Đang tải... (xem toàn văn)
38 BÀI SỐ 5 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI SINH VẬT TRÊN KÍNH HIỂN VI I MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU 1 Kiến thức lý thuyết Đặc điểm sinh học của các nhóm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, nấm men Ý nghĩa[.]
38 BÀI SỐ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI SINH VẬT TRÊN KÍNH HIỂN VI I MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU Kiến thức lý thuyết - Đặc điểm sinh học nhóm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, nấm men - Ý nghĩa việc nghiên cứu đặc điểm sinh học nhóm vi sinh vật - Các đặc điểm sinh học đặc trưng nhóm vi sinh vật Kỹ thực hành - Kỹ sử dụng kính hiển vi quang học - Kỹ làm tiêu tạm thời, tiêu cố định - Kỹ nhuộm màu tiêu - Kỹ quan sát đặc điểm sinh học vi sinh vật kính hiển vi quang học II HÓA CHẤT – NGUYÊN LIỆU – DỤNG CỤ Khái niệm thuốc nhuộm - Thuốc nhuộm hợp chất hóa học dùng để nhuộm màu - Căn vào tính chất hóa lý, chia làm loại thuốc nhuộm chính: Thuốc nhuộm kiềm thuốc nhuộm gốc kiềm có khả nhuộm màu, chúng kết hợp chặt chẽ với phần nhân tế bào Ví dụ: thuốc nhuộm tím gentian, fuchsin kiềm, safranin Thuốc nhuộm acid thuốc nhuộm mà gốc kiềm có khả kết hợp chặt chẽ với thành phần tế bào chất Trong nghiên cứu vi sinh vật, người ta sử dụng chủ yếu thuốc nhuộm kiềm tế bào chúng bắt màu tốt với loại thuốc nhuộm Một số loại thuốc thuộm sử dụng ❖ Thuốc nhuộm Fuchsin: 1/ Rượu ethylic 96o : 10 ml Fuchsin kiềm: 0,3g 39 2/ Phenol: 5g Nước cất: 95 ml Trộn dụng dịch dung dịch lại pha loãng lần ❖ Xanh Methylen 0,001% Xanh methylen: 0,1g Nước cất: 1000ml ❖ Xanh Methylen Loeffler Rượu ethylic: 300ml Xanh methylen: 20g Hòa tan hỗn hợp lọc (1) Dịch lọc (1) 30ml KOH 1%: 1ml Nước cất: 1000ml ❖ Dung dịch lactophenol Phenol kết tinh: 10g Acid lactic: 10g Glycerin: 20g Nước cất: 10ml ❖ Tím gentian - Cơng thức: 1/ Gentian violet: 1g Rượu ethylic 960: 10ml 2/ Phenol tinh khiết 5g Nước cất 100ml - Cách pha chế: Dùng đũa thuỷ tinh khuấy cho tan hết gentian violet rượu Trộn dung dịch (1) (2) lọc Để dịch lọc lọ màu - Ghi chú: Hòa phần cồn với thuốc nhuộm cho tan hết cho acid vào, lắc Tiếp tục thêm cồn hết váng kim loại mặt 40 ❖ Dung dịch lugol - Công thức: Iod tinh thể : 1g KI: 2g - Cách pha chế: Nước cất: 300 ml Hòa KI vào 5ml nước cất cho tan hết cho iod tinh thể vào Bổ sung đủ 300ml nước sau iod tan hết Cồn 95% Aceton Nguyên liệu - Ống thạch nghiêng cấy loài vi sinh vật sau: Bacillus subtilis, Sarcina lutea Penicillum italicum, Aspergillus niger Streptomyces grisea Saccharomyces cerevisiae - Môi trường Hansen nuôi cấy nấm men Saccharomyces cerevisiae - Môi trường cao thịt – pepton dịch thể cấy E.Coli - Nước cất vô trùng Dụng cụ - Lame, lamelle - Giấy thấm - Que cấy, đèn cồn - Giấy lọc - Bocan, cầu thủy tinh - Bình tia - Tăm tre vơ trùng - Kính hiển vi, dầu soi III LÀM TIÊU BẢN TẠM THỜI Các đặc điểm tiêu tạm thời - Thao tác làm tiêu đơn giản, tiến hành nhanh 41 - Quan sát trạng thái sống tế bào như: chuyển động tiên mao, sinh sản, hình thành bào tử - Chỉ sử dụng lần bỏ Cách lấy giống vi sinh vật để làm tiêu - Đốt đèn cồn lên - Một tay cầm ống nghiệm chứa vi sinh vật - Tay lại cầm que cấy để khử trùng - Kéo nút khỏi ống nghiệm khử trùng miệng ống nghiệm - Đưa que cấy vào lấy sinh khối vi sinh vật - Rút que cấy ra, khử trùng miệng ống nghiệm - Đưa giọt môi trường (hoặc sinh khối) vi sinh vật đầu que cấy đặt vào lame để làm vết bôi - Khử trùng lại que cấy Cách làm tiêu giọt ép - Dùng que cấy lấy giống vi sinh vật để làm vết bôi - Đặt lamelle lên giọt canh trường, tránh tạo bọt khí - Quan sát kính hiển vi - Chú ý: Nếu giọt dịch nhiều, tràn ngồi lamelle dùng giấy thấm bớt nước Nếu cần quan sát lâu dùng vaselin bơi quanh mép lamelle để giọt dịch khỏi bị khô Cách làm tiêu tạm thời có nhuộm màu a Nguyên tắc Phương pháp sử dụng thuốc nhuộm không độc vi sinh vật pha loãng nồng độ đảm bảo cho vi sinh vật sống hoạt động sau nhuộm màu b Cách nhuộm: Có cách nhuộm vi khuẩn sống: Cách 1: - Nhỏ giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0,001% lên lame - Nhỏ giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm 42 - Đậy lamelle - Quan sát tiêu vật kính X10 X40 Cách - Nhỏ giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0,001% lên lame - Dùng que cấy dàn thành vùng nhỏ để khô tự nhiên - Nhỏ giọt dịch vi khuẩn lên vùng màu khô - Quan sát tiêu với vật kính X10 X40 IV LÀM TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH Các đặc điểm tiêu cố định Quan sát tiêu cố định phương pháp phổ biến nghiên cứu vi sinh vật học có ưu điểm sau: - Tuy thao tác phức tạp tiêu có máu sắc đẹp, giữ lâu - Cho phép ta quan sát rõ ràng hình dạng cấu tạo tế bào, dễ dàng đếm số lượng vi sinh vật - Không sợ lây nhiễm làm việc với vi sinh vật gây bệnh Các bước tiến hành tiêu cố định a Làm vết bôi - Chọn lame khô - Lấy sinh khối vi sinh vật cho vào lame - Để vết bôi khô tự nhiên khơng khí - Chú ý: Lượng vi sinh vật lấy vừa phải Vết bơi trịn gọn, thật mỏng Các tế bào vi sinh vật dàn dễ quan sát b Cố định vết bôi - Việc cố định vết bơi nhằm mục đích sau: Giết chết vi sinh vật để chúng dễ bắt màu an toàn tiếp xúc Gắn chặt vi sinh vật vào lame để lúc rửa không bị trôi mẫu - Các cách cố định: Cố định nhiệt 43 Là phương pháp đơn giản phổ biến Dùng kẹp gỗ hay kẹp sắt để kẹp lame Hơ mặt lam lửa đèn cồn, tránh không để nóng Cố định hóa chất: Cách phức tạp không gây biến dạng tế bào, không gây biến đổi cấu trúc tế bào không làm đứt tiên mao Dùng hóa chất rượu aceton để cố định vết bôi Cách cố định: Nhúng vết bôi vào rượu Với rượu ethylic ngâm – 15 phút, với rượu methylic ngâm – phút Ngâm vết bôi vào dung dịch aceton 15 phút Nhỏ vài giọt rượu 95% lên vết bôi Đốt cháy dậy tắt Làm vài lần để khô Nhuộm màu tiêu cố định a Nguyên tắc - Sử dụng thuốc nhuộm có khả thẩm thấu qua màng tế bào kết hợp với thành phần khác tế bào thành hợp chất màu đặc trưng bền vững - Tùy theo mục đích nghiên cứu khả bắt màu khác thành phần tế bào mà chọn loại thuốc nhuộm cách nhuộm cho phù hợp - Có cách nhuộm chính: Nhuộm đơn: Chỉ dùng loại thuốc nhuộm tiêu Nhuộm kép: Dùng đồng thời hay nhiều loại thuốc nhuộm tiêu b Cách nhuộm - Đặt tiêu lên cầu thủy tinh - Nhỏ vào vết bôi vài giọt Fuchsin, để yên – phút - Rửa vết bơi cách nghiêng lame, dùng bình tia xịt nước cho chảy nhẹ qua vết bôi không cịn màu - Dùng giấy thấm khơ tiêu hơ nhẹ tiêu đèn cồn - Quan sát tiêu vật kính X40 X100 dùng dầu soi V QUAN SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC NHÓM VI SINH VẬT 44 Quan sát đặc điểm sinh học vi khuẩn (Bacteria) a Các đặc trưng sinh học cần quan sát vi khuẩn - Các kiểu hình dạng tế bào - Các kiểu liên kết tế bào - Khả di động - Khả hình thành bào tử - Nhuộm Gram b Cách quan sát Quan sát cầu khuẩn - Làm tiêu giọt ép với ống thạch nghiêng cấy vi khuẩn Sarcina lutea - Quan sát tiêu kính hiển vi với vật kính X40 - Yêu cầu: Vẽ hình dạng tế bào, kiểu liên kết tế bào Nhận xét chuyển động tế bào Quan sát trực khuẩn - Làm tiêu giọt ép với vi khuẩn E.Coli môi trường dịch thể (1) - Làm tiêu nhuộm đơn với vi khuẩn Bacillus subtilis nuôi cấy thạch nghiêng (2) - Yêu cầu: Tiêu 1: quan sát vật kính X40 Vẽ hình, nhận dạng chuyển động tế bào Tiêu 2: quan sát vật kính X40 X100 dầu soi Vẽ hình nhận xét hình dạng tế bào; hình dạng, số lượng vị trí bào tử tế bào Quan sát xoắn khuẩn - Làm tiêu cố định nhuộm màu với bựa để quan sát vi khuẩn Vibrio, Spirochae, Spirillum - Chú ý: dùng tăm lấy bựa làm vết bôi - Lấy bựa vừa phải, dàn quan sát - Quan sát vật kính X40 X100 dầu soi - Vẽ hình dạng xoắn khác vi khuẩn (xoắn từ vòng đến nhiều vòng) 45 Quan sát đặc điểm sinh học xạ khuẩn (Actinomycetes) a Các đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát - Hình dạng bào tử - Đặc điểm cuống sinh bào tử - Phương thức hình thành chuỗi bào tử b Cách quan sát - Làm tiêu giọt ép với Streptomyces grisea thạch nghiêng (khi làm tiêu phải dùng que cấy đầu nhọn dìm khuẩn ty xạ khuẩn giọt nước tách rời sợi, sau đậy lamelle quan sát) - Làm tiêu nhuộm đơn với xạ khuẩn - Yêu cầu: Quan sát tiêu vật kính X10 X40 Vẽ hình nhận xét hình dạng chung xạ khuẩn - Làm tiêu quan sát cuống sinh bào tử: Cấy xạ khuẩn vào môi trường đĩa petri Dùng lamelle cắm vào bề mặt thạch nghiêng góc 450 Đậy đĩa petri thích hợp ủ nhiệt độ thích hợp Sau lấy lamelle ra, đậy lên lame quan sát - Làm tiêu quan sát bào tử Dùng lame ấn nhẹ lên mặt thạch có xạ khuẩn mọc Quan sát kính hiển vi với vật kính X100 Vẽ hình nhận xét cuống sinh bào tử bào tử xạ khuẩn Quan sát đặc điểm sinh học nấm mốc (Molds) a Các đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát - Đặc điểm sợi nấm: màu sắc, có vách ngăn hay khơng? - Đặc điểm quan sinh sản: hình dạng, cách xếp phận quan sinh sản - Hình dạng, cấu tạo, cách xếp bào tử b Cách quan sát - Làm tiêu nấm mốc không nhuộm màu Nhỏ giọt lactophenol lên lame 46 Dùng que cấy lấy khuẩn lạc nấm Penicillum Aspergillus niger dàn mỏng Đậy lamelle quan sát vật kính X10 X40 40 Vẽ hình nhận xét chung hình dạng sợi nấm; vị trí, hình dạng, cách xếp chung bào tử, thể bình, cuống thể bình, cuống bào tử đính loại nấm mốc - Làm tiêu nấm mốc nhuộm màu: Nhỏ giọt dung dịch xanh cotton lên lame Lấy sợi nấm dàn lame Đậy lamelle quan sát vật kính X40 Vẽ hình cấu tạo sợi nấm quan sinh sản Quan sát đặc điểm sinh học nấm men (Yeasts) a Những đặc điểm sinh học cần quan sát - Hình thái, kích thước tế bào nấm men - Sự nẩy chồi nấm men - Hình dạng, số lượng bào tử túi bào tử b Cách quan sát - Làm tiêu nhuộm đơn nấm men cấy môi trường xanh methylen Loffler - Yêu cầu: Quan sát kính hiển vi vật kính X40 X100 Vẽ hình thích màng tế bào chất, khơng bào tế bào THỰC HÀNH 1) Thực hành làm tiêu giọt ép vi khuẩn E.Coli Vẽ hình thích đặc điểm quan sát 2) Thực hành làm tiêu nhuộm đơn với vi khuẩn B.subtilis, vi khuẩn bựa Vẽ hình thích đặc điểm quan sát 3) Làm tiêu nhuộm màu A.niger Vẽ hình thích quan mang bào tử chúng CÂU HỎI Thực hành lấy giống vsv làm tiêu bản? 47 Thực hành làm tiêu giọt ép? Thực hành làm tiêu tạm thời có nhuộm màu? Thực hành làm tiêu cố định? Nhận diện vsv học? 56 trường hợp xác định MPN hệ dãy nồng độ ống nghiệm lặp lại (hệ x hay ống nghiệm) Nếu nghi ngờ số lượng Coliforms mẫu cao, phải sử dụng mẫu có bậc pha lỗng cao Ủ ống nghiệm 370C ± 10C 24h ± 1h Ghi nhận số ống có sinh Với ống khơng sinh hơi, tiếp tục ủ 370C ± 10C 24h ± 1h Sau 48h ± 2h, loại bỏ ống khơng sinh hơi, (-) tính Ghi nhận số lượng ống (+), (-) tính Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu từ ống LSB (+) sang ống có chứa canh BGBL ủ 37oC ± 10C 24h ± 1h Ghi nhận số ống có sinh Với ống khơng sinh hơi, tiếp tục ủ 370C ± 10C 24h ± 1h Sau 48h ± 2h, loại bỏ ống khơng sinh hơi, (-) tính Ghi nhận số lượng ống (+), (-) tính • Cách đọc kết Ở tất trường hợp nêu trên, từ số lượng ống nghiệm có (+) (sinh hơi/mơi trường ni cấy bị đục) độ pha loãng mẫu, dùng Bảng MPN thích hợp (bảng x tức ống nghiệm) để tính mật độ vi sinh vật mẫu biểu diễn dạng trị số MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha lỗng Ví dụ: nồng độ 10-1 có ống dương tính, 10-2 có ống dương tính, 10-3 có ống dương tính, ta số ống dương tính 0, tra bảng MPN cho kết 43 MPN/ml Nếu nồng sử dụng khác so bảng tra Ta thực công thức MPN (tra bảng) x 10-1/ độ pha lỗng thấp = MPN/ml Ví dụ: nồng độ 10-3 có ống dương tính, 10-4 có ống dương tính, 10-5 có ống dương tính, ta số ống dương tính 0, tra bảng MPN ta 43 MPN/ml Kết quả: 43 (tra bảng) x 10-1/ 10-3 = 300 MPN/ml CÂU HỎI VÀ BÀI TẬP 1) Trình bày khái niệm nguyên tắc phương pháp MPN 2) Nêu định nghĩa coliform tổng số 4) Tóm tắt phương pháp MPN 5) Thực hành phương pháp MPN? 57 6) Cách đọc kết phương pháp MPN? 7) Vai trò ống durham? 8) so sánh phương pháp MPN phương pháp khác? BẢNG MPN BẢNG TRA MPN DÙNG CHO LOẠT ỐNG NGHIỆM Ở NỒNG ĐỘ PHA LOÃNG LIÊN TIẾP Số lượng ống dương tính Độ pha lỗng 10-1 10-2 10-3 0 0 0 Số MPN/ml Số lượng ống dương tính Độ pha lỗng Số MPN/ml 10-1 10-2 10-3