Xác định đột biến gen trên các gen thuộc con đường tín hiệu pink1 prkn gây bệnh parkinson

BỌ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỌ Y TÉ TRƯỜNG DẠI HỌC Y HÀ NỘI — U BỌC [Cũ PHÍ THANH THỦY XÁC ĐỊNH ĐỘT BIÊN DIÊM TRÊN CÁC GEN THUỘC CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU PINK1/PRKN GÂY BỆNH PARKINSON KHĨA LUẬN TÓT NGIIIẸP cũ NHÂN Y KHOA KHÓA 2019-2023 Hà Ni- 2023 -ãc ô4 ugc V Hl - - Bộ GIÁO DỤC VÀ DÀO TẠO BỘ Y TÉ TRƯỜNG DẠI HỌC Y HÀ NỘI — soLDcs — PHÍ THANH THÙY XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN DIÊM TRÊN CẤC GEN THUỘC CON ĐƯỜNG TÍN HIỆƯ PINKI/PRKN GÂY BỆNH PARKINSON Ngành đào tạo : Xét nghiệm Y hục Mã ngành : 7720601 KHĨA LLẠN TƠ I NGHIỆP cũ'NHÂN Y KHOA KHÓA 2019 -2023 Người hướng dàn khoa hục: TS PHẠM Lấ ANH TVN H Ni 2023 -ãc ô4 ugc V Hl LỜI CẢM ON Với tất cá lòng trân trọng, cm xin bày to lỏng biết ơn sáu sấc tói PGS.TS.BS Trần Vân Khánh Phó Giám đỗc Trung tâm Nghicn cứu Gcn-Protein Trưởng Bệnh hục phân tư Trường Đại Học Y Hà Nội đà tạo điều kiện cho cm dược thực khóa luận trung lâm Em xin bày lo lỏng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Lé Anh Tuấn dà trực ticp hướng dẫn cm hồn thành khóa luận, dong thời người lận tinh chi bao giúp dờ cm đưa nhừng lời khuyên hừu ích lời góp ỷ tâm huyết để cm hồn thành lồl khóa luận Em xin cam ơn TS Nguyen Hồng Việt, người thầy tận tinh chia SC kỳ thuật kinh nghiệm hừu ich trinh thực thi nghiệm, cảc anh chị tụi Trung tâm Nghicn cứu GcnProtcin dà tận tinh giúp dờ em dê em hoãn chinh khóa luận Em xin chân thành cam ơn Ban Giám Hiệu Phông Quan lý Đảo tạo Đại Học Khoa Kỳ thuật Y hục Trường Đại Học Y Hà Nội dà tạo điều kiện cho em làm khóa luận tốt nghiệp Lõi cuôi em xin gửi lời cam ơn tới gia dinh, bạn bẽ quan tàm dộng viên giúp dờ em trinh hục lập vả nghiên cửu Hà Nội 14 tháng nàm 2021 Sinh viờn Phi Thanh Thiiy -ãc ô4 ugc V Hl C ỌNG HÒA XÃ HỘI CHÚ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc CAM ĐOAN Kinh gũi: Phòng Quan lý tạo Đại học Trường Đại học Y Hà Nội Hội dồng châm khóa luận tot nghiệp Tơi xin cam doan lã cịng trình nghiên cửu cua với giúp đừ cua thay cô Bộ môn Bệnh học phân tư anh chị tụi Trung tàm nghiên cứu Gen -Protein Trường Đại hục Y Hà Nội Tất ca sồ liệu nghicn cữu khóa luận náy trung thực vả chưa dưực công bổ công trinh não khác Há Nội 14 thảng nảm 2021 Người viết khóa lun Phi Thanh Thỳy -ãc ô4 ugc V Hl MC LỤC DẠT VÁN DÈ CH ƯƠNG 1: TỐNG QUAN 1.1 Bệnh Parkinson .3 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Dịch te họe bệnh Parkinson 1.1.3 Phân loại bệnh Parkinson vả thang giai đoạn bệnh 1.1.4 Cơ chế bệnh sinh PD 1.1.5 Chan đoán bệnh Parkinson 1.1.6 Diều trị bệnh Parkinson 1.2 11 Sơ lược dường tin hiệu PINK I/PRKN tương quan với PD 11 1.2.1 Tẩm quan trọng cùa tv the PD 11 1.2.2 Con đưởng tin hiệu PINKbPRKN 13 1.3 Phương pháp phát dột biển dường tin hiệu PINK1 PRKN gây bệnh Parkinson người lành mang gcn bệnh bang kỳ thuật giai trình tự gcn Sanger 16 CHƯƠNG 2: ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2 Thời gian dịa diêm nghiên cứu 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Thiết ke nghiên cứu 19 2.3.2 Cở mầu 19 2.3.3 Sơ đồ nghiên cứu 19 2.4 Dụng cụ trang thiết bị hóa chắt nghiên cửu 20 2.4.1 Dụng cụ 20 2.4.2 Sinh phẩm, hóa chất .20 2.4.3 Thiềt bị 2.5 Quy trinh nghiên cứu 20 -ãc ^H ô4 ugc V Hl 21 2.5.1 Quy trinh thu thập bao quan mẫu 21 2.5.2 Quy trinh kỳ thuật tách chiết DNA tú mầu máu toàn phần 21 2.6 Xử lý số liệu 28 2.7 Đạo đữc nghicn cứu 28 CH ƯƠNG 3: KẾT QUÁ NGHIỀN cừu 29 3.1 Kct qua tách chiết DNA 3.2 Kết qua khuếch đụi 31 3.3 Kổt qua giai trinh lự 29 32 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 35 4.1 Đánh giá kct qua tách chiết kiềm tra chẩt lượng DNA .35 4.2 Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu cua kỳ thuật PCR với cặp 35 4.3 Đảnh giá ỷ nghĩa đột biến trẽn tương quan bệnh 37 4.3.1 Đảnh giã VC yểu tố dịch tẻ học 37 4.3.2 Đánh giá ti lộ đột biên so với nghicn cửu nhùng tác gia khác 4.3.3 Đánh giá loại dột biến trcn tương quan bệnh KẾT LUẬN 37 39 42 TI L1I THAM KHO -ãc ^H ô4 ugc V Hl TƠM TÁT Gcn PRKN mà hóa cho protein Parkin, enzyme E3 ubiquitin ligase Gen PINK I mà hóa cho protein ten hay gọi lã PTEN gày kinase giá định Hai protein cô tương tác với việc quan li diều chinh hoụt dộng binh thưởng cua ty thè thân kinh, từ dó sửa chừa loại bõ ly thê cỏ bất thưởng mật chức náng Đột biển hai gen ghi nhận phô biên nhùng bệnh nhân mac Parkinson dụng di truyền lận nhiễm sắc the thường Chúng lõi nhận thấy cần thiết cua nghiên cữu tim hiẽu dột biền diêm hai gcn bệnh nhân Parkinson Việt Nam Nghiên cứu dược thực 30 mảu bộnh nhân dưực bác chân đốn mắc Parkinson sư dụng kỳ thuật giai trinh tự gcn Sanger Nghiên cứu đà phát dược hai loại đột biền diem gen PRKN với ly lộ 30 loại đột bicn diem trẽn gen PINK1 với tỷ lộ 1/30 cò kiêu gcn dị hựp từ Nghiên cữu có ỷ nghĩa thực tiễn dơi với bộnh nhân gia dinh, dóng góp vào sớ dừ liệu vê bệnh Parkinson Việt Nam Từ khóa: dột biến gen giái trinh tự PINK1 PRKN Parkinson -•c ^H «4 ugc V Hl DANH MỤC B ang Bang 2.1: Các cặp mồi gen PRKN thiết kế bủng phanmem Printer? 22 Bang 2.2: Các cặp mồi gen PINK thiết ke băng phầnmềm Primer3 24 Bang 2.3: Thành phân cứa phán ứng PCR 26 Bang 2.4: Thảnh phần phan ứng cứa PCR giái trinh tự gen 27 Bang 3.1: Kct qua đo mật độ quang cua mầu DNA tách chiết 29 Bang 3.2: Các đột biến phát mầu nghiên cứu 32 -ãc ^H ô4 ugc V Hl DANH M C HèNH ÁNH Hình I I: Vị (rí cua liềm đen Hình 1.2: cấu tạo cua vũng liềm đen người binh thường vả người mác PD Hình Kiêm soát chất lượng ty thê bang tin hiệu PINK I Parkin ty thè bị hư hóng 14 Hình 1.4: Kiêm sốt chắt lượng ty the tin hiệu PINKI PRKN VỚI nhừng ty the có tỏn thương khu trú 14 Hình 1.5: Thay thè thành phan ty thê bị hư hỏng bang dường tin hiệu 15 PINK1PRKN Hình 1.6: Biêu dien sư dồ cãc miền cua protein PINK I Parkin dột biến liên quan đen bệnh 16 Hình 1.7: cấu trúc cùa dNTP ddNTP 17 Hĩnh 1.8: Phương pháp giai trinh tự gen Sanger bàng mây giai trinh tự gcn tự động 18 Hình 3.1: Minh họa ket qua mật dộ quang hợc cưa mẫu DNA sau tách chiết bang mây Nanodrop 2000c 29 Hình 3.2: Minh họa kết qua khuềch đại exon cua gen PINK I PRKN 31 Hình 3.3 : Kẽl qua giái trinh tự mảu bệnh nhàn MSI I 33 Hình 3.4 : Kết qua giãi trinh tự mầu bệnh nhãn MS16 33 Hình 3.5: Kct giãi trinh tự mẫu bệnh nhân MS28 33 Hình 3.6 Ket qua giai trinh tự màu bệnh nhãn MS30 34 -•c ^H «4 ugc V Hl DANH MỤC CHÌ’ VIẾT TÁT PD Bệnh Parkinson MPTP ỉ-methy-4-phenyl-1 2.3S6- tetrahydnpyridine MQC Hệ thắng kiêm soát chất lượng ty thê ATm Điện mãng PCR Polymerase Chain Reaction DNA Deoxyribonucleic acid -ãc ô4 ugc V Hl H& 31 - Tv số A260 280 cua mẫu DNA dao dộng khoang 1,8-2,26 Kct luận: Các mẫu DNA tách chiết tinh có nồng dộ dạt yêu cầu cho phan ứng PCR 3.2 Kốt qua khuếch dại Hỉnh 3.2: Xỉinh họa kct quà khuếch dại exon cua gen PỈ\'KI PRKN Chú thich: Giêng 1: Marker Giềng 2: Chững âm Giêng 3.4 Kct khuếch dụi exon gen PRKX củ kích thước khoang 297bp cua mẫu MSI I MSI6 Giếng 5: Két khuếch dại cxon gen PỈXKỈ cò kỉch thước khoang 4!6bp cùa mầu MS30 Giềng Kềt quà khuếch dụi exon trẽn gen PRKN cò kich thước khoang 34Sbp cùa mầu MS28 Nhận xét: - Marker looobp phân tách rõ cho phép nhận định kết qua rị ràng -c -.ÍH «4 HCC V Hk Hỉ: 32 - Các bâng DNA tương đối rỏ nét khơng có báng phụ kích thước tương ứng với đoạn DNA cần khuếch đại Từ kct qua ta thầy san phàm PCR thu lã đặc hiệu, đani bao cho kỳ thuật giai trinh tự gcn đè xác định đột biến trẽn hai gcn PÍNKI vã PRKN 3.3 Kết giái trình tự San phàm PCR sau điện di kiêm tra chat lượng sè tiếp tục dược sứ dụng cho kỳ thuật giái trình tự gen bang máy giai trinh tự gen tự động Sau dó kẽt qua giai trinh tự sò đưực so sánh với trinh tự gcn ngân hàng GenBank bang phần men CLC Main Workbench Ket qua giai trinh tự trinh bảy bang: Bâng 3.2: Các đột hiền phát mẫu nghiên cứu Mà bệnh Gen Exou nhân Biến đồi Bien đỏi The dột nucleotide acid amui biến MS11 PRKN Exon C.1O1OG>A Cys337Tyr Dị hợp MS16 PRKN Exon C.1O1OG>A Cys337Tyr Di hụp MS28 PRKN Exon c S23OT Arg275Trp Dị hợp MS30 PINK1 Exon C.1273OT Pro425Ser Dị hợp Ket qua giai trình tự cho thấy có 30 mầu có biền đơi cxon cụ thê hai gen P1NKI vả PRKN so với trinh tự chuẩn trẽn Genbank Trong dó gen PRKN phát dược dột biến C.IOIOG>A nằm exon số xuầt hai mẫu MSI MS 16 dột biền C.823OT năm exon so xuầt mẫu MS28 gen PINK I phát hiộn đưực dột biển c 1273OT xuất mẫu MS30 Tất ca mẫu nghiên cửu mang dột biền d| hợp tư Dưới lả kết qua giái trinh tự cua cãc màu dột biền -c ^H «4 ugc V Hl 33 C.1O1OG>A (p.Cys337Tyr) C.1010G i COCCCTGOCTGTOGAOCGGGO R p G c G A G cgccctogctRtogagcgggg R p G X G A G Hình 3.3 : Kei giai trình tự num bệnh nhãn MSI ỉ C.1010G i C.IO1OG>A (Ị>.Cys337Tyr) CGCCCTGGCTGTGGAGCGGGG R p G c G A G CGCCCTGGCTRTGGAGCGGGG R p G X G A G Hình 3.4 : Kết qua giai trinh tự mẫu bệnh nhãn MSỈÕ Nhận xét: Cã hai mẫu MSI I MS 16đều đột biền C.1O1OG>A Tín hiệu đinh lên rị ràng, khơng bị nhiễu Tại vj tri c 1010 mẫu có dinh tin hiệu trùng tương ừng với nucleotide G A Đột biền làm thay dôi ba TGT mà hỏa cho acid amin Cysteine thánh TAT mà hóa cho acid amin Tyrosine Vậy mẫu bệnh nhản MSI vã MS16 chửa dột biến C.IOIOG>A (dị hụp tư) C.823C c.823C>T (p.Arg275Trp) CTCAATGATCGGCAGTTT L N D R Q F CTCAATGATgGGCAGTTTGTT L N D X Q F V ì MlV M aMm MM Hình 3.5 Kết qua giúi trinh lự mầu bệnh nhãn MS2S Nhận xét: Tin hiệu đĩnh lẽn rò ràng, khơng bị nhiêu Tại vị tri C.823 mẫu có dinh tin hiệu trũng tương ừng với nucleotide c T Đột biến lãm thay dỏi -c ^H «4 ugc V Hl 34 ba CGG mà hỏa cho acid amin Arginine thành TGG mà hõa cho acid amui Tryptophan Vậy mẫu bệnh nhãn MS28 chửa dột bicn C.823OT C.1273C C.1273OT (p.Pro425Ser) I CGTCCTGGCCCCAGGGCAGTG RPGPRAV CGTCCTGGCycCAGGGCAGTG RPGXRAV hẠỂytíkứũA Hình 3.6: Kết qua giãi trinh tự mẫu bệnh nhãn MS30 Nhận xét: rin hiệu dinh rị ràng, khơng bị nhiều l ại vị tri C.1273 mầu có dinh tin hiệu trúng tương dương với nucleotide c T Dột biến làm thay đôi ba ccc mà hỏa cho acid amm Proline thánh TCC mả hóa cho acid amm Serine Vậy mẫu bệnh nhân MS30 cha dt bin c 1273OT -ãc ô4 ugc V Hl 35 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 Đánh giá kết quà tách chiết kiêm tra chất hrọng DNA Như đà trinh bảy phần quy trinh nghiên cửu kỹ thuật tách chiết DNA nhùng bước ban anh hương trực tiếp tới quy trinh sinh hục phân tư phía sau Việc kicm tra chất lượng DNA vế nồng độ vã độ tinh sau tãch chiết lã bước thiết yếu bơi số lượng chát lượng DNA có thê anh hương tới bước cùa quy trinh PCR dư thừa nồng độ DNA mầu b| ngoại nhiêm chát khác cồn có thê gãy ức chế khuếch dại DNA mong muon Trong nghiên cữu dà liền hành tách chiết thánh cóng DNA tống số cùa 30 màu máu tồn phẩn cùa người lành mang gen bệnh Parkinson Kct qua tách chiết kiêm tra bang phương pháp đo mật độ háp thụ quang cùa màu DNA trẽn máy Nanodrop 2000c Sau kiêm tra nồng dộ độ tinh cua 30 màu DNA sau tách chiết, kct qua cho thấy cảc mầu DNA dcu tinh vã du nồng dộ cho bước tiep theo cùa quy trinh Các mầu DNA dược tách chiết bang kit The Wizard® Genomic DNA Purification cua hãng Promega Ưu diêm tách chiết DNA kit cua hãng lã hóa chất dẻ sử dụng, dam báo võ trũng, sư dụng mã khơng cằn pha chế sán pham DNA thu dược có nồng độ dộ tinh cao Bẽn cạnh dó có nhưực diêm kít tổn vã phụ thuộc nhiều vào nhà sán xuất 4.2 Đánh giá độ nhạy độ dạc hiộu kỳ thuật PCR với cập mồi Các thành phần phan ứng PCR chất lượng nồng dộ DNA khuôn, nồng dộ trinh tự thiết kế doạn dung dịch đệm nồng độ cua nucleotide tự Taq polymerase chu trình nhiệt đêu có thè anh hương đen hiệu qua cùa phan ứng PCR Nghiên cứu cua chủng tỏi sư dụng 0.5pl mơi có nơng độ tương ứng 5pmol/pl nhiệt dộ gắn mõi thời gian gàn mỏi 56-58°C 30 giây MỎI thành phẩn quan trọng dáng ý dê có thê tạo dưực san phàm PCR đặc hiệu Nhiệt dộ gân mồi cao dộ đặc hiệu cng tt v khỏ nóng gn mi -ãc ^H ô4 ugc V Hl 36 vảo DNA đích thấp Ngược lại nhiệt độ gần thấp thi độ dậc hiệu giam, mồi gan vào DNA dich tốt có thê gan vảo nhừng doạn gen khơng mong muốn tạo san phẩm phụ Nồng dộ mồi cao dản đen tượng mồi không dặc hiệu, có the tự bằt cặp vói tụo san phẩm phụ; nồng dộ mồi thấp lâm giám hiệu suất cua phân ững vả không thu dưực du số lượng, nồng dộ DNA mong muôn Trong phan ứng PCR DreamTaq Hot Start Green Master Mix 2X dùng dè thay the cho GoTaq Master Mix 2X Hoạt tinh cua enzyme Taq plymarase DreamTaq Hot Start Green Master Mix 2X cao gap 1.5 lằn so với hoạt tinh cua enzyme GoTaq Master Mix 2X nên sè giúp tâng hiệu suất cua phan ứng Ngoái DreamTaq Hot Start DNA Polymerase sư dụng kháng thê ức chế hoạt dộng cua DNA polymerase nhiệt độ môi trường xung quanh dê ngân chặn khuếch dại cua san phàm không đặc hiệu trước bước khuếch đại DNA Hơn hồn hợp Master Mix gôm cỏ thuôc thứ tỳ trọng vã hai thuốc nhuộm giúp tài trực tiếp săn phàm PCR lẽn gel cách thuẠn tiện mã không cần nhuộm lại san phàm bang tay Với việc sư dụng ĐrcamTaq Hot Start Green Master Mix 2X đà mang lại rat nhiều ưu diem vã thuận tiện trinh thực phán ứng PCR giúp cho viộc rút ngắn bước phai chuàn hóa thành phan cùa phan ứng Như vậy, việc phàn ửng PCR dụt hiỳu qua cao thi việc chuẩn hóa chu trinh nhiệt vò quan trọng Chu trinh nhiệt cua phan ứng PCR gồm giai đoạn: giai đoạn biên tinh, giai đoạn gân mỏi giai đoạn kẽo dãi chuỗi Giai đoạn bicn tinh lã giai đoạn mà đoạn DNA khuôn bị biền tinh bơi nhiệt dộ tách thành chuỗi dim trinh thưởng dien khoang 94-95°C Giai đoạn gàn mõi lã giai đoạn nhiệt độ hạ xuống cách thích hợp cho phép cãc đoạn mõi với bán chat doụn oligonucleotide bãp cặp với SỢI DNA khuôn, trinh thường dược diễn khoang 5060°C Cuối giai đoạn kéo dài, nhiệt dộ dưực nàng lèn dén nhiệt độ tỏi ưu cho hoạt dộng cua enzyme Taq polymarase với chức nàng xúc tác cho kéo dãi chuỗi DNA đích, thường khoang 72°c Nhiệt độ cho giai đoan biến tinh giai đoạn kéo dài chuỗi it cô biến dôi hai trinh ny khụng ph thuc vo kớch thc -ãc ^H ô4 ugc V Hl 37 nồng độ trinh tự cua đoạn gcn vã đoạn mồi nen thường sư dụng ngưòng nhiệt dộ chung 95f'C( giai doạn biến tinh) 72°c (giai đoạn keo dãi chuồi) Còn nhiệt độ gắn phụ thuộc vào kích thước, trình tự đoạn mơi sư dụng cần tinh toán, chuân nhiệt độ phú hợp với đoạn mồi khác Đè kiêm tra san phẩm PCR có dặc hiệu hay khơng, sứ dụng kĩ thuật diện di gel agarose 1.5% Do kich thước cúa đoạn trình tự khuếch dụi nam tir 297-416bp nên sư dụng agarose ty lệ 1.5% thích hợp dê ket qua diện di rị nét Ket qua diện di chơ thay mỏi giêng điện di cỏ bảng điện di gọn rờ net báng phụ kích thước tưong ứng với kich thước chuẩn cua đoạn gen can khuếch dại Điều chửng to cập mồi dưực sứ dụng bắt cụp dặc hiệu, chu trinh nhiệt diều kiện khác lã tồi ưu giúp cho phan ứng PCR thực thành công 4.3 Đánh giá V nghĩa dột biến tương quan bệnh 4.3.1 Dánh giả cúc yếu tố dịch tễ học 30 mẫu nghiên cứu cua dược tuyên chọn ngẫu nhiên bỹnh nhãn dà dược chân dơán mac PD bới chuyên gia lâm sàng thòng qua chi liêu đánh giá độ tuổi, nhóm nghiên cứu cỡ độ tuồi dao dộng từ khoang 50 den 70 tuổi, ti lộ giới tinh, chênh lệch giừa số bệnh nhàn nam so với số bệnh nhân nừ không khác biệt nên khơng có ý nghĩa liên quan đèn bệnh lý Parkinson, giồng nhu nghiên cứu khác thề giới không tim thấy mối tương quan giừa giới linh vã bệnh lý 4.3.2 Đảnh già ti lệ dột biển so với nghiên cừu cua tác giá khúc Trên tống số 30 mẫu nghiên cửu chúng tời đà xác định 3/30 bệnh nhàn mang dột biền gen PRKN (chiêm 10%) Ty lộ phũ hợp với tý lệ nghiên cửu cua tác gia Kam vã cộng (2001) trẽn 111 bênh nhân người Dữc lã 9%" hay tý lẽ 12.6% nghiên cứu cua tác gia Sun cộng (2006) người Mỳ55 hay tỷ lộ 11.6% nghiên cửu cua tảc giâ Chu cộng (2014) trẽn người I lãn Quốc24 Đặc biệt, dó có dột biến vị tri C.823OT dà dưực chững minh bơi thư nghiêm lảm sàng in vivo vã dược công nhận trẽn ngân hãng liệu elinvar -c ^H «4 ugc V Hl 38 Iren tồng số 30 mail nghiên cứu chúng tỏi dà xác dịnh I '30 bệnh nhân mang dột bicn trcn gen PINK I (chiếm 3.34%) Tý lệ phù hợp với tỳ lệ 4- 6% bệnh nhàn Châu Á 2-4% người da trằng nghiên cứu cua tác gia Schulte Gasser (2011) Trong nghiên cứu tương tự Việt Nam Nguyen Đàng Tón cộng 112 bệnh nhãn mắc PD khơi phát sớm trước 50 tuổi dưực tim thấy dột biền dường tin hiộu PINKI/PRKN bỳnh nhãn với tỳ lộ mẳc bệnh 4%:í ty lộ lum so với ly lộ ’30 (13.34%) nghiên cứu cua chúng (ơi TỎI có the giái thích chênh lệch (y lệ đày lã cò mẫu cùa tác gia trẽn nho dộ tuổi bộnh nhân nhôm nghiên cứu cùa lã khới phát muộn (sau 50 tuổi) -ãc ô4 ugc V Hl 39 4.3.3 Dnh gi tng loại dột biển tương quan bệnh 4.3.2 / Dột biền Cỵs337Tyr gen PRKN Tại vị tri c 1010 thuộc cxon số gcn PRKN xay đột biến từ nucleotide G thành A khiến ba TGT thành TAT Quả trinh cắt nồi cxon xây binh thường nên thay the nucleotide dan den thay đồi acid amin số 337 Cysteine thành Tyrosine (Cys337Tyr) Theo lý thuyết, ca hai acid amin thuộc nhỏm acid amin phàn cực khơng tích điện chủng khác chồ cấu trúc cua Cysteine acid amin mạch nhánh dơn gian Tyrosine acid amin có chửa vỏng therm Dựa trẽn cấu trúc Cysteine với cẩu trúc mạch nhánh dơn gian có the dẻ dâng tham gia vào phan ứng hóa học cách mạch mè Ngược lại Tyrosine với cầu tnìc vịng thơm dược đánh giá khô tham gia vào cãc phan ứng hóa học vã cỏ tinh trơ nhicu Chinh vi the dột biên gãy biên dôi từ acid amin Cysteine thánh Tyrosine ngồi việc gây biền dơi lên cầu trúc cũa protein Parkin côn ãnh hưởng den việc hoụt dộng cua protein trinh chuyên hỏa cùa tê bào có kha nâng gây PD 4.3.2.2 Dột hiền Arg275Trp gen PRKN Tại vị tri C.823 thuộc exon sổ trẽn gen PRKN xáy dột biến từ nucleotide c thành A khiến ba CGG thánh AGG Ọuá trinh cất nối exon xay bình thường nên thay thê nucleotide dẫn den thay dôi acid amin sô 275 lã Arginine thành Tryptophan (Arg275Trỵp) ĩhco lý thuyết Arginine acid amin mạch thảng khơng phân nhánh, khơng nhàn thơm, diện lích • I có chửa nhóm a-amino nhóm a-carboxylic chuỗi bên gốm chuồi thảng 3-cacbon kết thúc nhõm guanidino pH sinh lý gốc carboxyl acid bị giam proton (tức ton dụng -COO ) nhóm amin dược proton hóa (tức lã tơn dạng - NH3+) nhóm guanidino dược proton hóa dẽ tụo dạng guanidium ( tức tốn ứ dụng (C-CNH?):'), diều khiển cho Arguiine trơ thành axil mạch thảng tích in ô4 ugc V Hl ã10 Trong dụ Tryptophan lã acid amin khơng phàn cực có I vịng bcnzopyrolc Việc dột biển lãm biền dói tù acid amin Arginine thành Tryptophan dà làm thay địi hồn tồn cấu trúc hóa học cấu true khơng gian cua Parkin vị tri Sự thay dõi khiến cho cấu trúc cua enzyme Parkin bị co lại, dần dền việc kha nàng phàn giái chất, từ dỏ lãm cho ty thé giam chức nâng tông hợp ATP dần den chết cúa nhùng tẽ bão vùng liềm den dà trinh bây phần Ngoải nhừng thành phần protein Parkin bị suy giam chức nàng tích tụ lại cách bất thường cỏ the nguyên nhàn gãy cảc triệu chứng suy nhược thằn kinh nhừng bỳnh nhãn mac Parkinson (theo Sriam cộng sự) Trong nghiên cứu cùa Klein cộng bộnh nhân mac Parkmson khơi phát sớm Ỷ đà phát tnrờng hợp bệnh nhãn có đột biến vị tri này'26 Ngoài đột biến (Arg275Tryp) dược ghi nhận lã đột biển xuất thường xuyên phô biến trẽn gen PRKN khắp cãc nghiên cừu đột biến trẽn khắp the giới ĩ ĩ Dột biển Pro425Ser tiên gen PINKì Tại vị tri c 1273 thuộc exon so trẽn gen PINKI xảy đột biên tứ mucclotidc c thành T làm thay đỗi ba ccc thánh CTC Quá trinh cắt nối cxon xay binh thường nên thay nucleotide dan den thay đòi acid amin so 425 lã Proline thành Senne (Pro425Ser) Theo lý thuyết Proline lã acid amin không phân cực chứa nhõm aamino nhóm acid a-cacboxvhc vã vịng pyrolidinc chuỗi bên cấu trúc tuần hoãn dặc biỹt cùa chuỗi bẽn trẽn khicn cho acid amin có dộ cứng hĩnh dụng dặc biệt acid amin khác Ngoải câu trúc anh hương đền toe dụ hình thành lien ket pcptidc giừa Proline acid amin khác Khi Proline dược liên kết xích chuồi polypeptide, nito cùa liên kết với bất cữ phân tư hidro tức lả nỏ khơng thè cung cáp hidro mã chi dóng vai trị lã chát nhận Còn lụi Serine lã acid amin cô cấu trúc mụch thảng, cỏ chữa nhỏm Ci­ amillo nhóm acid a-carboxylic chuỗi bốn l mt nhúm hydroxymethyl -ãc ô4 ugc V Hl 41 điểu khiển cho trơ (hãnh acid arnin phân cực Sự thay đỏi acid amin vị tri không chi khiến cho cẩu trúc cùa proton PINK bị thay đơi mã cịn anh hương đen vic thc hin chc nõng cua chỳng -ãc ô4 ugc V Hl 42 KÉT LUẬN Cán vào kết qua nhừng phàn tích chúng tơi dưa kết luận sau Ap dụng kỳ thuật giai trinh tự gen Sanger đà phát xác định dược 4/30 mẫu nghiên cứu mang dột biển gen gây bệnh Parkinson Phân tich kết qua cho thấy ti lộ phát dột biền nghiên cữu 30 ti lệ dột biến trẽn gen PRKN vị tri C.!OIOG>A lã 30, vị tri C.823OT lã 1/30; ti lộ đột biến gen P1NKI vị tri C.I273OT lã 1/30 Tất cã mầu dột biến có kiêu gen di họp t -ãc ô4 ugc V Hl TI LIU THAM KHO de Rijk MC TzounoC, BretelerMM, etal Prevalence of parkinsonism and Parkinson’s disease in Europe: the EUROPARKINSON Collaborative Study European Community Concerted Action on the Epidemiology of Parkinson’s disease J Neurol NeurOSurg Psychiatry 1997:62(1) 10-15 Zhang zx Roman GC Worldwide occurrence of Parkinson's disease: an updated review Neuroepidemiology 1993:12(4) 195-208 Bower JH, Maraganore DM McDonnell SK Rocca WA Incidence and distribution of parkinsonism in Olmsted County Minnesota 1976-1990 Neurology 1999.52(6) 1214-1220 Description of Parkinson's disease as a clinical syndrome - PubMed Accessed February 21 2023 Templeton JM Poellabaucr c Schneider s Classification of Parkinson’s disease and Its stages using machine learning Sc} Rep 2022 12(1) 14036 Sidransky E Nalls MA Aasly JO et al Multicenter analysis of glucocerebrosidase mutations in Parkinson's disease N Engl J Med 2009.361(17) 1651-1661 Klein MO Battagello DS Cardoso AR Hauser DN Bittencourt JC Correa RG Dopamine Functions Signaling, and Association with Neurological Diseases Cell Mol Neurobiol 2019.39( 1): 31 -59 Bệnh Parkinson - Rồi loạn thân kinh Câm nang MSD - Phiên ban dành cho chuyên gia Accessed March 2023 WikiJoumal of Medicine Medical gallery of Blausen Medical 2014 Wikiversity Accessed March 2023 10 Postuma RB Berg D Stem M et al MDS clinical diagnostic criteria for Parkinson's disease Moy Disord OffJ Moy Disord Soc 2015.30(12): 1591 1601 11 Ponsen MM Staffers D Booij J van Eck-Smit BLF Wolters EC Berendse IIW Idiopathic hyposmia as a preclinical sign of Parkinson’s disease, Ann Neurol 2004.56(2) 173-181 12 Kagi G Bhatia KP Tolosa E The role of DAT-SPECT in movement disorders J Neurol Neurosurg Psychiatry 2010 81(1) 5-12 ^H «4 HCC V Hl HỈỈ 13 Quinn PMJ Moreira PI Ambrosio AF Alves CH PINK1 PARKIN signalling 111 neurodegeneration and neuroinflammation Acta Neuropathol Connnun 2020,8(1) 189 14 Pahwa R Factor SA Lyons KE et al Practice Parameter treatment of Parkinson disease with motor fluctuations and dyskinesia (an evidence-based review) report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology Neurology 2006 66(7)983-995 15 Suchowersky o, Gronseth G Perlmutter J et al Practice Parameter neuroprotective strategies and alternative therapies for Parkinson disease (an evidence-based review) report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology Neurology 2006:66(7) 976-982 16 How Mutations in the PINK I Gene May Lead to Parkinson's Disease Accessed April 28» 2023 17 Obeso JA Stamelou M Goetz CG el al Past, present, and future of Parkinson's disease A special essay on the 200th Anniversary of the Shaking Palsy Mov Disord offJ Mov Disord Soc 2017; 32(9) 1264-1310 IS Scarffe LA Stevens DA Dawson VL Dawson TM Parkin and PINK much more than mitophagy Trends Neuroset 2014,37(6) 315-324 19 Drosophila pinkl IS required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin I Nature Accessed May 1,2023 20 Ge p Dawson VL Dawson TM PINK I and Parkin mitochondrial quality control a source of regional vulnerability in Parkinson's disease Mol Neurodegener 2020,15(1)20 21 Giãi trinh tự băng phương pháp Sanger Accessed May I 2023 22 Kann M Jacobs H Mohnnaiui K el al Role of parkin mutations in 111 community-based patients with early-onset parkinsonism Ann Neurol 2002:51(5)621-625 23 Sun M Latourelle JC Wooten GF et al Influence of heterozygosity for parkm mutation on onset age m familial Parkinson disease the GenePD study Arch Neurol 2006;63(6) 526-832 24 Chu MK Kim wc Choi JM et al Analysis of Dosage Mutation in PARK2 among Korean Patients with Early-Onset or Familial Parkinson's Disease J Clin Neurol Seoul Korea 2014 10(3)244-248 ^H «4 ugc V Hl 25 - Toil ND Thuan ND, Thuong MTH et al Rare and novel variants of PRKN and I’INKl genes in Vietnamese patients with early-onsct Parkinson's disease Mol Genet Genomic Med 2O2O;S(1O) el 163 26 Klein c Djarmati A Hednch K et al PINK I Parkin and DJ-1 mutations in Italian patients with early-onset parkinsonism EtirJHutn Genet EJHG 2005; 13(9) 1086-1093 -ãc ô4 ugc V Hl