insulin tái tổ hợp bằng phương án hai chuỗi Chế phẩm insulin tái tổ hợp của người đầu tiên được thu nhận bằng cách gắn hai đoạn... đạt đến 25% tổng protein của tế bào Phần dung hợp T2 sau đó được cắt bỏ bởi CNBr và M2PI mini-proinsulin được tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion Hiệu suất tái gấp cuộn của M2PI miniproinsulin tốt hơn từ 20-40% so với hiệu suất gấp cuộn của proinsulin 1.3.2.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất insulin trong nước Ở Việt Nam, công trình nghiên cứu sản xuất insulin tiếp cận theo hướng biểu hiện proinsulin ở tế... Macleod chính thức công bố sự khám phá ra insulin Năm 1955, Fredick Sanger xác đònh trình tự amino acid của insulin Năm 1979, insulin được sản xuất bằng phương pháp tái tổ hợp và được thương mại hóa vào năm 1982, trở thành protein tái tổ hợp đầu tiên được sản xuất bằng phương pháp này và được sử dụng cho mục đích trò liệu [35],[54] Hình 1.1 Cấu trúc của insulin Luận án Tiến só Tổng quan -6- Insulin là một... mini-proinsulin tái tổ hợp của người - Xây dựng qui trình lên men nuôi cấy chủng E coli tái tổ hợp biểu hiện mini-proinsulin - Thiết lập qui trình thu nhận và tinh sạch mini-proinsulin từ tế bào chủng E coli - Xây dựng qui trình tái gấp cuộn mini-proinsulin và xử lý thu nhận insulin có hoạt tính - Thử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp trên chuột Luận án Tiến só Đặt vấn đề -5- CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Insulin . tái tổ hợp DNA 12 1.4. Sản xuất protein tái tổ hợp trong tế bào E. coli 18 1.4.1. Đặc điểm của E. coli trong sản xuất protein tái tổ hợp 18 1.4.2. Các chủng E. coli thường dùng trong sản xuất. nay có nhiều công ty dược phẩm trên thế giới sản xuất insulin tái tổ hợp như: Eli Lilly, Novo disk, Sanofi Aventis … với nhiều loại sản phẩm insulin khác nhau. Công nghệ sản xuất insulin hiện. đủ nhằm sản xuất insulin. Do vậy, cần phải nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ riêng dựa trên những thông tin đã công bố và trình độ công nghệ sẵn có để tiến đến việc sản xuất insulin trong