Hiện nay, vấn đề sử dụng hóa chất nói chung và chất bảo quản nói riêng trong sản xuất hàng hóa, đặc biệt trong thực phẩm, rất phổ biến mà không được hoặc được kiểm soát rất lỏng lẻo. Cần có các kiểm chứng những độc hại của chúng có thể gây nên đối với sức khỏe người tiêu dùng và cả đối với môi trường.Sodium Benzoate và Propyl Gallate là 2 chất thường xuyên được sử dụng trong đời sống tuy nhiên 1 số nghiên cứu cho thấy độc tính của chúng không hề thấp, cần nghiên cứu là xác định giới hạn cho phép sử dụng hàng ngày
BÁO CÁO ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA CHẤT BẢO QUẢN THỰC PHẨM (PROPYL GALLTE & SODIUM BENZOAT) TRÊN PHÔI CÁ NGỰA VẰN I Mở đầu Lí chọn đề tài - Hiện nay, vấn đề sử dụng hóa chất nói chung chất bảo quản nói riêng sản xuất hàng hóa, đặc biệt thực phẩm, phổ biến mà khơng kiểm sốt lỏng lẻo Cần có kiểm chứng độc hại chúng gây nên sức khỏe người tiêu dùng môi - trường Sodium Benzoate Propyl Gallate chất thường xuyên sử dụng đời sống nhiên số nghiên cứu cho thấy độc tính chúng khơng thấp, cần nghiên cứu xác định giới hạn cho phép sử dụng hàng ngày Đặc điểm Sodium Benzoate Propyl Gallate Đặc điểm Sodium Benzoate 𝐶6 𝐻5 𝐶𝑂𝑂𝑁𝑎 Propyl Gallate 𝐶12 𝐻12 05 144,1 đvC 212,2 đvC E211 Muối từ Natri hydroxit + Axit Benzoic E310 Ester n-propyl 3,4,5trihydroxylbenzoic hay axit galic - Chất bột màu trắng xám - Chịu nhiệt - Tan chất béo, tan nước Công thức hóa học Khối lượng phân tử Ký hiệu Bản chất Tính chất vật lý - Tinh thể bột trắng Khơng mùi Tan tốt nước Nhóm chất, cơng dụng Chất kháng sinh, kìm hãm phát triển vi khuẩn, nấm môi trường axit, bảo quản thực phẩm Chất chống oxi hóa thực phẩm có hàm lượng chất béo cao, dược phẩm, mỹ phẩm ADI (Aceptable Daily Intake) mg/kg/ngày 0,5 mg/kg/ngày Ý nghĩa đề tài - Khoa học: cung cấp tư liệu thực nghiệm độc tính Sodium Benzoate Propyl Gallate Thực tiễn: Khuyến cáo sử dụng chất bảo quản hợp lí để không gây ảnh hưởng tới sức khỏe người II Nội dung nghiên cứu Đối tượng - Thí nghiệm tiến hành phôi cá ngựa vằn, giai đoạn sớm tốt sau thụ tinh Phôi/ấu thể - - Cá trưởng thành (Nguồn ảnh: Internet) Phân loại cá ngựa vằn: Danh pháp phần: Hippocampus comes (Cantor, 1850) Loài: H comes Chi: Hippocampus Họ: Syngnathidae Bộ: Gasterosteiformes Lớp: Actinopterygii Ngành: Chrodata Giới: Amimalia Đặc điểm: Cá trưởng thành dài khoảng 3-4 cm, có sọc vằn song song chạy dọc thể, có màu sắc khác (xanh, đen, đỏ…) Trứng cá ngựa vằn đường kích trung bình mm Phôi ấu thể suốt - Cá ngựa vằn sinh vật mơ hình phổ biến sử dụng nhiều phịng thí nghiệm giới với nhiều đặc điểm thuận lợi cho nghiên cứu.Số lượng phôi lớn nhờ cá trưởng thành sinh sản nhiều thường xuyên Phôi bao bọc lớp vỏ suốt, giúp dễ dàng quan sát thay đổi hình thái ấu thể cá Trình tự hệ gen cá ngựa vằn giải mã đầy đủ, có 12 nghìn gen tương đồng với hệ gen người khoảng 70% gen người có gen tương đồng cá ngựa vằn Phôi cá ngựa vằn 4-5 ngày sau thụ tinh chưa coi động vật khơng gặp phải vấn đề đạo đức ràng buộc quy định với động vật thí nghiệm - Dụng cụ hóa chất STT Tên Hóa chất Dụng cụ Cơng dụng Soium Benzoat Propyl Gallte Nước Kính hiển vi soi Máy ảnh Pipet 5ml, 10 ml cái/loại 13 đĩa 14 ống Bơm pipet Đĩa 24 giếng Ống Falcon 15ml Số lượng Pha lỗng hóa chất Kiểm tra mẫu Chụp kết Hút mơi trường Ni mẫu Đựng hóa chất pha Phương pháp tiến hành quy trình thí nghiệm Gồm giai đoạn: - Ghép cá bố mẹ : (Chiều ngày 25/11/2017) Ghép cặp cá bố mẹ: Chọn cặp cá đực khỏe mạnh, có khả sinh sản bình thường (qua q trình theo dõi) Chúng tơi chọn cặp cá bố mẹ để đảm bảo đủ số lượng trứng cho thí nghiệm chất Các cặp cá để riêng bể nhỏ, có lưới/rổ thưa, ngăn cá bố mẹ ăn trứng - Thu phôi: (Sáng 26/11/2017) Đưa cá bố mẹ quay bể nuôi cũ, thu phôi - Rửa phôi 3-5 lần nước Chọn lọc phôi sạch, khỏe mạnh, giai đoạn tế bào - Phơi nhiễm hóa chất: Chọn phơi/1 giếng/1 nồng độ/1 đĩa với giếng 1ml môi trường pha trước Đây xem giai đoạn 0h sau thụ tinh Theo bảng sau: ĐC ĐC ĐC ĐC H H H H H H H H H H H H Đĩa 24 giếng H H H H H H H H Với ĐC: đối chứng; H: Hóa chất - Kiểm tra mẫu thay môi trường: (sau 24h) Qua giai đoạn sau 24h 48h-72h-96h, kiểm tra phát triển phôi kính hiển vi soi nổi, gồm khả sống chết dị dạng xuất Sau thay môi trường cho giếng, hút bỏ ~ 0,5 ml môi trường cũ, bổ sung ~0,5ml môi trường Tiêu chí kiểm tra: Thời gian sau thụ tinh 0h 24h Mẫu 48h Bình thường 72h 96h 24h-48h Chết 72h-96h Dị dạng - 48h-96h Đặc điểm nhận biết Phôi sạch, giai đoạn tế bào Đi tách khỏi nỗn hồng Sắc tố hình thành, tập trung nhiều mắt Ấu thể nở, bơi tự do, quan sát thấy tim đập Tim đập, quan sát rõ hình dạng bình thường quan Phôi đông tụ, màu trắng đục đen, không rõ cấu trúc Tim không đập - Hoại tử nỗn hồng - Hoại tử đầu - Phù màng bao tim - Tụ máu - Cong cột sống - Dị tật Đánh giá, phân tích kết III Kết thảo luận Mẫu đối chứng: 1-2 mm 1-2mm 24h 0h cm cm 48h 72h 1,5 cm 96h Các mẫu phơi nhiễm hóa chất chết qua thời gian: 1-2 mm 1-2 mm 24h 48h 1-2 mm 1-2 mm 72h 96h Sodium Benzoat - Thí nghiệm phơi nhiễm với Sodium Benzoat thực nồng độ: 100 mg/l, 500 mg/l, 1000 mg/l, 1500 mg/l, 2500 mg/l (mỗi đĩa 24 giếng nồng - độ) Sau 24h sau thụ tinh, soi kính, kiểm tra ghi lại số lượng ấu thể chết, đặc điểm dị dạng (24h, 48h, 72h, 96h) Bảng thể số lượng ấu thể chết phơi nhiễm với Sodium Benzoat 0h 24h 48h 72h 96h 100 mg/l 10 500 mg/l 12 1000 mg/l 11 15 1500 mg/l 10 13 17 2500 mg/l 12 20 20 120% Biểu đồ thể % ấu thể cá chết theo thời gian phơi nhiễm Sodium Benoat nồng độ 100% % chết 80% 60% 50% 40% 20% 0% 0h 24h 48h 72h 96h Thời gian 100 mg/l 500 mg/l 1500 mg/l 2500 mg/l 1000 mg/l Bảng thể số lượng ấu thể dị dạng phơi nhiễm với Sodium Benzoat Nồng độ 100 mg/l 500 mg/l 1000 mg/l 1500 mg/l 2500 mg/l Dị dạng Sống Dị dạng Sống Dị dạng Sống Dị dạng Sống Dị dạng Sống 0h 24h 48h 72h 96h 0 6 20 18 16 14 10 20 17 15 12 20 16 12 5 20 15 10 20 13 0 Biểu đồ thể tỷ lệ dị dạng/sống ấu thể phơi nhiễm Sodium Benzoat 25 Số ấu thể 20 15 10 Dị ng Sống Dị ng 100 mg/l Sống 500 mg/l Dị ng Sống Dị ng 1000 mg/l Sống Dị ng 1500 mg/l Sống 2500 mg/l Nồng độ 0h - 24h 48h 72h 96h Các dạng dị dạng phổ biến: 48h sau thụ tinh: Hoại tử nỗn hồng, hoại tử đầu: cm cm 100 mg/l 1000 mg/l Hoại tử nỗn hồng cm 1500 mg/l cm cm 1000 mg/l Hoại tử đầu 2500 mg/l Hoại tử đầu + nỗn hồng 72h: Hoại tử nỗn hồng: cm cm 1500 mg/l 1000 mg/l 96h: Cong đuôi, cong cột sống, phù mang bao tim, tụ máu, hoại tử nỗn hồng: cm cm 500 mg/l Phù màng tim 1500 mg/l cm 1000 mg/l Phù màng tim + tụ máu 1500 mg/l cm cm Cong đuôi 1000 mg/l Cong cột sống + hoại tử nỗn hồng 1500 mg/l Hoại tử nỗn hồng - Nhận xét: Tác động Sodium Bezoat: o Gây chết : 24h sau phơi nhiễm ảnh hưởng đến khả sống sót phơi Tỷ lệ chết cao nồng độ cao thời gian theo dõi kéo dài Sau 72h, nồng độ 2500 mg/l tỷ lệ chết 100% o Gây dị dạng: Dị dạng xuất rõ từ sau 48h phơi nhiễm tất nồng độ, gồm hoại tử noãn hồng, hoại tử đầu → Phù màng tim, cong → Tụ máu Tỷ lệ dị dạng cao nồng độ cao thời gian theo dõi dài o Ở nồng độ cao, liều lượng gây chết nửa tác động thời gian phơi nhiễm ngắn Propyl gallate - Q trình thí nghiệm tiến hành lần : lần có nồng độ 100mg/l 500mg/l 1000mg/l 2000mg/l Sau 24h kiểm tra ghi lại kết quả, 24h đầu phôi nồng độ từ 500mg/l trở lên chết hết thể bảng sau: Đối chứng Hóa chất Nồng độ Sống Chết Sống Chết 100mg/l 100% 0% 95% 5% 500mg/l 100% 0% 0% 100% 1000mg/l 100% 0% 0% 100% 2000mg/l 100% 0% 0% 100% 10 Biểu đồ thể tỷ lệ chết phơi nhiễm với Propyl Gallte (lần 1) 1.2 Tỷ lệ chết 0.8 0.6 0.4 0.2 0h 24h 100 mg/l 500 mg/l 48h Thời gian 72h 1000 mg/l 96h 2000 mg/l Phôi chết sau 24h nồng độ >=500mg/l 11 Phôi phát triển tốt nồng độ 100mg/l - Tiếp tục theo dõi đến 48h 72h 96h nồng độ 100mg/l phơi phát triển bình thường khơng có dị dạng xảy Đối chứng sau 96h 12 Nồng độ 100mg/l sau 96h - Từ kết phía ta nhận thấy cần tiếp tục tiến hành thí nghiệm lần để xác định xác khoảng nồng độ bắt đồ gây chết hết phôi Lần nồng độ thử nghiệm 100mg/l 200mg/l 400mg/l 500mg/l kết thu sau 24h đầu là: Đối chứng Hóa chất Nồng độ Sống Chết Sống Chết 100mg/l 100% 0% 95% 5% 200mg/l 100% 0% 5% 95% 400mg/l 100% 0% 0% 100% 500mg/l 100% 0% 0% 100% 13 Biểu đồ thể tỷ lệ chết phơi nhiễm với Propyl Gallate (lần 2) 1.2 Tỷ lệ chết 0.8 0.6 0.4 0.2 0h 100 mg/l 24h 200 mg/l 48h Thời gian 400 mg/l 72h 96h 500 mg/l Phôi chết nồng độ >=200mg/l 14 Nồng độ 100mg/l sau 24h Nồng độ 200mg/l phôi sống - Tiếp tục quan sát sau 48h phơi lại nồng độ 200mg/l chết nốt phôi nồng độ 100mg/l sống tốt phát triển bình thường khơng thấy xuất dị dạng - Nhận xét: propyl gallate có khả gây độc lớn cho phôi cá dù nồng độ thấp, chưa xác định xác nồng độ thấp bắt đầu gây chết hết biết nằm khoảng 100 đến 200 mg/l không gây xuất dị dạng VI Kiến nghị lời cảm ơn Kiến nghị - Thiết kế thí nghiệm chuyên sâu với số lượng mẫu lớn lặp lại giai đoạn phát triển khác phôi/ấu thể cá ngựa vằn để đánh giá chi tiết tác động chất phụ gia thực phẩm - Có quy định chặt chẽ việc sử dụng Sodium Benzoat Propyl Gallate, đặc biệt Propyl Gallte với mức độ tác động nghiêm trọng 15 Lời cảm ơn - Chúng em xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Lai Thành – Trưởng môn Tế bào học, khoa Sinh học, trường Đại học KHTN – Giảng viên môn Sinh học Phát triển Cảm ơn thầy dạy cho chúng em kiến thức bổ ích mơn học, tạo điều kiện để chúng em làm quen với cách thiết kế thí nghiệm từ đầu đến cuối - Chúng em cảm ơn anh Kiều Trung Kiên anh chị nhóm Cơng nghệ Tế bào Động vật hướng dẫn chúng em thao tác, trực tiếp giải đáp thắc mắc trình làm thí nghiệm - Xin cảm ơn bạn lớp K60TNSH hỗ trợ để nhóm xếp lịch thí nghiệm phù hợp 16 ... Nhóm chất, cơng dụng Chất kháng sinh, kìm hãm phát triển vi khuẩn, nấm môi trường axit, bảo quản thực phẩm Chất chống oxi hóa thực phẩm có hàm lượng chất béo cao, dược phẩm, mỹ phẩm ADI (Aceptable... thí nghiệm chất Các cặp cá để riêng bể nhỏ, có lưới/rổ thưa, ngăn cá bố mẹ ăn trứng - Thu phôi: (Sáng 26/11/2017) Đưa cá bố mẹ quay bể nuôi cũ, thu phôi - Rửa phôi 3-5 lần nước Chọn lọc phôi sạch,... mg/kg/ngày Ý nghĩa đề tài - Khoa học: cung cấp tư liệu thực nghiệm độc tính Sodium Benzoate Propyl Gallate Thực tiễn: Khuyến cáo sử dụng chất bảo quản hợp lí để khơng gây ảnh hưởng tới sức khỏe người