Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng của prostaglandin đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và khả năng sinh trưởng của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng gà

Luận văn thạc sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng của prostaglandin đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và khả năng sinh trưởng của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng gàLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng của prostaglandin đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và khả năng sinh trưởng của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng gàLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng của prostaglandin đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và khả năng sinh trưởng của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng gàLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng của prostaglandin đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và khả năng sinh trưởng của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng gàLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng của prostaglandin đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và khả năng sinh trưởng của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng gàLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng của prostaglandin đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và khả năng sinh trưởng của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng gàLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng của prostaglandin đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và khả năng sinh trưởng của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng gàLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng của prostaglandin đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và khả năng sinh trưởng của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng gàLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng của prostaglandin đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và khả năng sinh trưởng của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng gàLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng của prostaglandin đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và khả năng sinh trưởng của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng gàLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng của prostaglandin đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và khả năng sinh trưởng của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng gàLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng của prostaglandin đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và khả năng sinh trưởng của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng gàLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng của prostaglandin đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và khả năng sinh trưởng của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng gàLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng của prostaglandin đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và khả năng sinh trưởng của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng gàLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng của prostaglandin đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và khả năng sinh trưởng của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng gàLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng của prostaglandin đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và khả năng sinh trưởng của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng gàLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng của prostaglandin đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và khả năng sinh trưởng của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng gàLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng của prostaglandin đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và khả năng sinh trưởng của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng gàLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng của prostaglandin đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và khả năng sinh trưởng của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng gàLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng của prostaglandin đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và khả năng sinh trưởng của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng gàLuận văn thạc sĩ: Nghiên cứu ảnh hưởng của prostaglandin đến các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu và khả năng sinh trưởng của tế bào hạt ở tầng trước tế bào trứng gà

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÁI NGUYÊN - 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM Mã số: 60.42.01.14 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học THÁI NGUYÊN - 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực chưa công bố, sử dụng để bảo vệ học vị Các thông tin, tài liệu trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc năm 2014 Tác giả i LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận văn này, nỗ lực thân, nhận giúp đỡ quý báu, bảo tận tình thầy hướng dẫn TS ực luận văn Nhân dịp hồn thành luận văn tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc thầy hướng dẫn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành quan tâm giúp đỡ thầy PGS.TS Lê Ngọc Cơng tồn thể thầy giáo, cán bộ, nhân viên khoa Sinh - KTNN, khoa sau đại học - Đại học sư phạm Thái Nguyên giúp đỡ tơi q trình thực đề tài nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo cán viên chức đơn vị: Phịng phân tích sinh hóa - Phịng khám Đa khoa Trung tâm Thái Ngun, Phịng thí nghiệm Sinh lý người động vật, Khoa SinhKTNN - Trường Đại học Sư phạm - Đai học Thái Nguyên, Phịng thí nghiệm cơng nghệ gen động vật - Đại học Chiết Giang Trung Quốc tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ nhiệt tình cho tơi q trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp, người thân tạo điều kiện, động viên tơi q trình thực đề tài hồn thành luận văn Trong q trình thực luận văn hạn chế thời gian, kinh phí trình độ chun mơn nên khơng tránh khỏi sai sót Rất mong nhận ý kiến đóng góp q báu thầy giáo, nhà khoa học bạn bè Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, 15 tháng năm 2014 Tác giả ii LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tính chất lý hố học chức máu 1.1.1 Tính chất lý học, chức thành phần máu 1.1.1.1 Hồng cầu 1.1.1.2 Hemoglobin (Hb) 1.1.1.3 Bạch cầu 1.1.2 Tính chất sinh hóa học máu 1.1.2.1 Protein huyết tiểu phần protein huyết 1.1.2.2 Hệ số A/G 10 1.2 10 10 11 13 16 1.2.5 17 (EGF) 17 kemia inhibitory factor (LIF) 18 iii (SCF) 18 1.3 (PG) 19 1.3.1 Lịch sử nghiên cứu 19 1.3.2 Sinh tổng hợp PG 20 1.3.3 Phân loại 21 1.3.4 Cách gọi tên PG 22 1.3.5 Tác dụng sinh lý 22 1.4 23 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Vật liệu nghiên cứu 25 2.2 Địa điểm nghiên cứu 25 2.3 Thiết bị hóa chất 25 2.3.1 Thiết bị 25 2.3.2 Hóa chất 25 2.4 Phương pháp nghiên cứu 27 2.4.1 Phương pháp tách chiết lấy máu 27 2.4.2 Phương pháp phân tich tiêu sinh lý, sinh hóa máu 27 2.4.3 Phương pháp xử lý nuôi cấy nguyên tế bào trứng 27 2.4.4 Phương pháp xử lý nuôi cấy tế bào hạt 27 2.4.5 Phương pháp hóa miễn dịch PCNA 28 2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu 28 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Ảnh hưởng PG đến tiêu sinh lý, sinh hóa máu sinh sản tế 29 3.1.1 Ảnh hưởng PG đến tiêu sinh lý máu 29 3.1.2 Ảnh hưởng PG đến tiêu sinh hóa máu 30 3.1.3 Ảnh hưởng PG đến khả sinh sản tế bào hạt 31 33 iv 3.2.1 Ảnh hưởng PG đến phát triển độ dày màng tế bào hạt 34 3.2.2 Ảnh hưởng PG độ dày tầng màng tế bào 36 3.2.3 Ảnh hưởng PG tới khả sinh trưởng số lượng tế bào hạt 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38 Kết luận 38 Đề nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CS : EGF : Epidermal growth factor Hb : Hemoglobin LIF : Leukemia inhibitory factor LWF : LYF : PG : Protaglandin SCF : Stem cell factor SWF : SYF : iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Ảnh hưởng PG đến số lượng hồng cầu, bạch cầu hàm lượng huyết sắc tố máu phôi gà 29 Bảng 3.2 Ảnh hưởng PG đến hàm lượng protein tiểu phần protein huyết 30 Bảng 3.3 Ảnh hưởng PG đến khả sinh sản tế bào hạt 31 v DANH MỤC CÁC HÌNH 1.1 Tế bào hạt (Granulosa Cell) 17 (PG) 19 Hình 1.3 Sơ đồ sinh tổng hợp prostaglandin 20 Hình 1.4 Acid prostanoic 21 Hình 1.5 PGE2 21 Hình 1.6 PGF2 22 3.1 Ảnh hưởng PG đến sinh sản tế bào hạt 32 Hình 3.2 Đặc điểm hình thái tế bào hạt tách từ tế bào hạt màu vàng nhỏ (SYF) sau 24h nuôi cấy 33 3.3 Ảnh hưởng PG đến độ dày màng tế hạt sau 24 ni cấy…………………………………………………………….…34 Hình 3.4 Hình thái tầng tế bào hạt, tầng màng tế bào tầng trước tế bào trứng sau 24 35 3.5 Ảnh hưởng PG đến độ dày màng tế trứng sau 24 nuôi cấy 36 3.6 PG nuôi cấy sau 24 số lượng tế bào hạt tầng trước tế bào trứng thay đổi 37 vi 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp tách chiết lấy máu Trứng gà mang vào ấp nhiệt độ 38oC, độ ẩm 60% sau ngày ấp tiến hành tra dung dịch PG với nồng độ 10 ng/ml, tiếp tục ấp đến 18 ngày tiến hành lấy máu phân tích số sinh lý, sinh hóa máu 2.4.2 Phương pháp phân t h tiêu sinh lý, sinh hóa máu - Xác định lượng hồng cầu buồng đếm Newbauer [4] - Định lượng huyết sắc tố huyết sắc kế Shali [4] - Xác định protein tổng số huyết phản ứng Grornall [5] - Xác định tiểu phần protein huyết phương pháp điện di thạch aga 1% [12] 2.4.3 Phương pháp xử lý nuôi cấy nguyên tế bào trứng Giống gà Hyline giai đoạn sinh sản đ lựa chọn, sau giết mổ tiến hành mổ chọn tế bào trứng có đường kính: SWF 1-3 mm, LWF 3-5 mm, SYF 5-6 mm, LYF 6-9 mm [25] Loại bỏ dịch treo r dung nước muối sinh lý 0,9% diệt trùng, tiến hành nuôi cấy nuôi cấy 24 lỗ, lỗ nuôi cấy tế bào trứng tra 1ml dịch nuôi cấy M199 (Hyclone, Utah) bổ sung 10 μg/ml insulin, μg/ml transferrin and 3×10-8 M selenite (Sigma, St Louis, MO, USA) Nhóm thí nghiệm bổ sung 10 ng/ml PG (Sigma, St Louis, MO, USA) Sau 24 nuôi cấy, tế bào trứng cố định dung d 4% formaldehyde, cố định tế bào trứng sau 24h tiến hành bước nghiên cứu cấu tạo tổ chức học 2.4.4 Phương pháp xử lý nuôi cấy tế bào hạt Tế bào trứng màu vàng (SYF 5-6 mm) rửa M199 lạnh (Hyclone, Utah) Sau tiến hành bóc tách tế b lòng 27 xử lý phân tách thành tế bào đơn nồng độ 12.5 ug/ml collagenase Sau phân tách thành tế bào đơn tế bào hạt nuôi cấy ni cấy 96 (Nunc, Denmark) với mật độ 5×104/lỗ, tra 200 μl M199 bổ sung 0,5% FCS (FCS, GIBCO BRL) Tế bào nuôi cấy điều k 95% atmosphere, 5% CO2 nhiệt độ 39oC Sau 16h nuôi cấy, tế bào sinh sản bám chặt vào đáy nuôi cấy tiếp tục tiến hành đổi 0,5% FCS dung dịch ITS (nhóm đối chứng) bổ sung 10 μg/ml insulin, μg/ml transferrin and 3×10-8 M selenite (Sigma, St Louis, MO, USA) Nhóm thí nghiệm dùng PG (hãng Sigma) với nồng độ 1- 10 ng/ml (phương thức nuôi cấy độc lập) 2.4.5 Phương pháp hóa miễn dịch PCNA Các tế bào sau 24 nuôi cấy cố định 4% formaldehyte 30 phút để nhiệt độ phịng, sau xử lý 3% H2O2 làm kiệt chất nội sinh peroxidase Hóa miễn dịch học PCNA sử dụng theo phương pháp Jin cs (2010) [18] Sử dụng kháng thể đa dòng mouse anti-PCNA (Boster Co., Wuhan, China) Nhân tế bào dương tính bắt mầu nâu nhạt Chỉ số PCNA- LI tính dựa tế bào có nhân màu nâu nhạt chia cho tổng số tế bào đếm ảnh chụp 2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu Mỗi nhóm thí nghiệm lặp lại lần, nhóm nghiệm tra lỗ, lỗ tiến hành chụp ảnh Số liệu thu xử lý phần mền SAS phiên 6.12, với P 0,05) Sự tăng, giảm hàm lượng Hb không theo quy luật Cụ thể: nồng độ PG: 1-10-100 ng/ml hàm lượng Hb tương ứng là: 9,24 - 9,15 - 9,27 Theo Lê Văn Liễn cs (2003) nghiên cứu đối tượng gà Ri, gà H’Mông, gà Tè, gà Tam Hoàng gà Kabir 15 tuần tuổi có số lượng hồng cầu tương ứng là: 2,35 - 2,78 - 1,86, 2,36 - 2,11 triệu/ mm3, số lượng bạch cầu tương ứng 24,05 - 28,30, 21,74 - 24,07 - 22,30 nghìn/mm3 [8] Số lượng hồng 29 cầu phụ thuộc vào tuổi, tính biệt, chế độ dinh dưỡng nhiệt độ môi trường Số lượng bạch cầu phụ thuộc vào thuộc vào tình hình bệnh tật, điều kiện ngoại cảnh, nuôi dưỡng gương phản ánh tình hình sức khỏe gia cầm [8] PG khơng làm tăng số lượng : cầu, bạch cầu hàm lượng Hemoglobin máu Còn tăng giảm hàm lượng Hb khơng theo quy luật, tác động khác, khơng hồn tồn chịu ảnh hưởng PG 3.1.2 Ảnh hưởng PG đến tiêu sinh hóa máu Albumin thành phần chủ yếu cấu tạo nên protein huyết Chính mà trình sinh trưởng phát triển động vật, hàm lượng tương đối hay tỷ lệ phần trăm albumin thường biến động đồng thời với hàm lượng protein huyết Để đánh giá ảnh hưởng PG đến tiêu sinh hóa máu, chúng tơi tiến hành phân tích tiêu hàm lượng protein tiểu phần protein huyết Kết thu được trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng PG đến hàm lƣợng protein tiểu phần protein huyết (gam/lít) Nồng độ (ng/ml) Chỉ tiêu X mx Protein 50,44±1,48 toàn phần 10 100 Cv% X mx Cv% X mx Cv% X mx Cv% 8,75 51,50±3,25 7,45 52,40±1,60 7,10 51,20±1,32 7,70 Albumin 20,20±1,30 11,31 21,33±1,50 11,20 21,35±1,30 11,17 21,27±2,34 12,26 α5,850±2,20 14,00 globulin 5,92±0,37 13,05 5,96±0,32 14,28 5,80±0,35 12,90 βglobulin 6,60±0,32 13,25 7,08±0,25 13,50 7,28±0,31 14,30 7,20±0,20 13,65 γglobulin 8,15±0,50 12,20 8,45±0,35 12,70 8,40±0,50 14,25 8,25±0,45 13,25 A/G 0,980 0,992 0,993 30 1,000 Từ bảng kết cho thấy: hàm lượng protein toàn phần, hàm lượng albumin tiểu phần globulin nhóm đối chứng nhóm thí nghiệm khơng có sai khác rõ rệt (P>0,05) Theo Kalior Lê Khắc Thận (trích dẫn Trần Thanh Vân cs, 1997) protein huyết phụ thuộc vào hướng sản xuất giống, cường độ đẻ Giống vịt hướng trứng có hàm lượng protein huyết cao vịt kiêm dụng vịt chuyên thịt [13] Nguyễn Thị Minh cs, 2001 γ-globulin giữ vai trị quan trọng, có chứa kháng thể huyết thanh, protein miễn kháng khả kháng bệnh c ng - tiêu chí để đánh giá khả kháng bệnh, thích nghi với điều kiện mơi trường [9] Hệ số A/G khơng có chênh lệch : 1-100,992; 0,993; 1,00 (P > 0,05), kết luận rằng: PG khơng có ảnh hưởng đến tiêu sinh hóa máu nói chung 3.1.3 Ảnh hưởng PG đến khả sinh sản tế bào hạt Tiến hành nuôi cấy tế bào hạt, sau nuôi cấy 16 giờ, quan sát thấy tế bào bám chặt vào đáy ni cấy, hình thành đường gân nhỏ, hình thái tròn nhỏ , quan sát thấy tế bào hạt bám chặt dàn khắp đáy Sau ni cấy, xuất hình thái lập phương rõ, hình thành tầng đơn duỗi thẳng đan xen lẫn nhau, hình thái tế bào hạt rõ ràng, cảm quan hình khối tăng, số lượng tế bào hạt tăng mạnh (Hình 3.2) Bảng 3.3 Ảnh hƣởng PG đến khả sinh sản tế bào hạt Chỉ tiêu đánh giá Nồng độ PG (ng/ml) 10 100 Số lượng tế bào/mm2 935,25 1214,54 1431,50 1285,45 Hệ số PCNA (%) 61,45 69,04 74,15 70,41 31 Ảnh hưởng PG đến khả sinh sản tế bào hạt chúng tơi thể Hình 3.2 Tra PG nồng độ từ 1-100ng /ml thấy số lượng tế bào hạt lơ thí nghiệm tăng so với lơ đối chứng (p