Xác định đột biến trên gen KRAS ở bệnh nhân ung thư trực tràng tại việt nam

VIỆN ĐẠI HỌC Mơ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -scíGSca - KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÈ TÀI: XÁC ĐỊNH ĐỘT BIÉN TRÊN GEN KRAS Ỏ BỆNH NHÂN UNG THU ĐẠI TRỤC TRÀNG TẠI VIỆT NAM Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Giáo viên hưóng dẫn Sinh viên thực Lóp : TS NGUYÊN HUY HỒNG : NGHIÊM THỊ BÍCH HẠNH :ll-04, CNSH HÀ NỘI, - 2015 LÒĨ CÁM ƠN Lời tơi xin bày tó lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyền Huy Hồng - Phó Viện trưởng, Trường phịng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Người thầy tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ chia sẻ khó khăn cho tơi suốt q trình thực nghiên cứu hồn thành khóa luận Tơi xin gứi lời cám ơn dặc biệt đến TS Nguyền Thị Kim Liên - Phó phịng Hệ gen học chức theo sát giúp đỡ chi bào cho tơi suốt q trình tiến hành thí nghiệm Qua biết ơn tất cá cơ, anh chị phịng dạy báo nhiều điều thời gian thực tập phịng Tơi chân thành cám ơn thầy giáo giảng dạy Khoa Công nghệ Sinh học, Viện Dại học Mớ Hà Nội truyền đạt cho kiến thức quý báu bố ích suốt năm học vừa qua Cuối xin gửi lời tri ân tới bố mẹ, người thân gia đình bạn bè xung quanh chia sẻ khó khăn thử thách sống cơng việc đế tơi có đượclkếtquẳệỉiỳ?' 1ỌD Đại học Mơ ỉíl Nọi Tơi xin chân thành cám ơn! Hà Nội ngày 22 tháng năm 2015 Sinh viên Nghiêm Thị Bích Hạnh Nghiêm Thị Bích Hạnh Lóp 11-04 MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN i MỰC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIÉT TẰT iv DANH MỤC BANG BIÊU vi DANH MỤC HÌNH vii MỚ ĐÀU 1.1 Ung thư đại trực tràng 1.1.1 Khái niệm ung thư 1.1.3 Các nguyên nhân yếu tố nguy dẫn đến ung thư đại trực tràng 1.1.4 Chẩn đoán diều trị ung thư đại trực tràng .6 1.4.1 Chấn đoán lâm sàng sinh hóa 1.1.4.2 Chẩn đoán phương pháp sinh học phân tử 1.1.4.3 Diều trị bệnh ung thư đại trực tràng 1.2 1.5.2 Tinh hình ung thư ứạị.trựcỉ ịrànOnýịệt Waịựtó' Ị.Ul-NợÌ Gen KRAS 1.2.1 Cấu trúc gen KRAS 1.2.2 Chức năng, vai trò gen KRAS việc đáp ứng điều trị với liệu pháp phân từ đích .11 1.2.3 Tinh hình nghiên cứu đột biến gen KRAS bệnh nhân ung thư đại trực tràng giới Việt Nam 12 PHÂN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 14 2.1 Vật liệu hóa chất 14 2.1.1 Vật liệu 14 2.1.2 Hóachất 14 2.1.3 2.2 Thiết bị 15 Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Tách chiết DNAtổng số 16 2.2.2 Điện di DNAtrên gel agarose 18 2.2.3 Đo quang phổ DN A 19 Nghiêm Thị Bích Hạnh Lớp 11-04 2.2.4.1 2.2.4.2 Nguyên lí kỹ thuật PCR 20 Nhân đoạn gen KRAS bàng kỹ thuật PCR 21 2.2.5 Tinh sản phẩm PCR 22 2.2.6 Giãi phân tích trình tự gen KRAS 23 PHÀN III: KẾT QUẢ VÀ THÀO LUẬN 25 3.1 Thu thập mẫu máu 25 3.2 Tách chiết DNA tống số 25 3.3 Xác định nồng độ độ tinh mẫu DNA 26 3.4 Phản ứng PCR nhân gen 27 3.5 Thôi gel tinh sàn phẩm PCR 28 PHÀN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 4.1 Kết luận 35 4.2 Kiến nghị 36 Thư viện Viện Đại học Mơ Hà Nội Nghiêm Thị Bích Hạnh iii Lớp 11-04 DANH MỤC CÁC TÙ VIÉT TÁT aa Amino acid bp Base pairs DNA Axit deoxyribonucleic CRC Colorectal cancer cDNA Complementary' DNA dNTP Deoxynucleotit triphosphat ddNTP Dideoxynucleotide EGFR Epidermal growth factor receptor E.coli Escherichia coil EtBr Ethidium Bromide EMEA Europe, the Middle East and Africa G Guanine GDP Guanosine-5-Diphosphate GTP Thư Kb Hà Nội Kilô bazơ kDa Kilô Dalton M Marker PCR Polymerase chain reaction Taq Thermus aquaticus Tm Nhiệt độ nóng cháy uv Ultraviolet WHO World health oganization PFS Progression free survival KRAS Kirsten - ras/v - ki - ras kirsten rat sarcomaviral oncogene homolog OD Nghiêm Thị Bích Hạnh Optical Density iv Lớp 11-04 Kí hiệu viết tắt axit amin A Ala Alanine D Asp Axit aspartic c Cys Cysteine G Gly Glycine K Lys Lysine M Met Methionine T Thr Threonine V Vai Valine Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Nghiêm Thị Bích Hạnh Lớp 11-04 DANH MỤC BẢNG BIÊU Băng 1: Trình tự cặp mồi dùng cho PCR 14 Bâng 2: Thành phần phân ứng 21 Bảng 3: Ket quà đo quang phổ mẫu DNA tổng số 26 Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Nghiêm Thị Bích Hạnh vi Lớp 11-04 DANH MỤC HÌNH Hìnhl Cấu trúc cúa ruột già Hình VỊ trí gen K-RAS nhiễm sắc thể 12 10 Hình Mơ hình protein KRAS với vùng quan trọng đánh dấu 11 Hình Sơ đồ phương pháp nghiên cứu 16 Hình Các bước tách chiết DNA bàn 17 Hình Điện di kiểm tra DNA tổng số gel agarose 0.8% 25 Hình DNA nhân bới cặp mồi KRlcó kích thước 445bp 27 Hình DNA nhân bời cặp mồi KR2 có kích thước 297bp 28 Hình DNA nhân bời cặp mồi KR3 có kích thước 375bp 28 Hình 10 Đột biến dị hợp tứ M67V bệnh nhân KR10 11, 12, 14.15 17 .29 Hình 11 Đột biến dị hợp tữ V103D bệnh nhân KR7 30 Hình 12 Đột biến dị hợp tứ M111K bệnh nhân KR7, 30 Hình 13 Anh hirưng cua dột biến lên cấu trúc 3D cua phântứ protein KRAS A: cấu trúc bình thường cùa protein KRAS vị trí 67; B: cấu trúc protein KRAS bị đột biến vị trí M67V 32 Hình 14 Anh hường đột biến lên cấu trúc 3D cùa phân từ protein KRAS A: Cấu trúc bình thường protein KRAS vị trí 103; B: cấu trúc cúa protein KRAS bị đột biến vị trí V103D 32 Hình 15 Anh hướng đột biến lên cấu trúc 3D cùa phân tử protein KRAS A: Cấu trúc bình thường cùa protein KRAS vị trí 111; B: cấu trúc cùa protein KRAS bị đột biến vị trí M111K 33 Nghiêm Thị Bích Hạnh vii Lớp 11-04 MỞ ĐẦU Theo báo cáo thường niên cùa Viện nghiên cứu ung thư Hoa Kỳ hàng năm giới có thêm khoảng 12 triệu ca ung thư khoáng 7,6 triệu ca tử vong, tức trung bình mồi ngày có 200 nghìn bệnh nhân ung thư tử vong Riêng khu vực Đông Đông Nam Á, có Việt Nam hàng năm có thêm khoảng 3,6 triệu ca ung thư với khoảng 2,5 triệu bệnh nhân từ vong [34], Ung thư đại trực tràng (Colorectal cancer - CRC) loại ung thư hay gặp đứng hàng thứ nữ hàng thứ nam giới giới [17], Đây nguyên nhân gây tứ vong dứng hàng thứ sau ung thư phôi, ung thư dày ung thư gan giới [25], Là ung thư đường tiêu hóa có tiên lượng tốt Tuy nhiên, dược phát muộn giống tất cã loại ung thư khác, khả điều trị hiệu Vì vậy, cần phát ung thư giai đoạn sớm tồn thương tiền ung thư [29], Theo WHO (năm 2008), năm có khống 7,6 triệu người chết ung thư tồn giới, ựong có khống 70%i các.e.a tự vong xạy, nước có thu nhập thấp trung bình, có khoảng 30% ca ung thư có the ngăn chặn Một đặc điếm nồi bật ung thư đại trực tràng có biểu cao cúa thụ tăng trưởng biếu bì (Epidermal Growth Factor Receptor - EGFR) Nghiên cứu cho thấy việc điều hịa q trình truyền tín hiệu từ thụ EGFR tới nhân tế bào có tham gia tích cực cúa nhóm protein mang hoạt tính GTPase nối bật KRAS Nghiên cứu dịch tễ học cho thấy có khống 25 - 40% bệnh nhân ung thư đại trực tràng mang đột biến gen KRAS Đồng thời thứ nghiệm lâm sàng khắng định cetuximab panitumumab (những thuốc chi dịnh điều trị ung thư dại trực tràng nay) chi thật có tác dụng kéo dài thời gian sống thời gian sống không bệnh cho bệnh nhân khơng mang đột biến gen KRAS Điều có nghĩa việc chẩn đoán đột biến gen KRAS điều bắt buộc trước cân nhắc chi định phác đo điều trị đích sử dụng thuốc ức chế EGFR (cetuximab panitumumab) cho bệnh nhân ung thư đại trực tràng [35] Nghiêm Thị Bích Hạnh Lóp 11-04 Những năm gần với phát triển mạnh mẽ sinh học phân tứ, bệnh nhân ung thư việc chữa trị phương pháp điều trị truyền thống phẫu thuật, hóa trị xạ trị họ hướng dần điều trị theo liệu pháp hiệu q hơn, độc hại hơn, “ liệu pháp phân tử đích” Liệu pháp cho thấy có nhiều ưu diem, đặc biệt bệnh nhân điều trị bàng hóa học thất bại, liệu pháp tác dụng phụ ít, sư dụng kết hợp liệu pháp với phương pháp hóa học giúp kéo dài sổng cho bệnh nhân KRAS proto - oncogene liên quan đến nhiều loại bệnh ung thư KRAS mã hóa cho GTPase nhỏ gồm 188 189 aa, tham gia vào trình truyền tín hiệu nội bào KRAS nam đường truyền tín hiệu EGFR Protein KRAS hoạt động cơng tắc phân từ đường truyền tín hiệu nội bào quy định chức nàng quan trọng cho tiến triền tế bào, bao gồm cà biệt hóa, phát triển chết theo chu trình Các đột biến gen KRAS dẫn đến hoạt động GTPase cùa protein KRAS bị suy giàm GTP khơng bị cắt thành GDP, hoạt động truyền tín hiệu protein KRAS diễn liên tục mà khơng cần tới có mặt cacjcicih thích qua^ đựờpg tniyen tín hiệu EGFR/HER [27] Đột biến gen KRAS xuất sớm ung thư đại trực tràng chiếm khoảng 30 - 40% [3] Vì vậy, bệnh nhân có đột biến gen KRAS có phán ứng điều trị với thuốc ức chc EGFR Đột bicn gen KRAS thường xuyên codon 12, 13, 61 146 [6], Các phương pháp xác định đột biến chủ yếu sinh học phân tử như: tiến hành khuếch đại đoạn gen mong muốn nhờ mồi đặc hiệu, đọc trình tự đoạn nhân lên tìm đột biến Trong nghiên cứu cùa đề tài này, với mong muốn hướng tới áp dụng liệu pháp điều trị đích cho bệnh nhân ung thư đại trực tràng người bệnh Việt Nam trước hết nghiên cứu cần tìm hiểu đột biến gen KRAS, vùng đột biến thường xuyên xuất hiện, kiều dột biến, phương pháp kỳ thuật áp dụng dể tìm đột biến, đề từ bác sĩ có thề đưa phác đồ điều trị thích hợp cho bệnh nhân cụ the giúp giàm thời gian chi phí điều trị cho bệnh nhân Xuất phát từ vấn đề trên, khóa luận: “Xác định đột biến gen KRAS bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam" tiến hành với nội dung nghiên cứu bao gơm: Nghiêm Thị Bích Hạnh Lớp 11-04 3.3 Xác định nồng dộ dộ tinh mẫu DNA Sau tiến hành điện di kiểm tra, mầu DNA tổng số đo OD bước sóng 260nm 280nm đề xác định nồng độ DNA kiếm tra độ tinh Các bazơ nitơ hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại bước sóng 260nm Giá trị mật độ quang bước sóng 260nm (A260nm) mẫu đo cho phép xác định nồng độ DNA mẫu theo công thức nêu phần phương pháp: CDNA(ng/pl)= A260nmx 50 X độ pha loãng Đe kiếm tra độ tinh cùa dung dịch, đo thêm giá trị mật độ quang bước sóng 280nm (A2S0nm)- 280nm bước sóng protein có mức hấp thụ cao Một dung dịch DNA xem tý số A260nm/A280nm DNA năm khoảng 1,8-2 Bảng 3: Kết đo quang phổ mẫu DNA tổng số Kết đo quang phổ mầu máu DNA tồng số tách theo kit Stt Mầu KR1 KR2 0.027 A260 _ 0,0268- A28O ìn ổẩỉioc ? n niors- CoNAÍng/pl) A260nm/A280nm 1,99 ' ■ gg ' 1,8 KR3 0.0252 0,013 102 1.94 KR6 0,0146 0,0073 79 KR7 0,023 0,0117 101 1,97 KR8 0,022 0,0114 97 1,93 KR9 0,025 0,0138 89 1,81 0,0256 KRIO 0,0137 99 1.87 KR11 0,0236 0,013 95 1,82 10 KR12 0,020 0,0102 100 1,96 11 KR13 0.021 0,0116 94 1,81 12 KR14 0,022 0,012 92 1,83 13 KR15 0,0168 0,0086 89 1,95 14 KR16 0,021 0,011 103 1,91 15 KRI7 0,015 0,0078 80 1,92 Kết cho thấy mẫu DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm có độ tinh cao đủ điều kiện làm khn cho phán ứng PCR Nghiêm Thị Bích Hạnh 26 Lớp 11-04 3.4 Phãn ứng PCR nhân gen DNA cùa mẫu nghiên cứu nhân đoạn PCR với cặp mồi ghi bàng I Trong ba cặp mồi sứ dụng nghiên cứu, cặp moi KR1, KR2, KR3 dùng để nhân đoạn exon 1, 2, có kích thước tương ứng 445 bp, 297 bp 375 bp Nồng dộ dNTP phụ thuộc nhiều vào kích thước đoạn DNA cần nhân bàn nồng độ buffer nồng độ mồi Việc bổ sung dNTP nhiều làm giảm nhiệt độ nóng chảy, giảm hoạt động cùa DNA polymerase Đối với phàn ứng PCR việc xây dựng chu trình nhiệt phù hợp yếu tố quan trọng nhất, bới yếu tố nhiệt độ đàm báo cho giãn xoắn cùa phân tử DNA, việc gắn mồi kéo dài chuồi Chu trình nhiệt tối ưu cho phàn ứng PCR trình bày mục 2.2.4.2 Ngoài yếu tố khác không phần quan trọng nhiệt độ gắn mồi Nhiệt độ gan mồi tùy thuộc vào loại moi cụ tính tốn dựa nhiệt độ nóng chày]^ ẹ^n^:Đại học Mở Hà Nộị Tm =2°c X (A+T) + 4°c X (G+C) + 3,3°c A, T G, C: bazơ nitơ Sau tính dược nhiệt độ Tm theo lý thuyết, tiến hành chạy PCR nhiệt độ gắn khác chọn nhiệt độ gắn tối ưu 60°C thời gian phút Ket quà điện di kiếm tra sân phẩm PCR với cặp mồi số mẫu hình sau: M 10 11 12 13 14 15 Hình DNA nhân cặp mồi KRlcó kích thưóc 445 bp M: Marker DNA chuẩn kb; 1, 2, 6, 7, 8, 10, 11 12, 13, 14, 15: Sản phẩm PCR mầu máu Nghiêm Thị Bích Hạnh 27 Lớp 11-04 M 10 11 12 13 Hình DNA nhân cặp mồi KR2 có kích thước 297 bp M: Marker DNA chuẩn kb; 1,2, 3, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13: Săn phẩm PCR mầu máu M Hình DNA nhân cặp mồi KR3 có kích thước 375 bp M: Marker DNA chuẩn kb;l, 2: sàn pham PCR mẫu máu Kết quà điện di sản phẩm PCR cho thấy nhân dược đoạn đặc hiệu cho exon 1, 2, mầu nghiên cứu với kích thước dự kiến Sán phâm PCR có băng gọn rõ nét, đạt chất lượng số lượng đề giái trình tự 3.5 Thôi gel tinh sản phẩm PCR Trên cột thơi gel có màng chứa phân tử lực cao với DNA, cho dịch có chứa DNA qua cột, DNA cố định màng thành phần khác qua màng loại bỏ Khi bố sung nước vào màng, DNA hòa tan thu lại vào ống cách ly tâm tốc độ cao (13000 vịng/phút) Nghiêm Thị Bích Hạnh 28 Lớp 11-04 Dịch chứa DNA quan lâm (ví dụ, sản phẩm PCR) điện di agarose 0,8 % cắt lấy băng quan tâm Sau gel làm (thôi gcl) theo hướng dẫn kil gel hãng Thermo cung cấp Sau gel điện di lại cho kết mẫu đạt chất lượng số lượng cho giải trình tự gen 3.6 Giải phân tích trình tự DNA Sàn phấm DNA tinh đọc trình tự bang cặp mồi nêu mục 2.1.2 Ket giải trình tự gen đưa lên phần mềm tin học BioEdit Trên phần mềm này, tiến hành so sánh trình tự DNA đọc với trình tự gen KRAS chuấn ngân hàng gcn người.Ket giải trình tự mẫu nghiên cứu phân tích phần mềm BioEdit so sánh với trình tự gen KRAS chuẩn người www.ensembl.org mã số ENSG00000133703 Ket quà phân tích trình tự ba đoạn exon khảo sát nghiên cứu cho thấy, số 15 mẫu nghiên cứu phát đột biến bệnh nhân KR7 KR9, KRK), KR11, KR12, K.R14, KR15 KR17 (Hình 10,11,12) M67V Hình 10 Đột biến dị họp tứ M67V ó bệnh nhân KR10,11, 12, 14, 15,17 Nghiêm Thị Bích Hạnh 29 Lớp 11-04 V103D Hình 11 Đột biến dị họp tử V103D ỏ’ bệnh nhân KR7 Hình 12 Đột biến dị họp tủ’ M111K ỏ’ bệnh nhân KR7, Các đột biến gen KRAS dẫn đến thay đổi amino acid protein KRAS bệnh nhân Sự thay the A>G vị trí 199 cDNA bệnh nhân KR10, II, 12, 14, 15, 17 dẫn đến thay acid amin M67V (ATG>GTG) protein KRAS Sự thay the A>T vị trí 308 cDNA bệnh nhân KR7 dẫn den thay acid amin V103D (GAT>GTT) protein KRAS Sự thay T>A vị trí 332 cDNA bệnh nhân KR7 dần đến thay the acid amin Ml 11K (ATG>AAG) Như vậy, bệnh nhân tham gia nghiên cứu chưa xác định dược đột biến anh hướng đến hiệu điều trị công bố nghiên cứu trước vị trí codon 12, 13, 61, 146 Kết q số lượng bệnh nhân Nghiêm Thị Bích Hạnh 30 Lớp 11-04 tham gia vào nghiên cứu chưa nhiều Tuy nhiên, kết phù hợp với tý lệ xảy đột biến gen KRAS 30 - 40% bệnh nhân ung thư đại trực tràng [23], [2], Theo Ren đồng tác già [21] nghiên cứu 4687 bệnh nhân ung thư đại trực tràng phát khoáng 29% bệnh nhân mang đột biến codon 12, 13 chi phát bệnh nhân mang đột biến codon 61 Đột biến codon 61, 146 154 xác định chiếm 1% bệnh nhân ung thư đại trực tràng [9] Bên cạnh Janakiraman đồng tác già [16], xác định đột biến vị trí khác Q22K, E31K KI 17N KRAS bệnh nhân ung thư đại trực tràng Tuy nhiên, ánh hường cúa đột biến lên khả đáp ứng điều trị cúa bệnh nhân chưa nghiên cứu Người ta xác định bốn vùng RAS protein: Vùng thứ bao gồm 85 amino acid đầu N hình thành nên ba dạng họ RAS protein (KRAS, NRAS HRAS) Vùng thứ hai bao gồm 80 amino acid có tương đong trình lự thấp (70 - 80%) Những vùng quan trọng chức truyền tín hiệu protein KRAS hình thành nên vùng G-domain (amino acid - 165) Vùng G-domain ctja protejn jKRA.S gồmỵỳtỊg Jjên\kếỊGTP,'ờ^ó vịng liên kết P-loop-phosphate (amino acid 10 - 16 56 - 59) phán ứng với b-phosphate c- phosphate GTP Vùng 116 - 119 152 -165 phàn ứng với base guanine Vị trí M67 VI03 nằm vùng xoan a helicase B c cấu trúc phân tử protein KRAS Phân tích ảnh hường cùa đột biến lên cấu trúc 3D cùa phàn từ protein KRAS cho thấy đột biến M67V, V103D M111K làm thay đổi đáng kế cấu trúc không gian protein KRAS vị trí (Hình 13,14, 15) Đặc biệt, đột biến vị trí M67V làm xuất thêm cầu nối hydro với amino acid vị trí 67(Hình 13B) Nghiêm Thị Bích Hạnh 31 Lớp 11-04 A B Hình 13 Ánh hưởng dột biến lên cấu trúc 3D phân tử protein KRAS A: cấu trúc bình thường protein KRAS vị trí 67; B: cấu trúc cùa protein KRAS bị đột biến vị trí M67V Hình 14 Ảnh hưởng đột biến lên cấu trúc 3D phân tử protein KRAS A: Cấu trúc bình thường cúa protein KRAS vị trí 103; B: cấu trúc cùa protein KRAS bị đột biến vị trí V103D Nghiêm Thị Bích Hạnh 32 Lớp 11-04 B A Hình 15 Ảnh hưởng cùa đột biến lên cấu trúc 3D phân tử protein KRAS A: cấu trúc bình thường cùa protein KRAS vị trí 111; B: cấu trúc cùa protein KRAS bị đột biến vị trí M111K Nghiên cứu cúa Jancik đồng tác giá [16], cho thấy, đột biến kích hoạt " cJ111Lviênu,JẩifĐãụìọé'Mư, lạ Nội X, X, , gen KRAS làm mât chức nang bật tăt từ chê độ hoạt đặng sang chê độ bat hoạt cùa protein KRAS, dẫn đến làm thay đối tế bào làm tăng kháng với liệu pháp hóa học liệu pháp điều trị đích với chất ức chế thụ thể EGFR Protein KRAS trì bất hoạt liên kết với GTP Sự bật tat từ trạng thái bất hoạt sang trạng thái hoạt động điều hịa bời tín hiệu nội bào Khi GTP gan vào protein KRAS, làm biến đối hình dạng hai vùng cùa protein KRAS khiến chuyền sang trạng thái hoạt động Đây hai vùng quan trọng biết đến vùng “Switch I” (amino acid 30 - 38) vùng “Switch II” (amino acid 59 - 67), hình thành nên vịng phản ứng lại kích thích, điều khiển bới đặc trưng liên kết cùa GTPase với phân tữ phàn ứng kích thích cùa Vùng “Switch I II" đóng vai trò quan trọng liên kết cùa yeu tố điều hòa yếu tố ảnh hường [31 ] Sự thay đối hình dạng cùa protein KRAS ành hướng đến phân ứng cùa với vùng multiple downstream transducers - GTPase-activating proteins (GAPs) làm tăng hoạt tính GTPase cùa phân tứ RAS protein lên 100 000 lần [12] Sự thay đổi ảnh hướng đến phán ứng với yếu to guanine - exchanging/releasing Nghiêm Thị Bích Hạnh 33 Lớp 11-04 (GEFs/GRFs) mạnh giải phóng GTP Protein KRAS có chất GTPase kích thích bời GAPs hoạt động đồng hồ bấm liên quan tới phán ứng trực tiếp với yếu tố ánh hường [10], Các đột bicn bat thường cúa protein KRAS làm mat tác dụng điều hòa cúa nhiều yếu tố, ánh hưởng đến vài đường quan trọng tế bào Ket quà nghiên cứu cho thay, bên cạnh đột biến xác định rõ ành hưởng hiệu điều trị đột biến codon 12, 13, 146 161 đột biến điếm vùng Switch I II hay vùng G ánh hưởng nhiều đến hoạt tính cùa protein KRAS Vì vậy, đột biến xác định bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam đột biến công bố cẩn nghiên cứu sâu ánh hường cùa chúng lên kết điều trị bệnh nhân ung thư đại trực tràng Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Nghiêm Thị Bích Hạnh 34 Lớp 11-04 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đã thu thập tách chiết DNA tống số 15 mầu máu cùa bệnh nhân mắc bệnh ung thư đại trực tràng tiến hành nhân đoạn exon 1,2,3 cùa gen KRAS với kích thước tương ứng 445 bp 297 bp, 375 bp Dã tiến hành giái trình tự đoạn exon gen KRAS 15 bệnh nhân phát đột biến dị hợp tử M67V (199A>G ), (ATG>GTG) bệnh nhân KR10, 11, 12 14 15 17; VI03D (308A>T), (GAT>GTT) bệnh nhân KR7; M111K (332T>A), (ATG>AAG) bệnh nhân KR7, Đã tiến hành phân tích ảnh hường cùa đột biến M67V, V103D M111K lên cấu trúc 3D cúa protein KRAS, kết quà đột biến vị trí M67V làm xuất thêm cầu noi hydro với amino acid vị trí 67 Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Nghiêm Thị Bích Hạnh 35 Lớp 11-04 4.2 - Kiến nghị Tiếp tục thu thập mầu máu bệnh nhân mắc bệnh ung thư đại trực tràng - Tiến hành tách DNA, nhân đọc trình tự đoạn exon gen KRAS đề tìm đột biến có ảnh hường đến hiệu q điều trị đích Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội Nghiêm Thị Bích Hạnh 36 Lớp 11-04 TÀI LIỆU THAM KHÁO > Tài liệu nước Khuất Hữu Thanh (2004) Cơ sờ di truyền phân tư kì thuật genc, Nhà xuất bàn Khoa học Kỹ thuật Hà Nội > Tài liệu nước Amado RG Wolf M, Peeters M, Van cutsem E, Siena s, Freeman DJ, Juan T, Sikorski R, Suggs s Radinsky R Patterson SD, Chang DD (2008) Wild­ type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer J Clin Oncol 26: 1626-1634 Arrington AK, Heinrich EL.Lee w, Duldulao M Patel s, Sanchez J, Garcia-Aguilar J Kim J (2012) Prognostic and Predictive Roles of KRAS Mutation in Colorectal cancer, hit J Mo! Sci 13: 12153-12168 Baba Y Nosho K, Shima K, et al (2011) Phosphorylated AKT expression is associated with PI3KCA mutation, low stage, and favorable outcome in 717 colorectal cancers Cancer 2011 Apr, 117(7): 1399-1408 Brink M, de Goei^ AFPiyi, Wejjppberg MP, Roemen GMIM, Pachen MMM Smits KM de Bruine AP, Goldbohm RA, van den Brandt PA (2003) K-ras oncogene mutations in sporadic colorectal cancer in the Netherlands Cohort Study Carcinogenesis 24: 703-710 Chretien AS, Harle A, Meyer-Lefebvre M, Rouyer M, Husson M, Ramacci c, Harter V, Genin p, Leroux A, Merlin JL (2013) Optimization of routine KRAS mutation PCR-based testing procedure for rational individualized first-line- targeted therapy selection in metastatic colorectal cancer Cancer Med 2: 11-20 Cunningham D Atkin w, Lenz HJ, Lynch HT Minsky B, Nordlinger B, Starling N (2010) Colorectal cancer Lancet 375 (9719): 1030-47 De Roock w De Vriendt V, Normanno N, et al (2011) KRAS, BRAF, PIK3CA, and PTEN mutations: implications for targeted therapies in metastatic colorectal cancer Lancet Oncol', 12(6):594-603 De Roock w, Claes B, Bernasconi D, et al (2011) Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA, and PTEN mutations: implications for targeted therapies in metastatic colorectal cancer Lancet Oncol; 12(6): 594-603 Nghiêm Thị Bích Hạnh 37 Lớp 11-04 10 Dienstmann R, Vilar E, and Tabernero J (2011) Molecular predictors of response to chemotherapy in colorectal cancer.Cancer J; 17(6): 114-126 11 Forbes s, Clements J, Dawson E, Bamford s, Webb T, Dogan A, Flanagan A, Teague J Wooster R, Futreal PA Stratton MR (2006) Cosmic 2005 fir J Cancer 94: 318-322 12 Gideon p John J, Freeh M, Lautwein A, Clark R Schefler JE, Wittinghofer A (1992) Mutational and kinetic analyses of the GTPase-activating protein (GAP)-p21 interaction: the C-terminal domain of GAP is not sufficient for full activity Molecular and Cellular Biology 12(5): 2050-2056 13 Giglione c, Parrini MC, Baouz s, Bernardi A, Parmeggiani A (1997) A new function of pl20-GTPase-activating protein: prevention of the guanine nucleotide exchange factor-stimulated nucleotide exchange on the active form of Ha-Ras p21 Jounal of Biological Chemistry 272 (40): 25128-25134 14 Hagan s Orr M, Doyle B (2013) Targeted therapies in colorectal cancer— anintegrative view by PPPM The EPMA Journal (4): 15 Janakiran^!^’ Vakiạni :Ịỳ, Zeng Pra(i|a$ CẠ