BÁO CÁO THỰC HÀNH SINH HỌC PHÁT TRIỂN THỬ ĐỘC KHÓI THUỐC LÁ TRÊN PHÔI CÁ NGỰA VẰN I Mục đích Quan sát sự biến đối và phát triển của phôi cá ngựa vằn Khảo sát mức độ độc của thuốc lá với sự phát triển của phôi cá ngựa vằn.
BÁO CÁO THỰC HÀNH SINH HỌC PHÁT TRIỂN THỬ ĐỘC KHĨI THUỐC LÁ TRÊN PHƠI CÁ NGỰA VẰN I.Mục đích - Quan sát biến đối phát triển phôi cá ngựa vằn - Khảo sát mức độ độc thuốc với phát triển phôi cá ngựa vằn II Giới thiệu: Thuốc có nhiều thành phần độc hại: Nicotine Nicotine chất không màu, chuyển thành màu nâu cháy Nicotine hấp thụ qua da, miệng niêm mạc mũi hít vào phổi Nicotine tác động đến hệ thần kinh cách đưa dopamine vào hệ thần kinh kích thích sinh adrenaline Bộ Y tế ban hành Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia thuốc điếu quy định hàm lượng tối đa Nicotin khói 01 điếu thuốc 1,4mg Monoxit carbon (khí CO) Khí CO có nồng độ cao khói thuốc hấp thụ vào máu, gắn với hemoglobin với lực mạnh 20 lần oxy, dẫn đến giảm lượng oxy chuyển đến tổ chức gây thiếu máu tổ chức có lẽ góp phần hình thành mảng xơ vữa động mạch Các phân tử nhỏ khói thuốc Khói thuốc chứa nhiều chất kích thích dạng khí dạng hạt nhỏ Các chất kích thích gây nên thay đổi cấu trúc niêm mạc phế quản dẫn đến tăng sinh tuyến phế quản, tế bào tiết nhầy làm tế bào có lơng chuyển Dự đốn kết quả: Tại nồng độ cao phôi cá ngựa vằn yếu đi, chậm chạp, giảm sức sống, chết, xuất biến dạng liên quan đến hô hấp – tim, vận động bị ảnh hưởng tác động thuốc đến hệ thần kinh (Bài báo tham khảo tác động nicotine đến phôi cá ngựa vằn https://www.researchgate.net/publication/5805785_Effects_of_Nicotine_on_Growt h_And_Development_in_Larval_Zebrafish ) III Dụng cụ thí nghiệm: - Thuốc Vinataba Thăng Long - Ống Falcon 50ml - Đĩa petri - Khay nhựa 24 giếng - Pipet nhựa - Cân - Máy bơm tự chế - Cá ngựa vằn - Kính hiển vi - Nước IV Thực hành ( kéo dài ngày: từ 28/11/2017 đến 3/12/2017) Tiến trình thí nghiệm: Ngày 1: Chuẩn bị hóa chất ghép cá ngựa vằn - Chuẩn bị môi trường: + Dùng thiết bị bơm tự chế để thu lấy khói thuốc lọc giấy lọc + Mang giấy lọc cân (m1)rồi ngâm vào 100ml nước + Mang giấy lọc sau ngâm sấy khô cân lại(m2) để xác định nồng độ thuốc + Thu 100ml nước ngâm pha để nồng độ thuốc mẫu 100mg/l Pha thêm nước để nồng độ chẵn thuận tiện cho việc pha loãng Thăng Long Vinataba m1(mg) 93,7 124,5 m2(mg) 85 113,3 Nồng độ sau ngâm(mg/l) 87 112 V nước pha thêm(ml) 8,75 12 Nồng độ thu được(mg/l) 80 100 + Chia dung dịch ông Falcon pha để đạt gradient nồng độ mong muốn (ghi rõ nồng độ loại thuốc nắp cạnh ống) Nồng độ Thăng Long Nồng độ Vinataba V dd thuốc V nước(ml) V dd thuốc V nước(ml) lá(ml) lá(ml) 15(nồng độ 10) 15 10 45 10 35 20 10 40 20 15(nồng độ 40) 15 30 15 35 30 15(nồng độ 60) 15 40 20 30 40 20 20 60 30 20 50 15 60 30 10 70 35 - Ghép cặp cá ngựa vằn: + Chuẩn bị âu nhựa có lót rổ (để thu phôi lắng xuống dưới, không bị cá trưởng thành ăn mất) + Vớt cá ngựa vằn âu nhựa (mỗi âu có cá đực cá cái) + Đậy nắp để qua đêm, sáng hôm sau đến thu phôi Ngày thứ 2: - Chuẩn bị giếng môi trường: + Chuẩn bị khay chứa giếng, khay ghi nồng độ tên thuốc cạnh khay + Tra nước vào cột giếng để làm đối chứng, tra giếng lại với dung dịch thuốc (mỗi giếng 1ml, lưu ý tra từ nồng độ từ thấp đến cao) - Chuẩn bị phôi cá ngựa vằn: + Vớt cá ra, rửa rửa lại phôi nhiều lần để không bị vi khuẩn bám vào + Hút phôi đĩa petri đưa lên kính soi + Quan sát chọn phơi phân chia nhấy 2-3 lần(4-8 tế bào) sang đĩa petri khác + Hút phôi chấm nhẹ vào giếng, giếng phôi Ngày thứ 3: - Quan sát biểu phôi: + Quan sát ghi lại phát triển phôi, tỉ lệ sống phôi kính hiển vi Phơi chết có màu đen( hình ảnh phần kết quả) - Thay môi trường: Hút 0.5ml dung dịch cũ từ giếng thay 0.5ml dung dịch mới, làm cẩn thận để không hút phôi lên Ngày thứ 4: - Quan sát biểu phôi: + Quan sát ghi lại phát triển phôi tỉ lệ sống phôi kính hiển vi + Vẫn chưa gọi bơi cá thể chưa nước, quan sát sống chết cách nhìn tim - Thay môi trường Ngày thứ 5: - Quan sát biểu phôi: + Quan sát ghi lại phát triển phôi phá vỡ màng phôi tỉ lệ sống phơi kính hiển vi + Quan sát sống chết cách nhìn tim chạm nhẹ đầu pipet vào cá để xem có di chuyển không - Thay môi trường Ngày thứ 6: - Quan sát biểu phôi: + Quan sát ghi lại hình dạng vận động cá tỉ lệ sống chúng kính hiển vi + Cá có khả bơi nên quan sát thấy mặt lưng, dung đầu pipet đẩy nhẹ cá để quan sát (đã quan sát biến dạng cá) V Kết 1.Quy ước: Toàn cột đối chứng (màu xanh) C-chữ số: Chết ngày thứ (ví dụ: C3: chết ngày 3) Đánh dấu x: dị dạng (các dị dạng khác ghi cột thích) Kết quan sát Ngày 3: (ngày quan sát thứ nhất- sau 24h) Dấu hiệu: phôi chết đông tụ (có màu đen soi kính hiển vi, màu trắng nhìn mắt thường) Ngày 4:(sau 48h) Dấu hiệu giống ngày Một số phôi nở sau 48h Xuất số biến dạng phôi đuôi ngắn ( Thuốc Thăng Long, nồng độ 50,60) Dị dạng Ngày 5:(sau 72h) Đối chứng Dấu hiệu: quan sát tim đập, trứng tiếp tục nở cá hoạt động yếu, không bơi Ngày 6:(Sau 96h) Dấu hiệu nhận biết phôi chết: tim ngừng đập Quan sát ghi lại dị dạng cá nồng độ giếng thuốc Thăng Long Thuốc Vinataba không ghi nhận dị dạng Không quan sát ảnh hưởng thuốc với cá di giếng nhỏ Bảng tổng hợp a Thăng Long Nồng Kết độ Chú thích A -11 phơi nở sau72h, cịn lại nở sau 96h B - Trừ phôi chết sau 24h, cá thể khác phát triển bình thường C D 10 C3 A B C D -Chết phôi sau24h -4 Phôi nở sau 48h => Nồng độ thấp nên ảnh hưởng ít, phơi chết phơi yếu q trình thao tác -3 Phơi nở sau 48h, phơi nở sau 72h, cịn lại nở sau 96h -Tất phơi phát triển bình thường 20 A C3 x B -6 phôi chết ngày đầu -A3: hoại tử chưa nở sau 96h C3 C3 C3 => số phơi chết nhiều bất thường thao tác phôi yếu C D 30 C3 C3 - B4: Phù màng tim A B -Các cịn lại phát triển bình thường x C C3 D C3 40 C6 -2 phôi chết sau 24h -C3: phù màng tim A B -Các cịn lại phát triển bình thường, sau 72h nở hết C3 C x D C3 50 -2 phôi chết sau24h, phôi chết sau 96h A x B C3 C3 x x C C5 D x -C2: sau 48h phát dị dạng, sau 72h chết x x C4 x -Các cịn lại nở hết sau 72h -D2: Phù tim, sắc tố lưng -A3: Phù tim -D4, B5, C5: Phù màng tim -A6: Đuôi biến dạng gãy cong bên, hoại tử -B6: Phù màng bao tim, hoại tử nhẹ 60 A x x C3 x B x C x D x x x x x x x C6 x x x x -A3: dị dạng ngày 4; phù màng bao tim, phù nỗn hồng, chưa nở hết vào sau 96h -A2: Phù màng tim, hoại tử nhẹ -C3: chưa nở hết, phù màng tim, hoại tử -D5: Phù màng tim, hoại tử nặng -Các ô đánh dấu x lại: phù màng tim, hoại tử 70 A C3 B -Khơng có thống kê dị dạng lỗi thao tác làm mẫu vào ngày C3 C3 C3 C3 C -7 phôi chết sau 24h C3 D C3 C3 b Vinataba Nồng Kết độ 10 A Chú thích -Số cá thể chết 2/20 sau 24h -Đối chứng ngày thứ phá vỡ màng phơi, cịn giếng chứa độc thuốc sau 72h nở -Sau 96h cá khoẻ quẫy mạnh -Số cá thể chết 2/20 sau 24h -Một mẫu đối chứng sau 72h nở -Cá khoẻ quẫy mạnh C3 B C D 20 C3 A C3 B C3 C D 30 A B C D C3 -1 mẫu đối chứng bị chết, phôi yếu dùng độc thuốc nên có ảnh hưởng thuốc -Tất mẫu đều sau 72h nở, kể mẫu đối chứng ( ảnh hưởng thuốc lá) 40 A -C3: thao tác sai làm vỡ màng phôi -C5: thao tác mạnh (dùng pipet kiểm tra) làm đứt lìa thể cá C3 B C C5 D -Phôi sau 72h bắt đầu nở -Phôi bắt đầu yếu dần, quẫy yếu có khơng quẫy tác động đầu pipet 60 A B C D 4.Đồ thị: C3 C3 C3 C5 C3 -Có mẫu chết sau 24h, mẫu chết sau 72h 5.Nhận xét -Khơng xác định mối quan hệ tuyến tính số lượng phôi cá chết nồng độ thuốc lá.: + Số lượng phôi chết sau 24 thay đổi khơng có quy tắc nồng độ( tăng đột biết nồng độ 20 Thăng Long giảm 30-40 với Vinataba) Có thể chất lượng phơi cá không đồng +Từ sau 24h, số lượng phôi chết khơng chết thêm -Có thể kết luận số lượng cá thể dị dạng tỉ lệ thuận với nồng độ thuốc Thăng Long Đặc biệt, dị dạng phù màng tim, hoại tử nỗn hồng phổ biến với phôi môi trường thuốc Thăng Long nồng độ cao (50-60) - Thuốc Vinataba không gây dị dạng kể với nồng độ cao (60) -Không khảo sát ảnh hưởng thuốc Vinataba đến vận động cá ngựa vằn kích thước giếng nhỏ, khó quan sát IV Kết luận -Thuốc Thăng long (đến nồng độ 60 mg/l) có chứa lượng độc tố ảnh hưởng đến phôi cá ngựa vằn + Vấn đề trao đổi chất (gây hoại tử), + Khuyết tật chức tim (dẫn đến phù màng tim) +Làm hệ xương phát triển không đồng (dẫn đến bị cong đuôi) -Thuốc Vinataba (đến nồng độ 60mg/l) gây ảnh hưởng đến phát triển hình thái ấu thể cá ngựa vằn ... 30 A B C D C3 -1 mẫu đối chứng bị chết, phơi yếu dùng độc thuốc nên có ảnh hưởng thuốc -Tất mẫu đều sau 72h nở, kể mẫu đối chứng ( ảnh hưởng thuốc lá) 40 A -C3: thao tác sai làm vỡ màng phôi -C5:... để đạt gradient nồng độ mong muốn (ghi rõ nồng độ loại thuốc nắp cạnh ống) Nồng độ Thăng Long Nồng độ Vinataba V dd thuốc V nước(ml) V dd thuốc V nước(ml) lá(ml) lá(ml) 15(nồng độ 10) 15 10 45... tim ngừng đập Quan sát ghi lại dị dạng cá nồng độ giếng thuốc Thăng Long Thuốc Vinataba không ghi nhận dị dạng Không quan sát ảnh hưởng thuốc với cá di giếng nhỏ Bảng tổng hợp a Thăng Long Nồng