GIỚI THIỆU
Cơ sở hình thành luận văn
Sốt rét hiện đang là mối lo ngại với y tế, khoản 5 năm gần đây có xu hướng giảm thấp về việc mắc và tử vong, song hiện nay thế giới còn đang đối mặt với nhiều vấn đề (WHO, 2019), trong đó muỗi anophen có khả năng kháng hóa chất và ký sinh trùng
Plasmodium spp thuộc chủng đa kháng thuốc Plasmodium falciparum kháng artemisinin và thuốc điều trị có thành phần artemisinine hay chiếc xuất (ACTs) được xác định tại các nước Tiểu vùng sông Mê Kông và sau đó lan rộng đến Bangladesh, Ấn Độ Tại Việt Nam, từ 2008 thực nghiệm hiệu lực thuốc sốt rét thực hiện hàng năm nhằm giám sát hiệu lực thuốc đã cho thấy Plasmodium falciparum biểu hiện giảm phản ứng và kháng thông qua quá trình loại bỏ hoàn toàn ký sinh trùng kéo dài sau điều trị dihydroartemisinin-piperaquin (DHA-PPQ) năm 2009 tại tỉnh Bình Phước (Monia Guidi et al., 2019) Từ năm 2010-2017, các thực nghiệm hiệu lực thuốc DHA-PPQ trong 7 tỉnh sốt rét trọng điểm ở miền Trung-Tây Nguyên và miền Nam cho thấy dù tỷ lệ điều trị khỏi cao (93-100%), song tỷ lệ bệnh nhân còn hiện diện sau 3 ngày điều trị (ngày thứ 3) trên 10% (Bình Phước 15,2%, Gia Lai 11,2% năm 2010 và có xu hướng kéo dài thời gian sạch ký sinh trùng, đến năm 2012, tỷ lệ dương tính ngày thứ 3 lên tới 30% và 31,6 % ở Quảng Nam và Bình Phước Tiếp sau đó, năm 2015 tỷ lệ ký sinh trùng dương tính ở ngày thứ 3 đã lên đến 50% ở Bình Phước, 20% ở Đăk Lăk, tỷ lệ thất bại muộn với thuốc DHA-PPQ lên tới 31,8% tại Bình Phước và gần đây các thực nghiệm giám sát hiệu lực thuốc kết hợp phân tích di truyền liên quan đến kháng chỉ ra tại các tỉnh Gia Lai, Đăk Lăk, Đăk Nông có đột biến gen liên quan kháng thuốc và tỷ lệ thất bại trên 40% (Huỳnh Hồng Quang và cs., 2020)
Phần lớn thực nghiệm và định nghĩa kháng thuốc của WHO và Mạng lưới Thực nghiệm kháng thuốc sốt rét toàn cầu (WWARN) dựa vào chủ yếu thông số chậm loại bỏ ký sinh trùng, đột biến gen và tính đa hình trên NST số 13 của Plasmodium falciparum (Ramharter M et al., 2008) Việt Nam có chung đường biên giới với Campuchia - quốc gia có tình hình kháng thuốc nghiêm trọng nhất toàn cầu và đang tiếp tục lan rộng Đăk Lăk là tỉnh thuộc Tây Nguyên có biên giới giáp với tỉnh Mondulkiri và Kratie của Campuchia, nên nguy cơ lan rộng kháng là một vấn đề nghiêm trọng
Theo khuyến cáo của WHO khi tỷ lệ thất bại với thuốc hiện dùng trên 10% phải thay đổi chính sách thuốc Điều này cho thấy cần thiết thực nghiệm một ứng viên thuốc mới có hiệu quả và độ đảm bảo để thay thế DHA-PPQ tại vùng kháng thuốc cũng như đề xuất phác đồ cho Bộ Y tế Trong đó, thuốc artesunate-mefloquine là một lựa chọn cho điều trị Plasmodium falciparum trong bối cảnh kháng thuốc đang lan rộng Nhiều thực nghiệm khác xác định kháng chỉ mới dừng lại ở mức xác định kháng đơn thuốc artesunate mà chưa đánh giá liệu Plasmodium falciparum có kháng cả thành phần mefloquine hay không? và với câu hỏi là đột biến gen nào ảnh hưởng đến kháng thuốc phối hợp này trên quần thể Plasmodium falciparum tại tỉnh Đăk Lăk Với ý nghĩa đó, đề tài “Nghiên cứu một số đột biến gen trên quần thể ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum liên quan đến kháng thuốc artesunate-mefloquine tại tỉnh Đăk Lăk” được tiến hành nhằm mục tiêu:
Mục tiêu nghiên cứu
Đánh giá hiệu lực điều trị artesunate-mefloquine trong việc chữa trị cho bệnh nhân nhiễm KSTSR Plasmodium falciparum chưa xuất hiện biến chứng tại tỉnh Đăk
Xác định một số đột biến gen ảnh hưởng đến kháng thuốc artesunate-mefloquine trên quần thể Plasmodium falciparum tại điểm thực nghiệm.
Câu hỏi nghiên cứu
Đặc điểm phân tử nào liên quan đến kháng thuốc artesunate-mefloquine trên quần thể P falciparum tại tỉnh Đăk Lăk
Phạm vi và đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Gen K13 và Plasmepsine 2/3 trên P falciparum tại tỉnh Đăk Lăk
Phạm vi nghiên cứu: Các mẫu KST P falciparum được thu tại tỉnh Đăk Lăk,
Phương pháp nghiên cứu
Kỹ thuật in-vivo đánh giá độ nhạy của của P falciparum với thuốc artesunate- mefloquine
Kỹ thuật tách chiết muối Salting out thu nhận DNA KTS sốt rét P falciparum – NUREX nhằm thu nhận DNA từ P falciparum
Kỹ thuật Nested PCR để phát hiện loài P falciparum và gen kháng artesunate- mefloquine
Giải trình tự: Mẫu được gửi công ty Macrogen Hàn Quốc.
Ý nghĩa nghiên cứu
Có bộ dữ liệu của đặc điểm gen của KST P falciparum gây kháng thuốc và không kháng thuốc ở Đăk Lăk, Việt Nam Đưa ra dữ liệu hỗ trợ việc phòng ngừa và điều trị sốt rét ở Đăk Lăk, Việt Nam đặc biệt là các KST gây kháng thuốc.
Kết cấu luận văn
Tính cấp thiết của đề tài
Câu hỏi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Chương II: Cơ sở lý thuyết
Tổng hợp về tình hình sốt rét và sốt rét kháng thuốc
Hiệu lực thuốc dihydroartemisinin-piperaquin với P falciparum Đặc điểm dược học hai thành phần trong viên artesunat-mefloquin (ASMQ) Tình hình thực nghiệm về hiệu lực thuốc artesunate-mefloquine Đột biến gen liên quan kháng artesunate-mefloquine ở Plasmodium falciparum Nguyên nhân phát sinh, phát triển KSTSR kháng thuốc
Cách tiếp cận nghiên cứu thuốc mới phối hợp liều artesunate-mefloquine
Chương III: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu: Các mẫu máu lấy từ các bệnh viện tỉnh Đăk Lăk Mẫu chỉ nhiễm đơn thuần P falciparum
- Phương pháp thu mẫu máu: phương pháp lấy máu tĩnh mạch
- Phương pháp đếm tổng số KTS sốt rét trong máu bằng buồng đếm hồng cầu
- Phương pháp Salting out thu nhận DNA tổng số
- Phương pháp Nested PCR với đoạn mồi K13-1
GCCTTGTTGAAAGAAGCAGA để khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu chứa gen K13
- Phương pháp NGS (next generation sequencing), được thực hiện bởi Macrogen
Chương IV: Kết quả và thảo luận
Kết quả nội dung 1 và thảo luận
Kết quả nội dung 2 và thảo luận
Chương V: Kết luận và đề nghị
CƠ SỞ TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.1 Tổng hợp về tình hình sốt rét và sốt rét kháng thuốc
Hiệu lực thuốc dihydroartemisinin-piperaquin với P falciparum
Cũng giống như các quốc gia lưu hành sốt rét khác trong tiểu vùng sông Mekong, tình trạng kháng thuốc đối với tất cả các loại thuốc tại Việt Nam nhiều thực nghiệm cũng đã được tiến hành và cho kết quả số liệu được lưu lại Vì vậy, DHA-PPQ hiện đang là lựa chọn hang đầu trong việc chữa sốt rét do nhiễm KSTSR Plasmodium falciparum theo Bộ Y tế hướng dẫn (2009-2016) và cho hiệu quả điều trị cao
DHA-PPQ là một loại thuốc kết hợp hấp thụ tốt, được sử dụng ngày càng nhiều ở các nước Đông Nam Á Artequick® và Arterakin® là 2 loại thuốc thuộc ACTs được khảo sát về liều lượng tại Gia Lai trên bệnh sốt rét Plasmodium falciparum Kết quả thực nghiệm cho thấy kết quả chữa trị khá tốt Artequick® đạt 100% và ở Arterakin là 94,6%
Trong giai đoạn 2000-2010, thực nghiệm của Tạ Thị Tính và cộng sự với thử nghiệm in vivo theo WHO (2009), thực ngiệm được tiến hành trong vòng 28 ngày tại Bình Phước.Thu thập số liệu về độ đảm bảo và hiệu quả của các loại thuốc PPQ, DHA,
7 artesunate và artemether theo từng mốc thời gian lần lượng là 3 ngày với PPQ, 7 ngày với DHA, 5 ngày với artesunate và artemether đơn trị liệu Tổng số 261 trường hợp điều trị artesunate trong 7 ngày cho thấy artesunate vẫn có hiệu quả cao (97-100%) Tuy nhiên, sự hiện diện của ký sinh trùng trên ngày thứ 3 trong năm 2010 (6,3%) và
2011 (8,7%) Hiệu quả diệt Plasmodium falciparum của artesunate tại xã Đăk Nhau, tỉnh Bình Phước với tỷ lệ loại bỏ sạch hoàn toàn KSTSR chỉ đạt 84,8% (2009) và giảm xuống 88% (2010) Đặc biệt, tỷ lệ sống của ký sinh trùng ở ngày thứ 3 là > 10% cụ thể là 2003 con số này đạt tới 16% và tại 2010 thì con số này đã tăng lên là 24% Arterakin vẫn có hiệu lực cao đối với Plasmodium falciparum tỷ lệ loại bỏ hoàn toàn KSTSR lên đến 97,8% nhưng ký sinh trùng còn tồn tại ở ngày thứ 3 là 15,3%, có 1 trường hợp điều trị sớm thất bại Tóm lại, DHA-PPQ trong các thử nghiệm lâm sàng tại Việt Nam trên trường hợp nhiễm thuộc chủng đa kháng thuốc số liệu về sử dụng thuốc trong 3 năm gần đây đạt tỷ lệ khỏi bệnh cao và đồng đều với nhau ở các tỉnh tiến hành thực nghiệm như Gia Lai, Bình Phước, Ninh Thuận, Quảng Trị, thông tin dựa trên các nghiên cứu của Huỳnh Hồng Quang, Bùi Quang Phúc và cs., (2017); Huỳnh Hồng Quang và cs., (2018); Huỳnh Hồng Quang, Nguyễn Ngọc Dũng, Đặng Đức Trí, Bùi Quang Phúc (2019)
Chữa trị sốt rét dựa trên artemisinin được công bố là phương án chọn lựa hàng đầu cho việc chữa bệnh sốt rét do nhiễm KSTSR Plasmodium falciparum trên toàn thế giới và khuyến cáo sử dụng do WHO đề xuất WHO đã công bố việc sử dụng ACTs như một giải pháp của việc chữa sốt rét, trong đó Plasmodium falciparum là loài lây nhiễm chủ yếu Các ACTs khi phối hợp với một loại thuốc có thời gian bán thải bán thải dài hơn liên quan đến cách thức hoạt động và arterimisinin (ACT) nhằm đạt được hiệu quả hoạt động nhanh chống khi sử dụng cả 2 loại thuốc Sự kết hợp sử dụng một trong năm loại thuốc Duo-Cotecxin®, Eurartesim®, CV Artecan®, Arterakine®, Artekin® với DHA-PPQ theo WHO công bố năm 2009 và 2018
Hình 2.1 Tình hình kháng thuốc ACTs do P falciparum tại Tiểu vùng MeKong từ năm 2016-2018 Nguồn: WHO, 2016 và 2019 Việc thay đổi chuyển từ sử dụng đơn thuần một loại thuốc để chữa bệnh sốt rét và loại bỏ hoàn toàn KSTSR sang sử dụng nhiều loại thuốc kết hợp trong việc chữa
Plasmodium falciparum thuộc chủng đa kháng thuốc như đã được chứng minh ở Thái
Lan hay Pê-ru Thử nghiệm sử dụng DHA-PPQ một lần mỗi ngày trong quản lý
Plasmodium falciparum thuộc chủng đa kháng thuốc; hay DHA-PPQ sử dụng liên tục trong 3 ngày phòng Plasmodium falciparum thuộc chủng đa kháng thuốc tại Việt Nam Thu thập dữ liệu và kết quả của artesunate + mefloquine với DHA-PPQ trong Các thực nghiệm mở; hoặc thực nghiệm mở đánh giá hiệu quả và độ an toàn của DHA-PPQ trong bệnh sốt rét Plasmodium falciparum ở Myanmar và Campuchia Nhiều thực nghiệm được tiến hành để thu thập và so sánh kết quả hiệu lực của các loại thuốc với nhau cho thấy DHA-PPQ vẫn hiệu quả, Artequick có hiệu lực cao so với các thuốc khác theo Lê Quốc Hùng và cộng sự (2004); Hasifa Bukirwa và cộng sự (2014) Thông tin về kết quả đã được đánh giá tại hai thử nghiệm Thử nghiệm đầu tiên trên 32 trẻ em tại Burkina Faso, các bệnh nhân này được cho sử dụng DHA- PPQ, sau khi kiểm trả bằng PCR Kết quả khỏi bệnh là 93,3% Các thực nghiệm khác tại Thái Lan, bệnh nhân là 25 người trưởng thành thuốc sử dụng vẫn là DHA- PPQ tỷ lệ khỏi bệnh là 100% ở ngày D90 (Ronnatrai Rueangweerayut và cộng sự,
2012) Tuy nhiên vẫn xảy ra tác dụng phụ khi sử dụng thuốc ở châu Á, nhóm DHA-PPQ có tỷ lệ bị ít nhất 1 tác dụng phụ là 69,4% và 72,4% với nhóm dùng ASMQ Nhiều thông tin về các đặc điểm của tác dụng phụ ở hai nhóm thuốc là như nhau về việc tan máu và giảm tiểu cầu nhẹ Trong suốt quá trình thực nghiệm, những thay
9 đổi trong phòng thực nghiệm vẫn nhất quán cho đến khi phục hồi Kéo dài khoảng QTc trên ECG được báo cáo là tác dụng phụ ở 5,4% trường hợp khi sử dụng DHA- PPQ và con số đó thay đổi khi sử dụng ASMQ thành 4,2% Được sử dụng thuốc ít nhất là 2 loại để loại bỏ hoàn toàn thể phân liệt có cách thức hoạt động đặc trưng Điều này làm tăng hiệu quả điều trị và cũng làm chậm quá trình hình thành kháng thuốc Để giảm thiểu việc kháng thuốc, TCYTTG khuyến cáo nên loại bỏ các liệu pháp dùng một loại thuốc điều trị và các trường hợp sốt rét nên được sử dụng thuốc ACTs là thuốc phối hợp một loại thuốc chứa artemisinin và các loại thuốc khác có cách thức hoạt động khác Đó là cách nó được sinh ra Dẫn xuất artemisinin làm giảm nhanh số lượng ký sinh trùng và loại thuốc còn lại có cách thức hoạt động khác sẽ hạn chế xuất hiện kháng thuốc
DHA-PPQ có hiệu quả cao khi sử dụng, nhưng chưa phù hợp trong các phối hợp ACTs vì tính ổn định nhiệt kém của nó khi phối hợp Phối hợp artesunate- piperaquine có thể là một lựa chọn thay thế tốt hơn do ưu điểm ổn định nhiệt độ hơn DHA Sự kết hợp sẽ có hiệu quả như nhau vì AS được chuyển hóa nhanh chóng thành DHA sau khi uống Các điểm quan tâm trong thực nghiệm cung cấp thông tin mới về dược động học của PPQ, bao gồm cả thực nghiệm in vivo lâm sàng và phi lâm sàng, đồng thời bổ sung thêm câu hỏi về việc sử dụng PPQ làm thuốc đồng hành trong các ACT ở các vùng sốt rét Điều này có nghĩa là liệu pháp sử dụng 2 loại DHA-PPQ là công cụ sống tốt nhất có thể sử dụng để bài trừ bệnh SR do nhiễm Plasmodium falciparum ACTs hỗ trợ việc chữa trị lâm sàng và loại bỏ hoàn toàn KST cũng như giúp giảm áp lực thực nghiệm và xử lý đối với sự xuất hiện kháng thuốc
Năm 2019, đội thực nghiệm có khảo sát tác dụng của DHA-PPQ thực nghiệm tại tỉnh Đăk Lăk Khi quan sát tổng số 98 trường hợp nhiễm Plasmodium falciparum chưa xuất hiện biểu hiện khác thấy hiệu quả DHA-PPQ sau khi có kết quả PCR đã giảm còn 31,9%, tỷ lệ ngày thứ 3 trên 22%, đặc biệt có trường hợp tái nhiễm KSTSR lên đến gần 60% trong vòng 42 ngày sau điều trị, trường hợp tái nhiễm dù đang trong thời gian
14 ngày đầu cũng có xuất hiện, thất bại lâm sàng muộn 36,1% (36/98), thất bại KST muộn 31,9% (23/98), thất bại chung 38% Gen K13 là gen mang đột biến có ảnh hưởng đến kháng thuốc kết quả, số liệu sau khi chạy PCR kiểu C580Y chiến trọng số rất lớn và tăng Plasmepsine lên thành số lượng 2 CNV và/ hoặc đột biến loại ExoE415G (Huỳnh Hồng Quang và cs., 2019) Sau khi thu thập và phân tích chủng Plasmodium
10 falciparum, kháng thuốc đã xuất hiện không chỉ đúng với huyện Krông Năng mà còn xảy ra với nơi giáp ranh của nó là huyện Ea Sup.
Đặc điểm dược học hai thành phần trong viên artesunat-mefloquin (ASMQ)
Artesunate (AS) thuộc lớp sesquiterpen với cầu nối endoperoxide, dẫn suất bán tổng hợp artemisinine, thuốc AS có hoạt tính chống lại tất cả loài Plasmodium spp ở người, kể cả chủng kháng thuốc Về cách thức hoạt động, nhiều giả thuyết cho rằng thông qua cơ chế sinh các gốc tự do vì phản ứng với haem, sản phẩm gốc tự do này là các protein KSTSR alkyl hóa Nó ức chế thành phần calcium adenosine triphosphatase enzyme cần thiết cho KSTSR Thuốc ức chế protein EXP1 của Plasmodium spp., đây là loại glutathione S-transferase chịu trách nhiệm bẻ gãy hematin theo cơ chế gây độc tế bào Người ta không biết làm thế nào để kéo dài sự ức chế này để góp phần vào hoạt động của AS
Hình 2.2 Quá trình chậm loại bỏ hoàn toàn Plasmodium khi sử dụng thuốc artemisinin Các chất chuyển hóa hoạt động khác và đặc tính vận chuyển qua màng thay đổi, có thể ức chế dòng dinh dưỡng đến KSTSR
Hình 2.3 Quy trình bán tổng hợp thuốc artemisinins
Về mặt dược lực, liều AS 2,4mg/kg cho người lớn nhiễm Plasmodium falciparum có Cmax là 11,33 mcg/L, khả năng lưu lại rất ngắn 2,7 giờ & thể tích phân bố 0,14 L/kg Một số tác dụng phụ không báo trước có thể gặp như chậm nhịp tim, kéo dài khoảng QTc, trên hệ tiêu hóa có thể buồn nôn, non, tiêu chảy, táo bón Trên hệ thần kinh trung ương có thể gặp nhức đầu, ù tai hay trên hệ huyết học có thể gặp giảm bạch cầu hạt và bạch cầu đa nhân trung tính có thể phục hồi Tương tác thuốc có thể xảy ra khi dùng đồng thời AS với mefloquine (MQ) dẫn đến làm giảm nồng độ tối đa và tăng đào thải MQ, song không có sự khác biệt về mặt phơi nhiễm thuốc tổng thể, nên MQ được khuyên dùng ít nhất 24 giờ sau khi dùng AS
Trong nghiên cứu năm 2015 của Judith Straimer và cs., đã chỉ ra rằng ở arteminisinins và các dẫn xuất của nó có khả năng chống lại tất cả các giai đoạn phát triển vô tính ở ký sinh trùng trong máu nhờ việc kích hoạt quá trình phân hủy hemoglobin và việc giải phóng các heme khi phản ứng với Fe2 + cắt đứt các liên kết endoperoxide Kích hoạt tạo ra các gốc tự do được cho là gây ra stress oxy hóa và làm hỏng các đại phân tử tế bào, bao gồm các thành phần màng ký sinh trùng, protein và lipid trung tính (Hartwig CL cs., 2009; Antoine T và cs., 2014)
Cũng trong nghiên cứu này tác giả đã chỉ ra được việc thử nghiệm khi đưa nhiều loại đột biến có kiểm soát vào quần thể KSTSR Plasmodium falciparum P441L,
E252Q, G538V, A675V và C580Y thì với số liệu thu thập được Số ca có đột biến C580Y cho tỷ lệ sống sót của KSTSR là cao nhất sau khi thử nghiệm thuốc artemisinin Phản ứng phân tử để đưa ra tác động của thuốc vẫn đang được làm rõ
Thuốc thuộc lớp chiral quinoline methanol, nhóm thuốc arylaminoalcohols, hay 4-aminoquinolein, có hoạt tính chống KSTSR của các Plasmodium spp nhiễm trên người Nó cũng có một số hoạt tính chống lại thể hữu tính hay giao bào của P vivax,
P malariae và P ovale, P knowlesi Thuốc không có hiệu quả chống lại thể giao bào Plasmodium falciparum và thể ngoại hồng cầu ở gan của các Plasmodium spp
Về cách thức hoạt động, MQ gắn màng có thể ức chế sự xâm nhập của merozoite và tương tác với các protein liên quan đến lipid màng của KSTSR nên sẽ dẫn đến cản đường và ngăn chặn tiêu thụ chất dinh dưỡng MQ gắn với haem, hình thành một phức hợp mà có thể gây độc cho KSTSR Về dược động học, MQ hoàn tan kém trong nước nhưng sinh khả dụng tương đối cao Thời gian bán thải loại trừ 50% số thuốc dài từ 14-28 ngày, tỷ lệ gắn kết protein huyết tương trên 98% Các phân lập
P falciparum tại thực địa kháng MQ cho thấy tăng số lượng gen Pfmdr1 và trình diện gen quá mức mà pgh-1 có thể liên quan đến kháng thành phần MQ
Trên phụ nữ mang thai, thuốc MQ an toàn, song vẫn còn một số quan tâm về việc sử dụng nó trong 3 tháng đầu Một số tác dụng phụ không báo trước nghiêm trọng nhất khi điều trị MQ là độc tính tâm thần kinh, tuy nhiên một tỷ lệ cực kỳ nhỏ là người ta quan sát trên 10 năm sau điều trị, nên cũng không thể xác nhận mối quan hệ nhân quả và các triệu chứng có thể biểu hiện từ nhẹ đến đe dọa tính mạng Các phản ứng nghiêm trọng tương tự như đã từng thấy sau liệu trình điều trị khi dùng dự phòng bằng MQ, tỷ lệ từ 1/10.000 và 1/20.000 trên các thực nghiệm quy mô lớn
Hình 2.4a Cấu trúc hóa học artesunate Hình 2.4b Cấu trúc hóa học mefloquine
Nhờ cách thức hoạt động và khả năng lưu lại thuốc của từng loại thuốc khác nhau, nên sẽ hiệp đồng tác động trên KSTSR nhanh hơn, giúp cho kéo dài khả năng lưu lại trung bình của thuốc ASMQ và tăng tác dụng diệt nhanh tải lượng KSTSR và gián tiếp giảm sinh các giai đoạn hữu tính của Plasmodium spp.
Tình hình thực nghiệm về hiệu lực thuốc artesunate-mefloquine
Liệu pháp ACTs được ưu tiên lựa chọn đối với Plasmodium falciparum tại nhiều quốc gia trên thế giới và liều lượng được công bố trước đó bởi TCYTTG giới tiệu vào năm 2010 đến hiện tại vẫn đang đứng đầu trong việc chọn lựa các loại thuốc dùng chung ACTs (WHO, 2010) Trong TNLS ngẫu nhiên, tại Myanmar đánh giá kết quả 5 loại ACTs liều lượng được công bố:
Bảng 2.1 Số ca tái nhiễm sau khi sử dụng thuốc trên Plasmodium falciparum
Loại thuốc Ngày đầu Ngày thứ 63
ASMQ viên phối hợp 169 0 artesunat-amodiaquin 155 2
Tại Campuchia, việc sử dụng ASMQ trong 3 ngày hiện là phương pháp điều trị được lựa chọn cho những vùng không thể điều trị bằng DHA-PPQ mang lại kết quả khá ấn tượng 99% ca điều trị thành công (Chanaki và cs., 2013) Các thực nghiệm được tiến hành để thể hiện hiệu quả, dược động và độ đảm bảo của ASMQ kết hợp liều đã được công bố trước trong việc chữa bệnh nhân nhiễm KSTSR Plasmodium falciparum ở Ấn Độ đã thể hiện ASMQ có hiệu quả tốt và ở những vùng kháng chloroquine không gây biến chứng (Nguyễn Thị Liên Hạnh và cs., 2017) Để so sánh về sự kết hợp liều lượng thuốc đã được công bố ASMQ và AL trong việc điều trị bệnh sốt rét Plasmodium falciparum ở trẻ em dưới 5 tuổi ở châu Phi cận Sahara mà không gây biên chứng Kết quả thể hiện thấy tỷ lệ khỏi bệnh sau kiểm tra PCR ở ngày thứ 63 là 90,9% (n70) ở nhóm ASMQ và 89,7% (n65) ở nhóm AL, số liệu cho thấy ASMQ hoàn toàn đảm bảo về mặt hiệu quả và ưu tiên sử dụng cho các cá thể nhiễm Plasmodium falciparum dưới 5 tuổi mà không có biểu hiện khác theo Bùi Quang Phúc, Tạ Thị Tĩnh, Huỳnh Hồng Quang và cs., (2013) Đồng thời nhóm
14 thực nghiệm Marielle K và cộng sự (2010) với liều dùng cho bệnh sốt rét ở trẻ em thực nghiệm mức độ hiệu quả, độ an toàn của ASMQ dạng viên nang Tổng cộng 71 bệnh nhân từ 1-13 tuổi nhiễm Plasmodium falciparum không có biểu hiện khác được chia thành 2 nhóm: 41 số ca nhiễm là trẻ nhỏ từ 10-20kg được sử dụng liệu trình uống viên nang; nhóm thứ 2 với 30 ca nhiễm là nhóm trẻ lớn và sẽ được sử dụng thuốc viên Tất cả được sử dụng thuốc một lần một ngày và sẽ tiến hành kiểm tra tại ngày thứ 3
Tỷ lệ khỏi bệnh tại ngày thứ 28 được đánh giá là không còn tái phát ký sinh trùng trong máu nên tỷ lệ khỏi bệnh là 100% Các tác dụng phụ phổ biến nhất 11% số ca có hiện tượng đau bụng, 17% nhức đầu, 17% nôn mửa Kết quả thực nhiệm hỗ trợ việc xác nhận thuốc có hiệu quả, an toàn và hấp thụ tốt với viên nang trong việc chữa bệnh cho trẻ em bị nhiễm P.falciparum ở Châu Phi (De la Hoz Restrepo F và cs., 2012)
Việc sử dụng ASMQ kết hợp đã được có nhiều thực nghiệm mang lại kết quả khả quan và đảm bảo trong việc chữa bệnh sốt rét Plasmodium falciparum không có biểu hiện khác theo TCYTTG và đã được khảo sát lại sau các thực nghiệm nhiều nơi (WHO,
2019) Thực nghiệm về bốn loại thuốc do TCYTTG đề xuất cho thấy ASMQ có tác dụng ức chế bệnh sốt rét do nhiễm P falciparum hiệu quả nhất Kết quả lâm sàng của ASMQ đã được chứng minh ở nhiều nơi trên thế giới, ví dụ điểm hình là Ấn Độ, nơi có hơn 18.000 ca được sử dụng thuốc Việc công nhận như vậy chứng tỏ rằng ASMQ có tiêu chuẩn cao về chất lượng, an toàn và hiệu quả, đồng thời được sử dụng rộng rãi ở Châu Á và Châu Phi với tư cách là một trong 5 ACTs ưu tiên của TCYTTG
Các thực nghiệm đa trung tâm đánh giá hiệu quả và độ đảm bảo của phác đồ ASMQ (Artequin™) với chủng P.falciparum thuộc chủng đa kháng thuốc tại phía Đông Bắc, Bắc miền Trung, Tây Nam và Đông Nam của Nigeria và phân chia bệnh nhân thành hai nhóm có cân nặng khác nhau: Nhóm có cân nặng từ 15-29kg và nhóm
≥ 30 kg theo đề cương của TCYTTG với liều AS là 4 mg/kg và MQ là 25 mg/kg trong
3 ngày liên tiếp Các bệnh nhân được quan sát đến 28 ngày để đánh giá về mặt ký sinh trùng ngày 1, 2, 3, 7 và 28 Tổng số 446 ca đưa vào thực nghiệm và 431 ca hoàn thành liệu trình Tỷ lệ khỏi bệnh trên cả hai nhóm trên 90% ở ngày thứ 28 Thời gian loại bỏ hoàn toàn KSTSR trên nhóm 1 và 2 lần lượt là 40,1 và 42,4 giờ Thuốc ASMQ tỏ ra có hoạt tính diệt giao bào tốt, thời gian loại bỏ hoàn toàn giao bào của ASMQ lần lượt 42,0 và 45,6 giờ trên nhóm 1 và nhóm 2 Không thấy tác dụng phụ không báo trước
15 nghiêm trọng nào, một số tác dụng phụ không báo trước xuất hiện như đau đầu, chóng mặt, nôn mửa, đau bụng
Tietche (2012) đánh giá hiệu lực ASMQ trên trẻ em Cameroon mắc sốt rét P falciparum với TNLS nhãn mở, không so sánh trên các trẻ em để đánh giá hiệu lực và tác dụng phụ không báo trước trên tâm thần kinh Tổng số 220 bệnh nhi nặng từ 10- 20kg vào TNLS và 213 ca hoàn thành Thuốc ASMQ được cho mỗi ngày một lần trong
3 ngày Phân tích thấy 13,1% số ca có biểu hiện tác dụng phụ không báo trước, biểu hiện tâm thần kinh nhẹ thông qua bộ câu hỏi cấu trúc và trong số đó có 3,8% mất ngủ có liên quan thuốc và biểu hiện khác ( 5,2 giờ theo quy định WHO, 2019)
Dựa vào các chỉ số phân tích trên 55 ca theo dõi nhiễm P falciparum đơn thuần, chỉ số K là 0,1030, thời gian làm sạch dung khối ký sinh trùng một nửa hay chỉ số slope là 6,73 (> 6,2 giờ), chỉ số này giải thích cho sự kéo dài thời gian làm sạch thể vô tính của thuốc AP Các chỉ số trung bình làm sạch 50% dung khối (PC50), hay PC75, PC90 và PC99 của các bệnh nhân lần lượt 15,21; 19,75; 23,40 và 29,78 Các số liệu trờn cho thấy thuốc AP cú thời gian làm sạch ẵ dung khối cao hơn 6,2 giờ tại thời điểm 50% (Bùi Quang Phúc và cộng sự., 2019; Roth JM và cộng sự., 2018)
Cỏc số liệu trờn cho thấy thuốc ASMQ cú thời gian loại bỏ hoàn toàn ẵ tải lượng KSTSR là 6,33 giờ cao hơn 5,2 giờ khi so sánh với trị số chuẩn trung bình do hoặc các vùng khác đã quan sát liên tục (WHO, 2019)
Bảng 4.11 Thời gian loại bỏ hoàn toàn giao bào Plasmodium falciparum trong 7 ngày điều trị ASMQ
Thông số phân tích Plasmodium falciparum
Số ca thực nghiệm từng nhóm 37
Số ca có giao bào 2 (5,4%)
Thời gian sạch giao bào (tất cả giai đoạn I-V)
Xét về khía cạnh loại bỏ hoàn toàn giao bào của 2/37 ca sốt rét nhiễm P falciparum trên nhóm bệnh nhân dùng ASMQ Số liệu phân tích KSTSR đồng thời với các vô tính và thể hữu tính cho thấy sau 12-36 giờ Chưa có ca nào sạch giao bào, nhưng đến sau 48-60 giờ có 1/2 ca (50%), đến sau 72 giờ có 2/2 ca (100%) số ca có giao bào sạch hoàn toàn
So sánh với các nghiên cứu gần đây, trong số 69 ca P falciparum thu nhận, theo dõi trong 7 ngày đầu hết và hết liệu trình 42 ngày, số ca phân tích đến ngày D3 là 65, tỷ lệ tồn tại KST thể vô tính ngày D3 là 26,2% (CI95%; 16,0-38,5) Số liệu phân tích sinh học phân tử các trường hợp tái xuất hiện KST trong suốt 42 ngày theo dõi, cho thấy ở thời điểm từ ngày D14 và D28 không có ca nào tái xuất hiện KST Tuy nhiên,
56 đến ngày D28 có 1/69 ca (1,4%) xác định là tái phát và 1/69 ca (1,4%) xuất hiện vào ngày D35 là tái nhiễm/ nhiễm mới Điều này cho thấy chỉ số nguy cơ tái phát của thuốc mới AP trong điều trị sốt rét do P falciparum chưa biến chứng là rất thấp
Về mặt cơ chế tác động của thuốc ACTs có thành phần artemisinins và dẫn suất artesunate không trực tiếp tác động trên thể hữu tính giao bào nhưng đã gián tiếp làm giảm nhanh, thậm chí diệt không còn giai đoạn chuyển tiếp từ thể tư dưỡng và phân liệt sang giao bào, nên đã phần nào làm giảm và sạch giao bào của P falciparum Xét về khía cạnh làm sạch giao bào của 4 ca sốt rét nhiễm trên nhóm bệnh nhân nhiễm đơn thuần P falciparum dùng AP, số liệu phân tích KSTSR thể hữu tính cho thấy sau 24 giờ, chưa có ca nào sạch giao bào, nhưng đến giờ thứ 36 giờ, 48 giờ, 72 giờ chỉ có 2/4 ca sạch giao bào và đến giờ 84 thì cả 4 ca đều sạch giao bào Kết quả này tương tự như trong nghiên cứu của các thuốc ACTs khác như DHA-PPQ, A/L và artesunate-amodiaquine
Huỳnh Hồng Quang năm 2017-2018 cũng đã tiến hành thực nghiệm với 55 ca P falciparum thu thập từ 3 huyện Cư Jut, Tuy Đức và Đăk Mil của Đăk Nông, quan sát trong 7 ngày đầu và sau khi sử dụng thuốc 42 ngày, tỷ lệ hiện diện KSTSR ngày thứ
3 là 13 (25,5%) Sau đó, đến ngày thứ 4 chỉ còn 2 ca còn KST dương tính sau điều trị
AP Kết quả này chỉ rõ thời gian loại bỏ hoàn toàn KST ở điểm Đăk Nông còn kéo dài sau 3 ngày như nhiều thực nghiệm khác trước đây giai đoạn 2015-2017 tại các điểm quan sát kháng thuốc liên tục ở điểm nóng SRLH Bình Phước, Đăk Nông và Gia Lai Dựa vào các chỉ số phân tích trên 55 ca quan sát nhiễm P falciparum đơn thuần, chỉ số K là 0,1030, thời gian loại bỏ hoàn toàn dung khối KST một nửa hay chỉ số slope là 6,73 (> 6,2 giờ), chỉ số này giải thích cho sự kéo dài thời gian loại bỏ hoàn toàn của thuốc AP Các chỉ số trung bình loại bỏ hoàn toàn 50% dung khối (PC50), hay PC75, PC90 và PC99 của các bệnh nhân lần lượt 15,21; 19,75; 23,40 và 29,78 Các số liệu trờn cho thấy thuốc AP cú thời gian loại bỏ hoàn toàn ẵ dung khối cao hơn 6,2 giờ tại thời điểm 50% (Huỳnh Hồng Quang và cs., 2018)
Xét về khía cạnh loại bỏ hoàn toàn giao bào của 6/69 ca sốt rét nhiễm P falciparum trên nhóm bệnh nhân dùng AP Số liệu thu thập về KSTSR thể hữu tính cho thấy sau 24 giờ, không xuất hiện ca nào loại bỏ hoàn toàn giao bào, nhưng sau 36 giờ, 48 giờ, 72 giờ có 2/6 ca (33,3%), 3/6 (50%) và 3/6 (50%) ca sạch giao bào và đến giờ thứ 72 thì cả 6 ca đều sạch giao bào (Roth JM et al., 2018) Về mặt cơ chế tác động
57 của thuốc ACTs có thành phần artemisinins và dẫn suất artesunate không trực tiếp tác động trên thể hữu tính giao bào nhưng đã gián tiếp làm giảm nhanh, thậm chí diệt không còn giai đoạn chuyển tiếp từ thể tư dưỡng và phân liệt sang giao bào, nên đã phần nào làm giảm và sạch giao bào của P falciparum Xét về khía cạnh loại bỏ hoàn toàn giao bào của 4 ca sốt rét nhiễm trên nhóm trường hợp nhiễm một loại P falciparum dùng AP, số liệu phân tích KSTSR thể hữu tính cho thấy sau 24 giờ, chưa có ca nào loại bỏ hoàn toàn giao bào, nhưng giờ thứ 36 giờ, 48 giờ, 72 giờ chỉ có 2/4 ca loại bỏ hoàn toàn giao bào và tại thời điểm giờ 84 thì cả 4 ca đều sạch giao bào Điều này dường như tư tượng trong thực nghiệm của các thuốc ACTs khác như DHA-PPQ, A/L và artesunate-amodiaquine.
Thu nhận mẫu gen Kelch 13 sau Nestted PCR
Hình 4.3 Kết quả điện di sau khi chạy Nested-PCR cho kết quả là 849 bp Tất cả các mẫu nều được thu nhận DNA tổng số bằng phương pháp Salting out, sau đó nghiên cứu viên kiểm tra độ tinh sạch DNA bằng kiểm soát các thông số A260/A280 Tiến hành chạy nestted-PCR với các đoạn mồi đặc hiệu Outer K13-1 CGGAGTGACCAAATCTGGGA và K13-4 GGGAATCTGGTGGTAACAGC để khuyếch đại đoạn DNA đặc hiệu chứa gen Kelch 13 của loài P falciparum có kích thước khoảng 2096 bp Sử dụng đoạn mồi K13-2 GCCAAGCTGCCATTCATTTG và đoạn mồi K13-3 GCCTTGTTGAAAGAAGCAGA để thực hiện quá trình Inter để khuyếch đại đoạn DNA đặc hiệu chứa gen PF3D7-1343700 kháng artermisnin của
Plasmodium có kích thước khoảng 849 bp
Sản phẩm PCR được điện di trờn phiến thạch agarose 2%, nhuộm bằng 4 àL ethidium bromide trong 10 phút và sau đó quan sát sản phẩm trên máy đọc UV, ghi hình vào máy tính Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại bằng kỹ thuật Nested-PCR được bảo quản ở 4 o C cho trong 1 tuần hoặc -20 đến -80 o C để lưu trữ (Bo Huang và cộng sự, 2015)
Hình 4.4 Ảnh sử dụng phần mềm Auto Dock để kiểm tra vị trí đột biến C580Y
4.2.4 Đột biến điểm trên gen mã hóa protein K13, tăng bản sao Pfmdr1
Sau khi tiến hành tách chiết DNA tổng số của 37 ca bằng phương pháp Salting Bảng 4.12 Một số loại đột biến được phát hiện trên quần thể ký sinh trùng sốt rét
TT Chỉ số phân tích
1 Số mẫu có đột biến K13 36/37 (97,3%) Hiện nay các đột biến vẫn còn đang tiếp tục đánh giá vai trò trên cả in vivo, in vitro và ex vivo RSA0-3
2 Loại đột biến đã được phát hiện Wild type, C580Y
Loại đột biến K13 quan trọng duy nhất được phát hiện
Loại đột biến xác định kháng C580Y chiếm ưu thế và là kiểu hình đột biến nổi trội trên quần thể P falciparum tại các nước Tiểu vùng Sông Mê Kông
4 Loại đột biến hoang dại
Wid type 12/37 (32,4%) Loại đột biến này chiếm ưu thế trong quần thể tự nhiên
Các đột biến gen K13 khác xác định kháng artemisinine (N458Y,
0 Đột biến xác định kháng thuốc do P falciparum sau khi đủ bằng chứng trên in vivo, in vitro và thử nghiệm làm sạch thể nhẫn, nhưng chưa phát hiện ở nghiên cứu này
Các đột biến ứng viên
0 Đột biến ứng viên là đột biến mới chỉ phát hiện góc độ phân tử, nhưng cần thêm bằng chứng in vitro, RSA và in vivo nữa
Nguồn: So sánh với bảng phân loại các đột biến xác định và các đột biến ứng viên theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2018)
2 K13propeller ATGAAAGCATGGGTAGAGGTGGCACCTTTGAATACCCCTAGATCATCAGCTATGTGTGTTGCTTTTGATAATAAAATTTATGTCATTGGTGGAACTAAT 3.126 atgaaagcatgggtagaggtggcacctttgaataccc B tagatcatcagctatgtatgttgcttttgataataaaatttatgtcattggtggaactaat 4.125 ( 639 ATGAAAGCATGGGTAGAGGTGGCACCTTTGAATACCCCTAGATCATCAGCTATGTATGTTGCTTTTGATAATAAAATTTATGTCATTGGTGGAACTAAT 5.124 ATGAAAGCATGGGTAGAGGTGGCACCTTTGAATACCCCTAGATCATCAGCTATGTATGTTGCTTTTGATAATAAAATTTATGTCATTGGTGGAACTAAT 6.119 ATGAAAGCATGGGTAGAGGTGGCACCTTTGAATACCCCTAGATCATCAGCTATGTGTGTTGCTTTTGATAÀTAAAÀTTTATGTCATTGGTGGAACTÀAT 7.106 ATGÀAAGCATGGGTAGAGGTGGCACCTTTGÀATACCCCTAGATCATCAGCTATGTGTGTTGCTTTTGATAATAAAÀTTTATGTCÀTTGGTGGÀÀCTAAT 8.99 ÀTGAAÀGCATGGGTAGÀGGTGGCACCTTTGAÀTACCCCTAGÀTCATCAGCTATGTGTGTTGCTTTTGATAATAAAÀTTTATGTCATTGGTGGAACTÀAT 9.78 ATGAAAGCATGGGTAGAGGTGGCACCTTTGAATACCCCTAGATCATCÀGCTATGTATGTTGCTTTTGATAÀTAAAATTTATGTCATTGGTGGAACTAAT 10.77 ATGAAAGCATGGGTAGAGGTGGCACCTTTGAATACCCCTAGATCATCAGCTATGTATGTTGCTTTTGATAATAAAATTTATGTCATTGGTGGAACTAAT 11.76 ATGAAAGCATGGGTAGAGGTGGCACCTTTGAATACCCCTAGATCATCAGCTATGTATGTTGCTTTTGATAATAAAATTTATGTCATTGGTGGAACTAAT 12.74 ATGAAAGCATGGGTAGAGGTGGCACCTTTGAATACCCCTAGATCATCAGCTATGTATGTTGCTTTTGATAATAAAATTTATGTCATTGGTGGAACTAAT 13.67 ATGAAAGCATGGGTAGAGGTGGCACCTTTGAATAC'CCC’TAGATCATCAGCTATGTGTGTTGCTTTTGATAATAAAATTTATGTCATTGGTGGAACTAAT 14.65 ATGAAÀGCATGGGTAGÀGGTGGCACCTTTGAATACCCCTAGÀTCATCAGCTATGTATGTTGCTTTTGATAÀTAAÀÀTTTATGTCÀTTGGTGGAÀCTAAT
20 20 ( 639 ATGAAÀGCATGGGTAGÀGGTGGCACCTTTGAATACCCCTAGATCATCAGCTATGTATGTTGCTTTTGATAATAAAÀTTTATGTCATTGGTGGAACTAAT 21.5 ÀTGÀAÀGCATGGGTAGAGGTGGCACCTTTGÀATACCCCTAGATCÀTCAGCTATGTGTGTTGCTTTTGATAATAÀÀÀTTTATGTCÀTTGGTGGAACTAAT 22.4 ATGAAAGCATGGGTAGAGGTGGCACCTTTGAATACCCCTAGATCATCAGCTATGTGTGTTGCTTTTGATAÀTAAAATTTATGTCATTGGTGGAACTAAT 23.3 ATGÀAAGCATGGGTAGAGGTGGCACCTTTGAATACCCCTAGATCATCAGCTATGTGTGTTGCTTTTGATAÀTAAAATTTATGTCATTGGTGGAACTAAT 24.2 atgaaagcatgggtagaggtggcacctttgaatacccctagatcatcagctatgt G tgttgcttttgataataaaatttatgtcattggtggaactaat 25.1 ATGÀAAGCATGGGTAGAGGTGGCACCTTTGÀATACCCCTAGATCATCAGCTATGTGTGTTGCTTTTGÀTAÀTAAÀÀTTTATGTCÀTTGGTGGAÀCTAAT
2 K13propeller GGTGAGAGATTAAATTCTATTGAAGTATATGAAGAAAAAATGAATAAATGGGAACAATTTCCATATGCCTTATTAGAAGCTAGAAGTTCAGGAGCAGCT 3.126 ■ GGTGAGAGATTAAATTCTATTGAAGTATATGAAGAAAAAATGAATAAATGGGAACAATTTCCATATGCCTTATTAGAAGCTAGAAGTTCAGGAGCAGCT 4.125 ( 639 GGTGAGAGATTAAATTCTATTGAAGTATATGAAGAAAAAATGAATAAATGGGAACAATTTCCATATGCCTTATTAGAAGCTAGAAGTTCAGGAGCAGCT 5.124 GGTGAGAGATTAAATTCTATTGAAGTATATGAAGAAAAAATGAATAAATGGGAACAATTTCCATATGCCTTATTAGAAGCTAGAAGTTCAGGAGCAGCT 6.119 GGTGAGAGATTAAATTCTATTGAAGTATATGAAGAAAAAATGAATAAATGGGAACAATTTCCATATGCCTTATTAGAAGCTAGAAGTTCAGGAGCAGCT 7.106 GGTGAGAGATTÀAATTCTATTGAAGTATÀTGAAGAAAAAATGÀATAAATGGGAÀCAATTTCCATÀTGCCTTATTÀGAAGCTAGAAGTTCAGGAGCAGCT 8.99 GGTGAGAGATTAAATTCTATTGAAGTATATGAAGAAAAAATGAATAAATGGGAACAATTTCCATATGCCTTATTAGAAGCTAGAAGTTCAGGAGCAGCT 9.78 GGTGAGAGATTAAATTCTATTGAÀGTATÀTGAAGAÀAAAATGÀÀTAAATGGGAÀCAATTTCCATÀTGCCTTATTÀGAAGCTAGAÀGTTCAGGAGCAGCT 10.77 GGTGAGAGATTAAATTCTATTGAAGTATATGAAGAAAAAATGAATAAATGGGAACAATTTCCATATGCCTTATTAGAAGCTAGAAGTTCAGGAGCAGCT 11.76 GGTGAGAGÀTTAAATTcTATTGAAGTATATGAAGAAAAAATGAATAAATGGGAACAATTTCCATATGCCTTATTAGAAGCTAGAAGTTCAGGÀGCAG CT 12.74 GGTGAGAGATTAAATTCTATTGAAGTATATGAAGAAAAAATGAATAAATGGGAACAATTTCCATATGCCTTATTAGAAGCTAGAAGTTCAGGAGCAGCT 13.67 GGTGAGAGATTAAATTCTATTGAAGTATATGAAGAAAÀAATGAATAAATGGGAACAATTTCCATATGCCTTATTAGAAGCTAGAAGTTCAGGAGCAGCT 14.65 GGTGAGAGATTAAATTCTATTGAAGTATATGAAGAAAAAATGAATAAATGGGAACAATTTCCATATGCCTTATTAGAAGCTAGAAGTTCAGGAGCAGCT 15.64 ggtgagàgattàaattctattgaagtatàtgàagaàaaàatgààtaaatgggaàcaatttccatàtgccttattàgaagctàgaàgttcàggagcagct 16.59 GGTGAGAGATTAAATTCTATTGAAGTATATGAAGAAAAAATGAATAAATGGGAACAATTTCCATATGCCTTATTAGAAGCTAGAAGTTCAGGAGCAGCT 17.26 GGTGAGAGATTAAATTCTATTGAAGTATATGAAGAAAAAATGAATAAATGGGAACAATTTCCATÀTGCCTTATTAGAAGCTAGAAGTTCAGGAGCAGCT 18.25 GGTGAGÀGATTAAATTCTATTGAAGTATATGÀAGÀAAAAATGAATAÀATGGGAACAÀTTTCCATATGCCTTATTAGAAGCTÀGAAGTTCAGGAGCAGCT 19.24 GGTGAGAGATTAAATTCTATTGAAGTATATGAAGAAAAAATGAATAAATGGGAACAATTTCCATATGCCTTATTAGAAGCTAGAAGTTCAGGAGCAGCT
24 2 GGTGAGAGATTAAATTcTATTGAAGTATATGAAGAAAAAATGAATAAATGGGAACAATTTC cATATG ccTTATTAGAAGCTAGAAGTTCAGGAG CAGCT 25.1 GGTGAGAGATTAAÀTTCTATTGÀÀGTÀTÀTGAAGAÀAAAATGÀÀTAAÀTGGGÀÀCAATTTCCÀTÀTGCCTTATTAGAÀGCTAGAÀGTTCAGGÀGCAGCT
2 K13propeller TTTAATTACCTTÀATCÀAATATATGTTGTTGGAGGTATTGATAATGÀACATÀACÀTÀTTAGATTCCGTTGAACÀATATCAACCATTTAATAÀAAGATGG 3.126 TTTAATTACCTTAATCAAATATATGTTGTTGGAGGTATTGATAATGAACATAACATATTAGATTCCGTTGAACAATATCAACCATTTAATAAAAGATGG 4.125 ( 639 TTTÀATTACCTTÀATCÀAATATATGTTGTTGGAGGTATTGÀTAATGÀACÀTAACATÀTTAGATTCCGTTGAÀCAÀTÀTCÀACCATTTAATAÀAAGATGG 5.124 TTTAATTACCTTAATCAAATATATGTTGTTGGAGGTATTGATAATGAACATAACATATTAGATTCCGTTGAACAATATCAACCATTTAATAAAAGATGG 6.119 TTTAÀTTACCTTAATCÀAATÀTATGTTGTTGGAGGTÀTTGATAATGÀACÀTAACÀTÀTTAGÀTTCCGTTGAÀCAATÀTCÀACCATTTAATAÀAAGÀTGG 7.106 TTTAATTACCTTAATCAAATATATGTTGTTGGAGGTATTGATAATGAACATAACATATTAGATTCCGTTGAACAATATCAACCATTTAATAAAAGATGG 8.99 TTTAATTACCTTAATCAAATATATGTTGTTGGAGGTATTGATAATGAACATAACATATTAGATTCCGTTGAACAATATCAACCATTTAATAAAAGATGG 9.78 tttàattaccttààtcàaàtatatgttgttggaggtattgàtaàtgaacàtaacatàttagattccgttgààcàatatcaaccatttaataaaàgatgg 10.77 TTTAATTACCTTAATCAAATÀTATGTTGTTGGAGGTÀTTGATAATGAACÀTAACÀTÀTTAGÀTTCCGTTGAÀCAATATCÀACCATTTAATAAAAGATGG 11.76 TTTAATTACCTTAÀTCAAÀTÀTATGTTGTTGGAGGTATTGÀTAÀTGAACATAACATATTAGATTCCGTTGÀACÀATATCAACCATTTAÀTAAAAGATGG 12.74 TTTAÀTTACCTTAATCÀAATATATGTTGTTGGAGGTATTGATAATGAACÀTÀACATÀTTAGATTCCGTTGAÀCAATÀTCÀACCATTTAATAÀAAGATGG 13.67 TTTAATTACCTTAATCAAATATATGTTGTTGGAGGTATTGATAATGAACATAACATATTAGATTCCGTTGAACAATATC^.CCATTT.AATAAAAGATGG 14.65 tttaattaccttaatcàaatatatgttgttggaggtàttgataatgàacatàacàtàttagàttccgttgaàcaàtatcàaccatttaataàaagatgg 15.64 TTTAATTACCTTAATCAAATATATGTTGTTGGAGGTATTGATAATGAACATAACATATTAGATTCCGTTGAACAATATCAACCATTTAATAAAAGATGG 16.59 TTTÀÀTTACCTTAÀTCÀAATATÀTGTTGTTGGAGGTÀTTGATAATGÀÀCATÀACÀTÀTTAGÀTTCCGTTGAÀCẢATÀTCAACCATTTÀATÀÀAAGATGG 17.26 TTTÀATTACCTTÀATCAAÀTÀTATGTTGTTGGAGGTATTGATAÀTGAACÀTAACATATTAGATTCCGTTGAACAATATCAACCATTTAATAAAÀGATGG 18.25 TTTAÀTTACCTTAATCÀAATÀTATGTTGTTGGAGGTÀTTGATAATGÀACÀTAACÀTÀTTAGÀTTCCGTTGAÀCAÀTATCÀACCATTTAATÀÀAAGATGG 19.24 TTTÀATTACCTTÀÀTCAAÀTÀTATGTTGTTGGAGGTATTGATAÀTGAACATAACATATTAGÀTTCCGTTGÀÀCAATATCAACCATTTAATÀAAÀGATGG 20.20 ( 639 tttààttaccttaatcàaatàtatgttgttggaggtàttgàtaatgàacatàacàtàttagattccgttgaàcaatàtcàaccatttàatààaagatgg 21.5 TTTÀATTACCTTAÀTCAAÀTÀTATGTTGTTGGAGGTATTGÀTAÀTGAACÀTAACATATTAGATTCCGTTGAACÀATATCAACCATTTAÀTAAAÀGATGG 22.4 TTTAATTACCTTÀATCÀAATATATGTTGTTGGAGGTÀTTGÀTAATGÀACÀTAACATÀTTAGATTCCGTTGAÀCAÀTATCÀACCATTTAATAÀAAGATGG 23.3 TTTÀATTACCTTAATCAAÀTATATGTTGTTGGAGGTATTGATAÀTGAACATAACATATTAGATTCCGTTGAACAATATCAÀCCATTTAATAAAÀGATGG 24.2 tttaattaccttàatcàaatatatgttgttggaggtattgataatgàacatàacàtàttagattccgttgààcaatàtcaaccatttaatààaagatgg 25.1 TTTAATTACCTTAÀTCAAÀTATATGTTGTTGGAGGTATTGATAÀTGAACATAACATATTAGATTCCGTTGAACAATATCAACCATTTAATAAAÀGATGG
4 125 ( 639 CAÀTTTCTAAATGGTGTACCAGÀGAAAAAÀÀTGAÀTTTTGGAGCTGCCACATTGTCAGATTCTTATATAÀTTÀCÀGGÀGGAGAAAATGGCGÀAGTTCTA 5.124 CAATTTCTAAATGGTGTACCAGAGAAAAAAATGAATTTTGGAGCTGCCACATTGTCAGATTCTTATATAATTACAGGAGGAGAAAATGGCGAAGTTCTA 6.119 CAATTTCTAAATGGTGTACCAGAGAAAAAAATGAATTTTGGAGCTGCCACATTGTCAGATTCTTATATAATTACAGGAGGAGAAAATGGCGAAGTTCTA 7.106 CAATTTCTAÀÀTGGTGTACCÀGAGAÀAAAAÀTGAÀTTTTGGAGCTGCCACATTGTCAGATTCTTATATAATTACAGGAGGAGAAÀÀTGGCGAAGTTCTA 8.99 CAATTTCTAAATGGTGTACCAGÀGAAAAAAATGAATTTTGGAGCTGCCACÀTTGTCAGATTCTTATATAATTACAGGAGGAGAAAATGGCGAAGTTCTA
9 78 CAATTTCTAAATGGTGTACCAGAGAAAAAAATGAATTTTGGAGCTGCCACATTGTCAGATTCTTATATAATTACAGGAGGAGAAAATGGCGAAGTTCTA 10.77 CAATTTCTAAATGGTGTACCAGAGAAAAAAATGAATTTTGGAGCTGCCACATTGTCAGATTCTTATATAATTACAGGAGGAGAAAATGGCGAAGTTCTA 11.76 CAATTTcTAAATGG TG TACCAGAGAAAAAAATGAATTTTGGAGCTGcCACATTGTCAGATT cTTATATAATTACAGGAGGAGAAAATGG CGAAGTTcTA 12.74 CAÀTTTCTAAATGGTGTACCAGAGAAAAAAATGAÀTTTTGGAGCTGCCACATTGTCAGATTCTTATATAÀTTÀCAGGÀGGAGÀAAATGGCGAAGTTCTA 13.67 c A AT T T c T A AÀ T GG TG T AC c AG AG AA A AA AÀ T G A AT T T T GG AG c TG c CA c A T TG T c AG A T T c T T AT A TA AT T AC AG G AG G AG AA AÀ T GG CG A AG T T c TA 14.65 CAATTTCTAAATGGTGTACCAGAGAAAAAAATGAATTTTGGAGCTGCCACATTGTCAGATTCTTATATAATTACAGGAGGAGAAAATGGCGAAGTTCTA 15.64 CAATTTCTAAATGGTGTACCAGAGAAAAAAATGAATTTTGGAGCTGCCACATTGTCAGATTCTTATATAATTACAGGAGGAGAAAATGGCGAAGTTCTA
16 59 CAATTTcTAAATGG TG TÀCCAGAGAAAAAAATGAATTTTGGAGCTG cCACATTG TCAGATT cTTATATAATTACAGGAGGÀGAÀAATGGCGAAG TTcTA 17.26 CAATTTCTAAÀTGGTGTACCÀGAGAÀAAAAÀTGAÀTTTTGGAGCTGCCACÀTTGTCAGATTCTTATATAÀTTACAGGAGGAGAAAÀTGGCGÀAGTTCTA 18.25 CAATTTCTAAATGGTGTACCAGAGAAAAAAATGAÀTTTTGGAGCTGCCACATTGTCAGATTCTTATATAÀTTACAGGAGGAGAAAATGGCGAAGTTCTA 19.24 CAATTTCTAAÀTGGTGTACCÀGAGAAAAAÀÀTGAÀTTTTGGAGCTGCCÀCÀTTGTCAGATTCTTATATAATTACAGGAGGÀGAAAÀTGGCGÀAGTTCTA
Hình 4.5 Phân tích các trình tự nucleotide gen K 13 kiểu hình C580Y các mẫu phân lập
P falciparum đột biến ở vị trí 1740 và mẫu hoang dại (wild type)
Hình 4.6 Phân tích các trình tự acid amin đột biến gen K13 kiểu hình C580Y ở vị trí 580 các phân lập P falciparum có đột biến và kiểu hình hoang dạu mẫu hoang dại
Số liệu phân tích các đột biến liên quan kháng artemisinine trên 37 phân lập P falciparum thấy các đột biến xác định kháng có ý nghĩa chỉ là kiểu hình C580Y chiếm
62 là 36/37 ca (97,3%), ngoài ra còn có các kiểu hình hoang dại (wild type) chiếm 12/37 mẫu phân lập P falciparum nghiên cứu phân tích (32,4%) không có ý nghĩa về kháng thuốc
Số liệu phân tích trên tất cả 37 phân lập P falciparum về loại chỉ điểm tăng số bản sao Pfmdr1 (>1,5 copy) liên quan đến xác định kháng thuốc đi kèm loại mefloquine (MQ) cho thấy chỉ có duy nhất 1 phân lập P falciparum có tăng số bản sao Pfmdr1 Nghiên cứu này không phân tích các đột biến hay chỉ điểm phân tử liên quan đến kháng các loại thuốc khác trên quần thể này
So sánh số liệu của Huỳnh Hồng Quang (2017-2018), với 55 ca nhiễm đơn thuần
P falciparum ngày D0 về đột biến gen đơn nucleotide đa hình (SNP) vùng cánh quạt của K13 cho tỷ lệ 28/55 ca (50,9%) có đột biến K13 , trong đó loại đột biến C580Y chiếm ưu thế 21/28 ca (75%) Trong khi đó các đột biến khác chưa xác định vai trò là P574L có 2 ca (3,6%) và P553L là 8 ca (14,5%) Đồng thời so sánh các kết quả phân lập thu thập qua các thực nghiệm TES của thuốc DHA-PPQ tại các điểm SRLH của các tỉnh Gia Lai, Đăk Nông, Quảng Nam, Bình Phước và các thực nghiệm tại nhiều nơi khác nhau đánh giá mặt dịch tễ học di truyền gen kháng thuốc 8 tỉnh Gia Lai, Đăk Nông, Đăk Lăk, Ninh Thuận, Khánh Hòa, Quảng Nam, Quảng Bình, Quảng Trị hợp tác thực nghiệm giữa Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn với Đơn vị Nghiên cứu Lâm sàng Đại học Oxford (OUCRU-Anh), nhóm thực nghiệm cũng đã thu thập các đột biến thể hiện kháng artemisinins
Kết quả về thông tin mẫu máu trên trường hợp nhiễm duy nhất một loại
Plasmodium falciparum ngày đầu tiên có xuất hiện đột biến trên gen K13 tại khùng cánh quạt là 17 ca trên tổng số 37 ca chữa trị tương đương 45,9% Ngoại trừ đột biến hoang dại (wild type) thì đột biến C580Y, P574L, P553L, A539T là các đột biến xuất hiện với xác xuất cao Dữ liệu quốc gia về P falciparum tại Việt Nam (Nguyễn Thanh Thùy Nhiên và cs., 2017) là hoàn toàn chính xác về tỷ lệ lưu hành bệnh sốt rét do nhiễm P falciparum khi sử dụng artemisinin, đe dọa nỗ lực ngăn ngừa, bài trừ bệnh sốt rét Hiện nay, việc chữa sốt rét do nhiễm P falciparum chưa biến chứng tại nước ta vẫn đang phụ thuộc vào DHA-PPQ Khi phân tích cánh haplotyps của K13 tại Việt Nam thì có rất nhiều loại kiểu hình đột biến từ một tới nhiều đột biến tuy nhiên sự có mặt của C580Y vẫn chiếm phần lớn như: T493H, I543T, P553L, A539T, V568G, P574L…
Vùng gen K13 là một chỉ điểm phân tử liên đới đến kháng artemisinin được
TCYTTG công nhận đã được giải trình tự trên 1.060 phân lập P falciparum của 3 điểm nóng sốt rét tại Việt Nam Số liệu cho thấy đột biến gen K13gồm T474I, T493H, A539T, I543T, P553L, V568G, P574L và loại C580Y có và chưa liên quan đến kháng artemisinin được tìm thấy Tần suất đột biến K13 từ 29% (222/767), 6% (11/188) và
43% (45/105) lần lượt ở các tỉnh Bình Phước, Ninh Thuận và Gia Lai Đột biến C580Y trở thành kiểu gen nổi trội trong những năm gần đây với tỷ lệ 79,1% (34/43) phân lập ở Bình Phước và 63% (17/27) phân lập ở Gia Lai Đồng thời, nghiên cứu đột biến gen K13 cũng có liên quan đến tính nhạy của thể nhẫn với dihydroartemisinin (DHA) trên thử nghiệm in vitro và thời gian làm sạch
KSTSR kéo dài trên in vivo Tiếp đó, phân tích cánh haplotyp K13 cho thấy có sự hiện diện của đa chủng có dạng đột biến C580Y hơn là đơn chủng khắp 3 vùng khảo sát này (Mồrtensson A và cộng sự, 2005; Monia Guidi và cộng sự., 2019)
Bảng 4.13 Tỷ lệ bệnh nhân có tăng số bản sao Pfmdr1 trên quần thể P falciparum
TT Chỉ số phân tích
Chỉ điểm tăng bản sao
SL (%) Đối chiếu bảng WHO (2018)
1 Số ca có chỉ điểm
Pfmdr1 được phát hiện 1/37 (2,7%) Pfmdr1 là chỉ điểm khi tăng trên 1,5 số copy như xác định kháng mefloquin
2 Số ca không có chỉ điểm
Số liệu phân tích trên tất cả 37 phân lập P falciparum về loại chỉ điểm tăng số bản sao Pfmdr1 (>1,5 copy) liên quan đến xác định kháng thuốc đi kèm loại mefloquine cho thấy chỉ có duy nhất 1 phân lập P falciparum có tăng số bản sao Pfmdr1 Thực nghiệm này không phân tích các đột biến hay đột biến gen liên quan đến kháng các loại thuốc khác trên quần thể này
Tại xã Phước Thắng, thuộc huyện Bác Ái, tỉnh Ninh Thuận, từ năm 2013-2016 các đột biến C580Y, I543T, T439H xuất hiện 11/188 ca chiếm 6% tổng số ca có đột biến Tại đây, các đột biến C580Y đã thay thế dần cho T439H sau khi tiến hành khảo sát ba lần, nhưng tần suất xuất hiện đột biến không thay đổi Trong khi đó tại Gia Lai,
64 con số này đã thay đổi 0/21 ca xuất hiện đột biến trong năm 2011-2012, 14/57 ca xuất hiện C580Y, 9/57 ca xuất hiện P553L, các đột biến A539T, V568G, P574L có xuất hiện nhưng ở mức thấp số liệu này được thu thập trong năm 2014 -2015