THIẾT KẾ QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS VỚI NĂNG SUẤT 600 TẤN NĂM

THIẾT KẾ QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE TỪ CHỦNG VIKHUẨN BACILLUS SUBTILIS VỚI NĂNG SUẤT 600 TẤN NĂM.Trước đây, ngƣời ta thu nhận αamylase từ malt là chủ yếu. Có nhiều nghiên cứu cácnguồn amylase có chất lƣợng cao và có thể sản xuất theo quy mô công nghiệp đồngthời khắc phục những hạn chế của các phƣơng pháp sản xuất tạo enzyme amylasenăng suất cao. Việc sản xuất các αamylase thƣờng đƣợc thực hiện bằng cách sử dụngquá trình lên men chìm với chủng Bacillus subtilis là nâng suất cao hơn so với cácnguồn từ động vật, thực vật (2) . Với nền công nghiệp phát triển mạnh kéo theo nhucầu về αamylase tăng cao nên việc áp dụng những kỹ thuật tiến bộ trong nuôi cấy visinh vật để thu dễ dàng hơn với lƣợng lớn αamylase là rất cần thiết.Từ những thực tế đã tìm hiểu ở trên nhóm em tiến hành nghiên cứu “Thiết kế quytrình sản xuất enzyme amylase từ chủng vi khuẩn Bacillus subtilis với năng suất600 tấnnăm”

TỔNG QUAN

Tổng quan về trực khuẩn Bacillus Subtilis

Bacillus subtilis, hay còn gọi là "trực khuẩn suptilit", là một loài vi khuẩn hình que, gram dương và ưa khí không bắt buộc Loài vi khuẩn này có vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực, từ nông nghiệp đến y học, nhờ vào khả năng sinh sản và thích nghi tốt với môi trường.

Bacillus subtilis (B subtilis), hay còn gọi là trực khuẩn cỏ hoặc trực khuẩn rơm, thường được tìm thấy trong cỏ, rơm và đất Loại vi khuẩn này phát triển mạnh mẽ trong ống tiêu hóa của con người và nhiều loài gia súc, đặc biệt là động vật nhai lại, mang lại lợi ích cho sức khỏe con người, do đó được biết đến như là lợi khuẩn suptilit.

Bacillus subtilis đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion

Erenberg đã đặt tên cho loài vi khuẩn là "Vibrio subtilis" Gần 30 năm sau, Casimir Davaine đổi tên thành "Bacteridium" Đến năm 1872, Ferdimand Cohn xác định loài trực khuẩn này có đầu vuông và chính thức đặt tên là Bacillus subtilis.

Vào năm 1941, Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y học Nazi của Đức và ban đầu được sử dụng để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức tại Bắc Phi Từ năm 1949 đến 1957, Henry và cộng sự đã tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis Gần đây, loại vi khuẩn này đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên toàn thế giới, dẫn đến sự ra đời của thuật ngữ “Subtilis therapy” Bacillus subtilis ngày càng trở nên phổ biến và được công nhận là sinh vật có khả năng phòng và điều trị các bệnh liên quan đến rối loạn đường tiêu hóa, viêm ruột, viêm đại tràng và tiêu chảy.

Bacillus subtilis hiện nay đang được nghiên cứu rộng rãi nhờ vào tiềm năng và ứng dụng hiệu quả của nó trong lĩnh vực chăn nuôi, công nghiệp và xử lý môi trường.

Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus subtilis thuộc:

Hình 1 Trực khuẩn Bacillus subtilis

Vi khuẩn Bacillus subtilis là một loại vi sinh vật hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, phổ biến trong môi trường tự nhiên, chủ yếu cư trú trong đất, rơm rạ và cỏ khô Loại vi khuẩn này thường được gọi là “trực khuẩn cỏ khô” và thường thấy trong đất trồng trọt.

Bacillus subtilis có mặt với mật độ từ 106 – 107 triệu CFU/g trong các môi trường dinh dưỡng phong phú, nhưng hiếm gặp ở đất nghèo dinh dưỡng như vùng sa mạc và đất hoang Loại vi khuẩn này chiếm 75 – 79% vi khuẩn tạo bào tử trong bột mì và cũng xuất hiện trong các nguyên liệu như bột gạo, cũng như trong thực phẩm lên men như mắm, tương, chao Bacillus subtilis đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi sinh học, mang lại cả lợi ích và tác hại.

Bacillus subtilis có khả năng sử dụng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon, trong khi một số loài khác như Bacillus sphaericus và Bacillus cereus cần các hợp chất hữu cơ như vitamin và amino acid để phát triển Đặc biệt, các loài như Bacillus popilliae cũng có những yêu cầu riêng về nguồn dinh dưỡng.

Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dƣỡng phức tạp, chúng không phát triển trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB)

Vào năm 1993, giáo sư Richard Losik cùng các cộng sự từ Đại học Harvard và Jose Gonzalez-Pastor tại Trung tâm công nghệ sinh học quốc gia ở Madrid đã phát hiện ra rằng loài Bacillus subtilis có khả năng ăn thịt đồng loại Hành vi này được sử dụng như một chiến lược đơn giản giúp chúng thoát khỏi những tình huống sống khan hiếm, đặc biệt là khi nguồn dinh dưỡng trong môi trường bị cạn kiệt.

Các cá thể khỏe mạnh sinh tổng hợp kháng sinh để tiêu diệt những cá thể xung quanh, cả khác loài lẫn cùng loài, nhằm thu nhận chất dinh dưỡng và tồn tại cho đến khi môi trường thuận lợi hơn Để thích ứng với môi trường khắc nghiệt, chúng thường tạo ra bào tử, tuy nhiên, quá trình này tiêu tốn nhiều năng lượng.

Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, Gram (+), kích thước 0,5 –

Vi khuẩn Bacillus subtilis có kích thước từ 0,8 đến 1,8 micromet, thường xuất hiện đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn, với khả năng di động nhờ vào 8 đến 12 lông Bào tử của vi khuẩn này hình bầu dục, nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, và phát triển qua quá trình nảy mầm Chúng không kháng acid nhưng có khả năng chịu nhiệt lên đến 100 độ C trong 180 phút, cũng như chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất và chất sát trùng Bào tử có thể tồn tại từ vài năm đến hàng chục năm, với bằng chứng cho thấy chúng có thể duy trì sức sống lên tới 200 – 300 năm.

Lên men không sinh hơi các loại đường như: glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose và arabinose

Thử nghiệm indol (-), VP (+), nitrate (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein, (+), citrate (+), có khả năng di động (+) và hiếu khí (+)

Vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng phát triển trong điều kiện hiếu khí cũng như môi trường thiếu oxy Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng là 37 độ C, trong khi pH thích hợp dao động từ 7.0 đến 7.4.

Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển hầu hết trên các môi trường dinh dưỡng cơ bản:

Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA), khuẩn lạc xuất hiện dưới dạng tròn với rìa răng cưa không đều, có màu vàng xám và đường kính từ 3 đến 5 mm Sau khoảng 1 đến 4 ngày, bề mặt khuẩn lạc trở nên nhăn nheo và có màu hơi nâu.

Trong môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB), vi khuẩn phát triển làm đục môi trường, hình thành màng nhăn và lắng cặn, tạo thành các kết tụ giống như vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc đều.

Trên môi trường giá đậu – peptone, khuẩn lạc có hình dạng tròn, lồi, nhẵn bóng, đôi khi lan rộng với rìa răng cưa không đều, đường kính từ 3 đến 4 cm sau 72 giờ nuôi cấy Để phát triển, vi khuẩn này chủ yếu cần các nguyên tố dinh dưỡng như C, H, O, N cùng một số nguyên tố vi lượng khác.

Vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường cung cấp đủ nguồn carbon (như glucose) và nitơ (nhƣ peptone) (5)

1.3.4 Bộ gen của Bacillus subtilis

Enzyme amylase

2.1 Giới thiệu về enzyme amylase

Amylase (hay -1,4 glucanhydrolase) là một enzyme thuộc nhóm thủy phân, có khả năng phân giải các liên kết glucoside trong polysaccharide bằng cách sử dụng nước Enzyme này xúc tác quá trình thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin Amylase có mặt trong nước bọt, được gọi là ptyalin, và xuất hiện trong dịch tiêu hóa của con người cũng như động vật, cũng như trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn.

Thực phẩm như gạo và khoai tây, chứa nhiều tinh bột nhưng ít đường, có thể có vị ngọt nhẹ khi nhai do amylase biến đổi một phần tinh bột thành đường Tuyến tụy và tuyến nước bọt sản xuất amylase (alpha amylase) để thủy phân tinh bột thành disacarit và trisacarit, sau đó được chuyển hóa thành glucose nhờ các enzyme khác, cung cấp năng lượng cho cơ thể.

Enzyme Amylase là một enzyme phổ biến trong giới vi sinh vật, thuộc nhóm hydrolase glycoside, chuyên thủy phân các liên kết α-1,4-glycosid Các loại amylase như α-amylase, β-amylase và γ-amylase (glucoamylase) có khả năng phân hủy các liên kết này trong tinh bột, glucogen và các polysaccharide tương tự.

15 cắt gián tiếp (amylo 1,6-glucosidase), trước hết cần phải loại bỏ một oligosaccharide bởi transglucosidase, để lại một glucose liên kết với một tetrasaccharide tạo thành liên kết 1,6-glycoside (9)

Các enzyme này thuộc nhóm thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước

Hiện có sáu loại amylase đƣợc xếp vào 2 nhóm: endoamylase (enzyme nội bào) và exoamylase (enzyme ngoại bào):

Endooamylase: gồm có α – amylase (EC.3.2.1.1.) và nhóm enzyme khử nhánh

Nhóm enzyme khử nhánh được phân thành hai loại: khử trực tiếp với enzyme pulluglanase (α-dextrin 6-glucanohydrolase, EC.3.2.1.41) và khử gián tiếp bao gồm transglucosylase (oligo-1,6-glucosidase, EC.3.2.20) cùng với amylo-1,6-glucosidase (EC.3.2.1.10) Các enzyme này có chức năng thủy phân các liên kết bên trong chuỗi polysaccharide.

Exonuclease: gồm có β-amylase (EC.3.2.1.2) và γ-amylase(EC.3.2.1.3) Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide (9)

Hình 3: Các loại enzyme Endooamylase và Exonuclease

2.3 Đặc tính và cơ chế hoạt động của enzyme amylase

Alpha amylase là enzyme nội bào có khả năng phân cắt ngẫu nhiên các liên kết α-1,4 glucoside trong cơ chất Enzyme này không chỉ phân hủy hồ tinh bột mà còn có khả năng xử lý cả hồ tinh bột nguyên vẹn.

Cơ chế tác dụng của alpha amylase trong việc thủy phân tinh bột diễn ra qua nhiều giai đoạn Đầu tiên, enzyme này phân giải các liên kết trong tinh bột, tạo ra một lượng lớn dextrin với phân tử thấp Tiếp theo, các dextrin này tiếp tục bị thủy phân thành maltose và glucose Alpha amylase có nguồn gốc từ nhiều nguồn khác nhau, với thành phần amino axit đa dạng, mỗi loại có tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng Enzyme này giàu tyrosine, tryptophan, axit glutamic và aspartic, trong đó glutamic và aspartic acid chiếm khoảng 1/4 tổng lượng amino acid của enzyme Alpha amylase chứa ít methionine và khoảng 7-10 gốc cysteine.

 Trọng lƣợng phân tử của α-amylase malt là 54.000kDa

 Amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch, muối và rượu loãng

 Protein của các amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline

 Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH 4.2 - 5.7

α-amylase từ các nguồn khác nhau có điều kiện hoạt động khác nhau, với biên độ pH tối ưu không giống nhau Đối với α-amylase từ malt, pH tối ưu là 5,3, trong khi α-amylase từ vi sinh vật lại có thể có mức pH tối ưu khác α-amylase từ đại mạch nảy mầm và thóc nảy mầm hoạt động hiệu quả trong khoảng pH 4,7-5,4.

 Độ bền với acid của α-amylase malt kém hơn so với độ bền của α-amylase nấm mốc

Độ bền của α-amylase chịu ảnh hưởng bởi nhiệt độ và pH, nhưng nó có độ bền nhiệt cao hơn so với nhiều enzyme khác Ở nhiệt độ 0°C và pH 3,6, α-amylase từ malt hoàn toàn mất hoạt tính, trong khi α-amylase từ mầm thóc và malt hoạt động hiệu quả nhất ở nhiệt độ 58-60°C Do đó, trong quy trình sản xuất rượu, malt thường được sử dụng để đường hóa cơ chất ở nhiệt độ 60-65°C Ngoài ra, β-amylase, một enzyme phổ biến trong thực vật và đặc biệt ở hạt nảy mầm, xúc tác quá trình thủy phân các liên kết α-glucan trong tinh bột.

17 bột, glucogen và pholysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch Maltose đƣợc tạo thành do sự xúc tác của β-amylase có cấu hình β

Cơ chế tác dụng của β-amylase là enzyme ngoại bào, bắt đầu quá trình phân giải từ các nhánh ngoài cùng không khử của cơ chất Enzyme này cắt đứt các liên kết α-1,4-glucoside, nhưng sẽ dừng lại khi gặp liên kết α-1,4-glucoside gần kề liên kết α-1,6-glucoside Kết quả là phần polysaccharide còn lại, gọi là β-dextrin, có cấu trúc lớn với nhiều liên kết α-1,4-glucoside.

 β-amylase là một albumin, tâm xúc tác có chứa nhóm –SH, nhóm – COOH và vòng imidazole của các gốc histidine và là enzyme ngoại bào (exoenzyme)

 β-amylase không bền khi có Ca 2+ , β-amylase bị kìm hãm bởi Cu 2 +, Hg + , urea, iodoacetamide,iodin,ozon…

 β-amylase chịu nhiệt kém hơn α-amylase nhƣng bền với acid hơn β-amylase bị bất hoạt ở nhiệt độ 70 0 C Nhiệt độ hoạt động tối thích của β-amylase là 55 0 C, pH 5,1-5,5

α-amylase và β-amylase được tìm thấy trong mầm lúa mạch, nhưng hiện nay, ngành công nghiệp chủ yếu sản xuất amylase từ tụy tạng động vật và thông qua nuôi cấy vi sinh vật.

 γ – amylase (glucoamylase hay α-1,4-glucan-glucohydrolase) (E.C.3.2.1.3)

Glucoamylase là enzyme có khả năng thủy phân liên kết α-1,4 và α-1,6, tách từng phân tử glucose từ đầu không khử của mạch để tạo ra glucose Enzyme này còn được biết đến với nhiều tên gọi khác như α-1,4:1,6-glucan-4:6-glucohydrolase, amyloglucosidase, taka-amylase B, γ-amylase và maltulase Glucoamylase hoạt động tốt nhất trong khoảng pH 3,5-5,5 và ở nhiệt độ 50°C So với α-amylase, enzyme này bền hơn trong môi trường acid nhưng kém bền hơn trong rượu và acetone, đồng thời không được bảo vệ bởi ion Ca²⁺.

 Oligo-1,6-glucosidase hay dextrinase tới hạn (dextrin-6-glucanhydrolase) (E.C.3.2.1.10)

Enzyme này có khả năng thủy phân liên kết α-1,6-glucosidase trong isomaltose, panose và các dextrin tới hạn thành đường có thể lên men Chúng xuất hiện ở vi sinh vật và trong hạt nảy mầm như đại mạch và thóc nảy mầm Oligo-1,6-glucosidase hoạt động hiệu quả hơn α-amylase và β-amylase, dẫn đến việc tạo ra nhiều maltose hơn trong dịch thủy phân Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của các dextrinase là 40°C với pH tối ưu là 5,1.

2.4 Nguồn thu nhận enzyme amylase

Enzyme là những chất không thể tổng hợp bằng phương pháp hóa học, thường được thu nhận từ tế bào động vật, thực vật hoặc vi sinh vật Trong hàng trăm năm qua, enzyme đã được ứng dụng trong công nghiệp, với hơn một nửa được sản xuất từ nấm mốc và nấm men, hơn 1/3 từ vi khuẩn, trong khi chỉ có 8% từ nguồn động vật và 4% từ nguồn thực vật.

Enzym amylase có nguồn gốc từ động vật được tìm thấy trong các cơ quan như tuyến nước bọt, tụy tạng và huyết thanh, đặc biệt là trong trường hợp viêm tụy cấp Ngoài ra, α-amylase và β-amylase cũng có mặt trong thực vật, chủ yếu từ malt đại mạch và malt thóc đã nảy mầm Tuy nhiên, cả enzyme amylase từ động vật lẫn thực vật đều có độ bền nhiệt kém Do đó, hiện nay, việc thu nhận enzyme amylase chủ yếu được thực hiện từ các canh trường vi khuẩn, nấm sợi và nấm men.

2.5 Phương pháp tinh sạch Enzyme Amylase

Trong y học và trong phân tích, người ta rất cần đến enzym có độ tinh sạch cao Có

3 phương pháp tinh sạch enzym đang được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu và trong sản xuất:

Phương pháp kết tinh (crystallization) là một kỹ thuật quan trọng trong nghiên cứu và sản xuất, thường được sử dụng để tinh chế enzym bằng dung dịch ammonium sulfate Tuy nhiên, để đạt được độ tinh sạch cao trong quá trình kết tinh enzym, yêu cầu về chất lượng dung dịch ammonium sulfate rất khắt khe, điều này làm cho phương pháp này trở nên khó khăn và ít được áp dụng rộng rãi.

 Phương pháp điện di rên gel polyacrylamide (polyacrylamide Gel Electrophoresis PAGE) Phương pháp điện di chỉ được ứng dụng nhiều trong

QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ

Sơ đồ quy trình công nghệ

Xử lý nguyên liệu + thanh trùng

Lên men sinh tổng hợp enzyme

Sơ đồ quy trình sản xuất enzyme Amylase từ Bacillus subtilis

Thuyết minh quy trình

Để nuôi cấy Bacillus subtilis hiệu quả và tối ưu hóa sự tổng hợp enzyme amylase, cần chuẩn bị môi trường nuôi cấy phù hợp Nguyên liệu đầu vào nên là phụ phẩm từ các ngành công nghiệp khác, và việc thu mua nguyên liệu cần được thực hiện ổn định từ các cơ sở uy tín Quan trọng là phải kiểm soát chất lượng nguyên liệu trước khi tiến hành phối trộn để đảm bảo năng suất sản xuất cao.

Khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn, các tế bào sẽ hướng về không khí có đủ oxy, giúp vi sinh vật phát triển trên bề mặt và dần lan xuống dưới qua các kẽ hở trong môi trường Vi sinh vật sử dụng oxy để hô hấp, thải CO2 ra môi trường xung quanh và tỏa nhiệt.

Phương pháp lên men gián đoạn sử dụng vi sinh vật được nuôi cố định trong một thể tích môi trường xác định Vi sinh vật phát triển qua các giai đoạn như pha tiềm phát, pha lũy thừa, pha cân bằng và pha suy vong, từ đó tạo ra sản phẩm cuối cùng Phương pháp này được áp dụng rộng rãi trong sản xuất các hoạt chất quan trọng như amino acid và các chất kháng sinh.

2.3 Nguyên liệu Ở môi trường lỏng vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng (môi trường) và pha khí (không khí) Ở đây VSV sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, O 2 từ không khí tiến hành quá trình tổng hợp enzyme Enzyme ngoại bào đƣợc tách ra từ sinh khối và hòa tan vào dung dịch môi trường Enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối vi sinh vật Nhiệt độ tối ưu

Để đảm bảo năng suất sản xuất, việc ổn định trong thu mua nguyên liệu đầu vào, là phụ phẩm từ các ngành công nghiệp khác, là rất quan trọng Cần lựa chọn cơ sở cung cấp nguyên liệu uy tín và kiểm soát chất lượng của các nguyên liệu này trước khi tiến hành phối trộn.

2.4 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Mục đích: chuẩn bị môi trường nuôi cấy cho chủng Bacillus subtilis sinh trưởng và phát triển, cho hiệu suất tạo chế phẩm enzyme amylase là cao nhất

Nhân giống với mục đích:

Kích hoạt giống gốc và cho giống vi sinh vật làm quen với môi trường lên men sẽ sản xuất trên quy mô công nghiệp

Tạo đủ lƣợng giống để sản xuất trên quy mô công nghiệp

Bảng 1 Môi trường nhân giống Bacillus subtilis tối ưu cho việc sản xuất amylase (11)

Môi trường lên men được chuẩn bị bằng cách phối trộn, khử trùng và làm nguội trong thiết bị lên men Việc khử trùng môi trường trước khi tiến hành lên men là cần thiết để ngăn ngừa sự nhiễm khuẩn từ các vi sinh vật lạ, từ đó nâng cao năng suất sản phẩm.

Giống sử dụng: chủng Bacillus subtilis tự nhiên mua từ giống công nghiệp

Mục đích của việc nuôi cấy là để sinh tổng hợp nhiều amylase trong quá trình lên men Việc xác định lượng cấy giống phù hợp với môi trường là rất quan trọng để đảm bảo quá trình lên men diễn ra hiệu quả và tạo ra sản phẩm mong muốn.

Số lượng giống ban đầu cho quá trình lên men rất quan trọng; nếu quá ít, thời gian lên men sẽ kéo dài và ảnh hưởng đến hiệu suất sản phẩm Ngược lại, nếu cấy quá nhiều giống, chi phí nhân giống sẽ tăng lên đáng kể.

2.5 Quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme

Môi trường nuôi cấy và giống được chuyển vào thiết bị lên men chính, nơi có hệ thống cánh khuấy, cung cấp oxy, và điều chỉnh pH, nhiệt độ Trong quá trình lên men, vi sinh vật sử dụng chất dinh dưỡng để tăng sinh và sản sinh ra sản phẩm trao đổi chất, làm thay đổi các yếu tố ban đầu như pH và nhiệt độ Việc bố trí thiết bị để duy trì các yếu tố này ở mức tối ưu là rất quan trọng cho sự phát triển của vi sinh vật Kiểm soát nồng độ oxy qua cánh khuấy và thiết bị cấp khí oxy giúp xáo trộn môi trường, tăng diện tích tiếp xúc giữa cơ chất và vi sinh vật, từ đó tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển mạnh mẽ và tổng hợp nhiều enzyme cần thiết.

2.5.1 Phương pháp lên men Để thu được nguồn enzyme dồi dào từ vi sinh vật, người ta phải nuôi cấy chúng trên các môi trường đặc hiệu Phương pháp lên men chìm dễ xử lý, kiểm soát tốt hơn các yêu tố môi trường như nhiệt độ, đảm bảo được điều kiện vệ sinh vô trùng, hiện tưởng nhiễm vi sinh vật lạ ít xảy ra hơn Để đáp ứng nhu cầu của ngành công nghiệp, chi phí sản xuất thấp đƣợc ƣu tiên hàng đầu để sản xuất enzyme amylase Phương pháp lên men chìm dễ cơ giới hóa, loại bỏ được lao động thủ công, tạo năng suất cao, ít tốn diện tích, nâng cao hiệu quả chi phí cho quá trình sản xuất, do đó đạt hiệu quả kinh tế hơn so với phương pháp nuôi cấy bề mặt Trong các thiết bị lên men có lắp đặt hệ thống cánh khuấy, hệ thống cung cấp oxy, hệ thống điều chỉnh pH, hệ thống điều chỉnh nhiệt độ Trong đó hệ thống điều hòa không khí và khuấy trộn có ý nghĩa rất to lớn do chúng xáo trộn môi trường làm tế bào vi sinh vật phân bố đều, tăng diện tích tiếp xúc với môi trường và đồng thời việc cung cấp không khí thường xuyên giúp chủng này sinh trưởng và phát triển tốt, làm tăng khả năng tạo enzyme của vi sinh vật Ngoài ra, môi trường tổng hợp đã được sử dụng để lên men sản xuất amylase thông qua SMF Thành phần của môi trường tổng hợp bao gồm canh trường dinh

Trong sản xuất quy mô lớn, việc sử dụng 25 dưỡng chất cơ bản và tinh bột hòa tan thường rất tốn kém, dẫn đến việc thay thế bằng các phụ phẩm nông nghiệp giá rẻ để giảm chi phí Trong quy trình SMF, phương thức nuôi cấy gián đoạn được lựa chọn để sản xuất và thu enzyme theo mẻ, nhờ vào khả năng sinh trưởng tốt của Bacillus subtilis trong môi trường dinh dưỡng cơ bản mà không bị ức chế bởi nồng độ cao Tuy nhiên, việc bổ sung cơ chất ngoài trong nuôi cấy gián đoạn dễ dẫn đến nhiễm khuẩn, tốn năng lượng và chi phí cho nhân công vận hành, quản lý.

Quá trình lên men được thực hiện để tối ưu hóa sự phát triển của vi sinh vật và tổng hợp enzyme amylase, trong đó Bacillus subtilis được nuôi cấy ở nhiệt độ 60°C và pH 5.5 Amylase được sản xuất trong môi trường cơ bản với pH ban đầu 7,0, trong bình Erlenmeyer 250 mL chứa 50 mL môi trường, và mẫu cấy được lắc ở tốc độ 150 vòng/phút tại 37°C trong ít nhất 72 giờ Sau quá trình ủ, nước dùng lên men được ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 10 phút tại 4°C để thu thập phần nổi tự do của tế bào, phục vụ cho việc đánh giá hoạt tính amylase Để tối ưu hóa các thành phần môi trường, các nguồn cacbon, nitơ hữu cơ và vô cơ, cũng như các chất hoạt động bề mặt và rượu polyhydroxy được bổ sung và điều chỉnh nồng độ trong môi trường cơ bản trong khi giữ các thành phần khác không đổi.

Kiểm soát quá trình lên men:

Trong quá trình lên men, vi sinh vật sản sinh ra nhiệt, kết hợp với nhiệt từ cánh khuấy, làm thay đổi nhiệt độ và ảnh hưởng đến hiệu suất lên men Để duy trì hiệu suất tối ưu, cần có hệ thống làm mát tự động để giữ nhiệt độ ổn định Nhiệt độ trong bể lên men được theo dõi bằng đầu dò nhiệt độ, cung cấp thông tin cho hệ thống điều khiển tự động nhằm phân tích và vận hành hệ thống làm mát hiệu quả.

pH ảnh hưởng đáng kể đến tốc độ tăng trưởng của vi sinh vật Việc điều chỉnh pH phù hợp là cần thiết để tối ưu hóa sự phát triển của vi sinh vật, từ đó tạo ra nhiều enzyme hơn.

Mục đích của quy trình này là tách riêng enzyme amylase và tủa protein, đồng thời loại bỏ cặn tủa để thu nhận dịch chứa enzyme amylase Do amylase dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao, nên phương pháp ly tâm lạnh được thực hiện ở nhiệt độ thấp (4°C) với tốc độ 10,000 vòng/phút để bảo toàn hoạt tính của enzyme.

Hình 4 Cấu tạo máy ly tâm dạng đĩa

Cấu tạo và nguyên lý hoạt động

CÂN BẰNG VẬT CHẤT VÀ NĂNG LƯỢNG

Tính toán cân bằng vật chất từng giai đoạn

Bảng 2 Hiệu suất quá trình trong từng công đoạn Quá trình Hiệu suất quá trình Tài liệu tham khảo

Tỷ lệ tổn thất là 0.2%

Ta có lượng sản phẩn trước khi bao gói:

Lƣợng sản phẩm sau khi sấy là m SS = P TB = 601.2 (tấn/năm)

 Độ ẩm đầu vào và độ ẩm đầu ra quá trình sấy: 75% và 5% (15,16)

Công thức tính lượng ẩm được trích từ “Sổ tay quá trình và thiết bị công nghệ hóa chất tập 2” của Nguyễn Bin và cộng sự (2006) là: m TS = m SS + W Trong đó, m TS đại diện cho khối lượng tổng, m SS là khối lượng chất rắn, và W là khối lượng ẩm.

Theo Salman và công sự năm 2016, hiệu suất của quá trình sấy thu chế phẩm enzyme là 90%

 Ta có lượng sản phẩm trước khi sấy là: m TS = (m SS + W)

Khối lƣợng riêng của enzyme: 1.25g/ml = 1250 kg/m 3

 Thể tích enzyme đem đi sấy là: V S =

Phương trình cân bằng vật chất: m TL = m SL + m hao hụt

Hiệu suất thu hồi của quá trình lọc này là 80% m TL = m SL + m TL

Vậy thể tích enzyme protease cần đem lọc là:

= 2358.4 m 3 /năm 1.4 Quá trình ly tâm

Hiệu suất thu hồi của quá trình ly tâm là 85%

Phương trình cân bằng vật chất: m TLT = m SLT + m sinh khối

= 3468236 (kg/năm) m sinh khối = m TLT – m SLT = = 520236 (kg/năm)

Vậy thể tích cần đƣa vào quá trình ly tâm là

= 220774,6 (m 3 /năm) 1.5 Quá trình lên men

Ta có : m LM = m TLT = 3468236 (kg/năm)

Tỷ lệ cấy giống 3% cho 1 mẻ nhƣng 1 năm có 128 mẻ Khối lƣợng giống cần bổ sung để lên men là: m giống = 3%m LM = = 104047.08 (kg/năm)

Với thành phần môi trường đã chọn, hoạt lực enzyme sau khi kết thúc quá trình lên men là 4133 U/mg ở 55°C và pH 6 (17)

Tổng hoạt độ enzyme thu đƣợc của quá trình lên men:

Để đạt được mục tiêu năng suất 600 tấn/năm, cần thiết lập quy trình sản xuất với năng suất enzyme trong quá trình lên men đạt 3.468.236 kg/năm, cùng với tổng hoạt lực enzyme thu được là (U).

Hoạt lực enzyme amylase sau khi kết thúc quá trình lên men là 2356 U/mL (18)

Với tổng hoạt lực enzyme thu đƣợc là (U) thì ta cần lên men với thể tích là:

Thể tích dịch giống cần lên men là:

Nồng độ sinh khối trong canh trường nuôi Bacillus subtilis là X = 7.8 g/L (19)

 1g sinh khối sẽ tạo ra

 Khối lƣợng sinh khối cần để sinh ra đƣợc U trong quá trình lên men là

Bảng 4 Thành phần môi trường lên men Thành phần Khối lƣợng (w/v) Khối lƣợng sử dụng (kg)

Sự thay đổi hoạt tính enzyme trong quy trình

Sự hao hụt hoạt tính enzyme qua các quá trình sau lên men đƣợc thể hiện qua bảng 5

Bảng 5 Sự hao hụt hoạt tính enzyme qua các quá trình

Hiệu suất Tài liệu tham khảo

Ly tâm Tăng 1.3 (20) HT = Lọc Tăng 3.4 (21) HT =

TÍNH TOÁN THIẾT BỊ

Kế hoạch sản xuất

Nhà máy sản xuất enzyme amylase dạng bột năng suất 600 tấn/năm

Một năm 365 ngày, trừ các ngày lễ (15 ngày) và thời gian bảo trì máy móc thiết bị (30 ngày)

Số ngày làm việc của công ty trong 1 năm:

Thời gian một mẻ kéo dài 2 ngày (48 h) (Bacillus subtilis sau 16-24h lên men là thời điểm tốt nhất để thu nhận enzyme) (23)

Thời gian nghỉ giữa mỗi mẻ là 0.5 ngày Vậy tổng thời gian cho một mẻ là :

Số mẻ lên men trong một năm là:

= 128 (mẻ/ năm) Năng suất sản xuất enzyme của nhà máy trên 1 mẻ nuôi cấy:

Tổng đơn vị hoạt lực chế phẩm enzyme thu đƣợc trên 1 mẻ nuôi cấy:

Nồng độ sinh khối trong canh trường nuôi Bacillus subtilis là X = 7.8 g/L (19)

1g sinh khối sẽ tạo ra = 302051.3 (UI/ g sinh khối)

Với tổng hoạt lực enzyme thu đƣợc là 1.12 10 11 UI thì thể tích bể lên men:

Khối lƣợng sinh khối sinh ra đƣợc trong 1 mẻ lên men: m sinh khối =

Tỉ lệ cấy giống là 1% (w/v) cho bể nhân giống ban đầu và lấy dịch nhân giống cấy vào bể lên men với tỉ lệ 10% (v/v)

 Thể tích bể nhân giống 3% (v/v):

Khi lựa chọn bể lên men, nên ưu tiên bể có hình dạng trụ, làm bằng thép không gỉ và có đáy lồi Bên trong bể cần trang bị các cảm biến và đầu dò để theo dõi các thông số điều kiện nuôi cấy Ngoài ra, bể cũng nên có 2 cánh khuấy dạng mái chèo và ống sục khí để đảm bảo quá trình lên men diễn ra hiệu quả.

Tính toán hiết bị lên men

Thiết bị nhân giống có:

• Thể tích bể nhân giống là: V bể =

Kết luận: Chọn thiết bị lên men dạng hình trụ, khuấy trộn có thể tích: V bể = 2.03m 3

≈ 2 m 3 Yêu cầu tỉ lệ đường kính thiết bị và chiều cao thiết bị: h ≥ 2D, chọn giá trị 2, nghĩa là h= 2D Ta có: V bể = ↔ D = 1.1 m

Từ đó ta tính đƣợc giá trị chiều cao h = 2D = 2× 1.1 = 2.2 m

Kết luận: Thiết bị nhân giống cấp 2 có đường kính (D)= 1.1 m, chiều cao(h) = 2.2 m

Tổng thể tích dịch nuôi cấy trong 1 mẻ là: V dịch = 48 m 3

Hình 12 Thiết bị lên men có đảo trộn

(Nguồn: http://valve.vn/goc-chuyen-gia/cac-thiet-bi-len-men-nuoi-cay-chim-vi-sinh- vat-trong-cac-moi-truong-dinh-duong-long.html )

• Thể tích bể lên men là:

Một bể có thể tích 120 m 3 phù hợp với quy mô công nghiệp và thích hợp với các thiết kế về tốc độ cánh khuấy (25)

Để tính thể tích, đường kính và chiều cao của thiết bị lên men theo Gimbun và cộng sự (2004), cần đảm bảo tỉ lệ giữa chiều cao và đường kính là h ≥ 2D Với giá trị chọn là 2, ta có h = 2D.

Từ đó ta tính đƣợc giá trị chiều cao (h) = 8.5 m

Kết luận: Thiết bị lên men có đường kính (D) là 4.25 m và chiều cao (h) là 8.5 m

Chọn cơ cấu khuấy với 2 turbine hở Rushton, mỗi turbine có 6 cánh phẳng hình chữ nhật được gắn trên đĩa trên trục khuấy Các cánh này được sắp xếp thẳng và song song với trục khuấy để tối ưu hóa quá trình khuấy trộn.

Giả sử tỉ lệ đường kính cánh khuấy (D i ) và đường kính bể (DT)là 0,3 (D i = 0,3D T ) (27) Đường kính cánh khuấy:

Bốn vách ngăn được thiết kế đều nhau nhằm ngăn chặn sự hình thành dòng xoáy, từ đó nâng cao hiệu suất pha trộn Chiều rộng của mỗi vách ngăn thường chiếm 1/10 đường kính của bể, cụ thể là D vách ngăn = 1/10 D T.

Chiều rộng của vách ngăn:

= 0,425 (m) Chọn chiều cao của cánh khuấy bằng 0.2 đường kính cánh khuấy (27)

Giả sử chiều rộng của cánh khuấy bằng 0.25 so với đường kính cánh khuấy

Chiều rộng của cánh khuấy:

Chiều cao của bể lên men cần thiết kế cánh khuấy, với khoảng cách giữa hai cánh khuấy và khoảng cách từ cánh khuấy đầu tiên đến đáy bể là 1,5 lần đường kính của cánh khuấy.

 Khoảng cách giữa 2 cánh khuấy = 1,5 x D i = 1,5 x 1,275 = 1.913 (m)

Bảng 6 Thông số bể nuôi cấy

Chiều cao bể 8.5 m Đường kính bể 4.25 m Đường kính cánh khuấy 1.275 m Đường kính vách ngăn 0.425 m

Chiều cao lƣỡi cánh khuấy 0.255 m Chiều rộng lƣỡi cánh khuấy 0.319 m

Chọn cánh khuấy Rushton có tỷ lệ công suất/thể tích: = 1,5 (kW/m 3 )

Giả sử bể hoạt động ở chế độ chảy rối (Re >105): NP = 5.0

43 Độ nhớt canh trường: 𝜇 = 10 −3 (Pa.s) (24)

N P : chuẩn số công suất (power number)

Di: đường kính cánh khuấy

 Kiểm soát nồng độ oxy

Tốc độ truyền oxy: OTR = k La (C* OL – C OL )

C* OL phụ thuộc vào nhiệt độ, áp suất và thành phần môi trường Ta có thể xác định C* OL từ định luật Henrry theo công thức: C* OL = p o x H o

Ta sử dụng khí trời để sục nên áp suất của khí là 1atm Tỉ lệ oxy trong khí quyển là 21%

Nên áp suất riêng phần của oxy trong khí quyển là: p o = 0.21 atm

Quá trình lên men đƣợc duy trì ở 30 o C tại áp suất 1 atm thì hàm lƣợng oxy hòa tan:

Cùng 1mol oxy thì ta có V = 22.4 (L) và m = 32 (g) Từ đó ta có hệ số chuyển đổi từ ml sang mg là: 1 ml =

Nồng độ oxy bão hòa:

Hệ số truyền khối: k La = ( )

Chọn C OL = 50% × C* OL => C OL = 0.5 × 7.67 = 3.835 (mg/L)

• Tốc độ truyền khối oxy:

 Công thức tính tốc độ sử dụng oxy: OUR = 𝑞𝑜 × X

Trong đó: q o : Tốc độ sử dụng oxy riêng (mmol oxy/g sinh khối.h) μ: tốc độ tăng trưởng riêng (h -1 ), với μ = 0.05 (h -1 ) (29)

Y o : Năng suất tạo ra bởi 1 mol Oxy (g sinh khối/ mol oxy) Y o = 260 mmol oxy/g tế bào

Tốc độ sử dụng oxy riêng:

Ta thấy: OTR = 1.62504 > OUR = 0.017 vì vậy hệ thống cấp khí là phù hợp cho hoạt động lên men.

Tính toán thiết bị ly tâm

Amylase dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao nên cần thực hiện phương pháp ly tâm lạnh ở nhiệt độ thấp Môi trường nuôi cấy được ly tâm ở 10.000 g trong 10 phút ở 4 ° C (30)

Khối lƣợng riêng của enzyme amylase là 1.25 g/mL = 1250 kg/m 3 , thể tích của enzyme trước khi ly tâm :

Thể tích cần ly tâm trong 1 mẻ:

Giả sử trong quy mô công nghiệp quá trình ly tâm đƣợc thực hiện trong 6 giờ

Dựa vào tính chất và đặc tính của thiết bị ly tâm trong việc phân tách vi sinh vật, cùng với tính toán kỹ thuật chi tiết, thiết bị ly tâm loại đĩa là sự lựa chọn tối ưu để đạt công suất 600 tấn/năm Máy ly tâm dạng đĩa không chỉ có mức độ phân ly cao mà còn phù hợp với kích thước của Bacillus Subtilis, vì vậy nên chọn thiết bị ly tâm dạng đĩa hitech model.

Hình 13 : Thiết bị ly tâm dạng đĩa hitech model 270 Bảng 7: Thông số thiết bị ly tâm dạng đĩa hitech model 270 Đặc điểm Thông số

Công suất 1.5 – 2.5 (m 3 /h) Đường kính trong ro 270 mm Đường kính ngoài ri 7609 mm

Để thu enzyme, cần sử dụng lực ly tâm đạt 10000 g Thiết bị ly tâm Hitech model 270 có đường kính trong 270 mm và đường kính ngoài 760 mm được sử dụng trong quá trình này.

Từ đó ta tính đƣợc vận tốc góc ( ) và tốc độ quay (rpm) trong quá trình thu tủa:

Từ vận tốc góc, ta có tốc độ vòng của máy bằng: rpm =

Nhƣ vậy, quá trình ly tâm đƣợc thực hiện với tốc độ 1104.05 vòng/phút

( ) Trong đó: n: lƣợng đĩa, thiết bị có 118 đĩa : góc nghiêng tạo nên con đĩa, độ (chọn = 45 độ) r 0 và ri: bán kính trong và bán kính ngoài của đĩa

 Vận tốc dịch đi vào máy ly tâm:

 Năng suất của thiết bị ly tâm FW-1300:

 Vậy với năng suất của thiết bị là Q2 = 1720.28 m 3 /h có thể đáp ứng với năng suất cần thực hiện ly tâm Q 1 = 287.46 m 3 /h nên ta chỉ cần 6 máy ly tâm.

Tính toán thiết bị lọc

Bảng 9 Thông số của quá trình lọc

Thông số Đơn vị Tài liệu tham khảo

Kích thước lỗ lọc 30 kDa Chọn màng lọc 30kDa của hãng

SynderFiltration để phù hợp với yêu cầu là cô đặc dịch enzyme α - amylase

Vận tốc dịch lọc qua màng

- Giả sử ta cho hệ số tách loại là 99%

- Khối lƣợng phân tử của α- amylase vào khoảng 50 kDa

- Nồng độ enzyme đầu vào:

Thể tích dòng dung dịch đƣa vào quá trình lọc là: Vf = 2358.4 m 3 /năm

Chọn quá trình lọc gián đoạn, ta có:

C f : Nồng độ dòng dung dịch đi vào hệ thống

V f : Thể tích dòng dung dịch đi vào hệ thống

C r : Nồng độ dịch không qua màng lọc

V r : Thể tích không đi qua màng lọc

C p : Nồng độ trong dịch lọc

- Hiệu suất quá trình là:

Ta có, hệ số tách loại của màng lọc là: R= 99%

Tương tự ta tính được Cp = 0.01C r => 0.109 ( tấn/m 3 )

Ta chọn thời gian lọc là t = 5(h)

Chọn màng lọc 30 kDa của hãng SynderFiltration để phù hợp với yêu cầu là cô đặc dịch

Để lựa chọn loại màng lọc phù hợp với lưu lượng dòng đã tính toán là 246.6698 m³/h, cần chọn màng lọc có đường kính ống 10” với lưu lượng lọc tương ứng Diện tích màng lọc cần thiết là 326 ft², tương đương khoảng 30.28 m² (với 2.153 ft² = 0.2 m²).

→ Suy ra cần 12 ống lọc

Kết luận: Đối với quá trình lọc màng để cô đặc α-amylase từ vi khuẩn Bacillus Subtilis sau khi ly tâm loại bỏ sinh khối ta lựa chọn:

• Thiết bị siêu lọc có màng lọc màng lọc 30 kDa của hãng SynderFiltration

• Thể tích cần lọc 2358.4 m 3 /năm

• Vận tốc dịch lọc qua màng: Jv = 714 (L/h/m 2 )

• Lưu lượng dòng sau lọc Qp = 246.6698 m 3 /h

Tính toán thiết bị sấy phun

Khối lƣợng đƣa vào quá trình sấy (1 mẻ): m sấy =

= 19831.25 (kg) với nồng độ chất khô là 30%

Quá trình sấy phun có bổ sung maltodextrin 1% cung cấp sự ổn định tốt nhất trong suốt thời gian sấy (35)

Lƣợng ẩm bay hơi khỏi vật liệu:

 Độ ẩm vật liệu trước khi sấy: x1 = 75%

 Độ ẩm vật liệu sau khi sấy: x 2 = 5%

Nhiệt độ tác nhân sấy đầu vào t 1 = 120 ± 2°C, nhiệt độ tác nhân sấy đầu ra t 2 = 84 ±2°C (35)

Tính toán lựa chọn thiết bị sấy Đặt các ký hiệu:

L 1 – lƣợng vật liệu đi vào máy sấy, kg hay kg/h

L 2 – lƣợng vật liệu ra khỏi máy sấy, kg hay kg/h x 1 , x 2 – độ ẩm của vật liệu trước và sau khi sấy

W – lƣợng ẩm cần tách trong quá trình sấy, kg

Phương trình cân bằng vật liệu chung:

Lượng vật liệu trước khi sấy: L 1 = m sấy = 19831.25 (kg)

Lƣợng ẩm cần tách ra khỏi vật liệu:

Thời gian lên men cho 1 mẻ là 48h (2 ngày) nên ta cho thời gian sấy tối đa là 1 ngày (trừ thời gian máy móc nghỉ) tsấy = 1 (ngày) = 24 (h)

(kg ẩm/h) Lựa chọn thiết bị

Tính toán thông số cho quá trình sấy

Với t o 5°C và 𝜑o= 80% (điều kiện nhiệt độ và hàm ẩm ở Tp.HCM)

Từ t o 5°C và 𝜑 o = 80%, tra giản đồ Ramzin ta đƣợc d o = 0.029 (kg ẩm/kkk)

Enthalpy của hỗn hợp không khí ẩm trước khi vào caloriphe là:

H o = Trong đó: c k = 1: nhiệt dung riêng của không khí khô (kkk), kJ/kg.°C r o = 2493: enthalpy của hơi nước ở 0°C, kJ/kg

C h = 1.97: nhiệt dung riêng của hơi nước, kJ/kg.°C

Enthalpy của hỗn hợp không khí trước khi vào buồng sấy t 1 = 120°C, d o = d 1 :

Vì trong suốt quá trình sấy enthalpy của không khí không đổi nên:

Với H 2 là enthalpy của không khí sau khi sấy

Dựa vào công thức tính enthalpy ở nhiệt độ t 2 = 84 o C ta có:

 Hàm ẩm của không khí sau khi ra khỏi phòng sấy:

Lượng không khí khô cần thiết để bốc hơi 1 kg ẩm trong quá trình sấy được tính bằng công thức l = (kg kkk/kg ẩm bay hơi) Điều này cho thấy rằng việc xác định chính xác lượng không khí khô là rất quan trọng để tối ưu hóa hiệu quả của quá trình sấy.

Nhiệt lƣợng riêng tiêu tốn cho quá trình sấy:

(kJ/kg ẩm) Công suất tiêu thụ của quá trình sấy:

Thiết kế thiết bị sấy

Giả sử ta chọn thời gian lưu của khí là 20s và mật độ dòng khí ra là 0.89 kg/m3

Lƣợng không khí tiêu hao trong quá trình sấy: L = 43492.3 (kg kkk/h)

Ta có ρ 1 , ρ 2 là khối lƣợng riêng của không khí ở nhiệt độ t 1 , t 2 t 1 = 84°C => ρ 1 = 0.898 (kg/m 3 ) t 2 = 120°C => ρ 2 = 0.986 (kg/m 3 )

Thể tích không khí vào và ra khỏi thiết bị sấy:

44109.84 (m3/h) Lưu lượng không khí khô chuyển động trong tháp sấy phun:

Lưu lượng không khí thực chuyển động trong tháp sấy bao gồm lượng không khí khô và lƣợng hơi ẩm bốc hơi từ vật liệu sấy: ρ h =1.296

W: lƣợng ẩm bay hơi (kg/h) τ : thời gian lưu trong buồng sấy (h), t = 20 (s) (h) = 5,55 10 -3 (h) Cấu tạo buồng sấy chia làm 2 loại, gồm thân hình trụ và phần chóp nón là đáy, vậy thể tích thân thiết bị bằng:

Thể tích khối nón ở đáy thế bị:

Chọn h 1 = 1,5D, ta có tổng thể tích thiết bị bằng:

√ Vậy đường kính buồng sấy là D =5.574 (m)

Chiều cao của buồng sấy được xác định gấp 1,5 lần đường kính thiết bị, với chiều cao h1 là 8.36 m và h2 là 4.83 m Tổng chiều cao thiết bị sấy là htb = h1 + h2 = 13.19 m Để đáp ứng nhu cầu sản xuất, nhóm đã quyết định chọn thiết bị sấy phun LPG – 800.

Hình 15 Thông số Kỹ thuật của máy sấy phun LPG (Nguồn : http://saobaca.com/san-pham/may-say-dang-phun/ )

Tính toán thiết bị đóng gói

Chọn thiết bị đóng gói tự động bao bì dạng bột SJIII-F1000 của công ty máy móc thiết bị Thành Trung

Bảng 10 Thông số kỹ thuật máy đóng gói Đặc điểm Thông số

Tốc độ đóng gói 15-20 sản phẩm/ phút

Khỗi lƣợng 1 sản phẩm (kg) 1

Công suất tiêu thụ (kW/V) 3.5/220

Khối lƣợng thiết bị (kg) 1200

Bao bì sử dụng Laminated film, PE, PP

Chiều dài bao bì (mm) 300

Chiều rộng bao bì (mm) 280

Kích thước thiết bị (mm) 2000 × 1600 × 2300

Khối lƣợng 1 sản phẩm là 1kg và khối lƣợng enzyme sau 1 mẻ là 4690 kg/mẻ

 Tổng sản phẩm 1 mẻ = 4690 (sản phẩm)

Năng suất đóng gói của thiết bị trong 1 phút trung bình là 20 sản phẩm Vậy thời gian cần để đóng gói sản phẩm 1 mẻ là:

BÀI TOÁN KINH TẾ

Vốn cố định

Bảng 11 Giá thiết bị sử dụng

STT Tên thiết bị Số lƣợng

Bảng giá ( VNĐ) Thành tiền (VNĐ)

2 Thiết bị trộn thùng quay 2 100.000.000 200.000.000

Giả sử chi phí vận chuyển và lắp đặt thiết bị bằng 1% tổng chi phí đầu tƣ cho hệ thống thiết bị:

Bảng 12 Giá xe sử dụng Tên xe Số lƣợng Đơn giá ( VNĐ) Tổng giá ( VNĐ)

Xe nâng (nguyên liệu và thành phẩm)

Xe tải vận chuyển nguyên liệu

Xe tải vận chuyển sản phẩm 2 940.000.000 3.760.000.000

Tổng chi phí đầu tư cho lắp đặt, thiết bị và phương tiện vận tải:

Bảng 13 Giá xây dựng công trình Tên công trình Diện tích (m 2 ) Phí xây dựng (VND)

Khu vực công trình phụ ( quản lý điện, PCCC, xử lý nước thải,….)

Khu vực hành chính - sinh hoạt ( phòng ban, nhà ăn, nhà vệ sinh,… )

Tổng chi phí xây dựng: (T XD ) 11.950.000.000

Giả sử nhà máy đặt tại khu công nghiệp Tân Bình TP HCM và giá thuê đất là 80 triệu/tháng

Vậy phí thuê đất trong 1 năm là:

→ Tổng chi phí đầu tƣ cơ sở vật chất là:

Chi phí sản xuất trực tiếp

2.1 Chi phí nguyên liệu sản xuất

STT Nguyên liệu Số lƣợng/ 1 năm (kg) Đơn giá Thành tiền

1.1.1 Tổng chi phí cho 1 năm: (T NVL ) 9.391.745.800

STT Chức vụ Số lƣợng

4 NV tổ chức – hành chính

6 NV kế toán – tài tính 4 6.500.000 32.500.000

Tổng chi phí nhân sự 1 tháng 733.500.000 Tổng chi phí nhân sự trong 1 năm: (T NS ) 8.802.000.000

Bảng 16: Chi phí nhiên liệu tiêu thụ trong 1 năm

Danh mục Đơn giá Số lƣợng Thành tiền (VND)

Số liệu tham khảo tại:

Công ty cổ phần cấp nước Tân Hòa

EVNNPC - Tập đoàn điện lực Việt Nam

Petrolimex – Tập đoàn xăng dầu Việt Nam

Công ty TNHH SX-TM-DV-XNK Thiên Long)

→ Tổng chi phí sản xuất trực tiếp trong 1 năm:

2.4 Chi phí sản xuất gián tiếp:

2.4.1 Chi phí bảo trì thiết bị và công trình:

Giả sử phí bảo trì trong 1 năm bằng 10% tổng chi phí đầu tƣ cho máy móc và xây dựng:

2.4.2 Chi phí xử lý nước thải:

Giả sử phí xử lý nước thải trong 1 năm bằng 3% chi phí sản xuất trực tiếp:

2.4.2 Chi phí bảo hiểm nhân sự

Theo Quyết định só 595/QĐ-BHXH, mức đóng BHXH năm 2019 do chủ doanh nhgiệp đóng cho nhân viên nhƣ sau:

T BHXH = 17,5% x Tiền lương hàng tháng

T BHYT = 3% x Tiền lương hàng tháng

T BHTN = 1% x Tiền lương hàng tháng

T BH = 21.5% x Tiền lương hàng tháng

Bảng 17: Chi phí bảo hiểm

STT Chức vụ Số lƣợng

Phí bảo hiểm (VND/năm)

4 NV tổ chức – hành chính

6 NV kế toán – tài tính

Tổng chi phí bảo hiểm nhân sự 1 năm: T BH 1.902.750.000

Theo phụ lục 01 Thông tƣ 45/2013/TT-BTC ban hành ngày 25/04/2013 của Bộ Tài chính quy định khung thời gian trích khấu hao tài sản cố định, trong đó:

- Thời gian trích khấu hao cho máy móc, thiết bị công tác khác là 12 năm

- Thời gian trích khấu hao cho thiết bị và phương tiện vận tải đường bộ là 10 năm

- Thời gian trích khấu hao cho công trình nhà máy là 20 năm

→ Tổng khấu hao cho máy móc thiết bị, phương tiện và công trình là:

→ Tổng chi phí sản xuất gián tiếp trong 1 năm là:

T GT = T BT + T XL + T BH +T KH

→ Tổng vốn lưu động 1 năm:

Tính toán lợi nhuận và thời gian hoàn vốn

Giả sử tiền đầu tƣ là 100% vay vốn ngân hàng 1 năm

Theo lãi suất ngân hàng VP Bank trung bình hiện nay 7%/năm

Lãi vốn vay đầu tƣ

Tổng chi phí hằng năm

= Vốn lưu động + khấu hao hằng năm + lãi suất hằng năm

Xác định mức lợi nhuận là 30% vốn đầu tƣ cho 1 kg enzyme, ta có giá bán 1 kg sản phẩm ra thị trường:

Căn cứ vào giá enzyme trên thị trường công ty quyết định chọn giá sản phẩm trên thị trường là 240 000 VND

LNTT = Doanh thu - chi phí sản xuất - khấu hao

= 31.358.133.100 ( VND) Thuế doanh nghiệp năm 2018 ( Theo điều 11 Thông tƣ 78/2014/TT-BTC)

- Thuế thu nhập doanh nghiệp: 20% lợi nhuận trước thuế

LNR = Lợi nhuận trước thuế - Thuế doanh nghiệp

Dòng tiến (CF) = lợi nhuận ròng + khấu hao

Giá trị hiện tại thuần (NPV) và Tỷ suất hoàn vốn nội bộ (IRR)

4.1 Giá trị hiện tại thuần (Net present value - NPV)

Dòng tiến (CF) = lợi nhuận ròng + khấu hao

CF O : Là tiền đầu tƣ ban đầu (vốn cố định)

: là tổng giá trị hiện tại của dòng tiền trong dự án

𝑛: là tuổi thọ dự án

𝑟: là hệ số chiết khấu giả sử vòng đời 10 năm

Bảng 18: Giá trị hiện tại thuần

CFo Hệ số chiết khấu 7%

Dựa vào kết quả từ bảng trên ta thấy rằng NPV = 186.096.638.029 > 0 và đây là dự án độc lập => dự án có tính khả thi đƣợc chấp nhận đầu tƣ

4.2 Tỷ suất hoàn vốn nội bộ (IRR)

Tỷ suất hoàn vốn nội bộ (IRR) là tỷ lệ chiết khấu mà tại đó giá trị hiện tại thuần của dự án bằng không Điều này có nghĩa là giá trị hiện tại của dòng tiền tương lai từ dự án sẽ tương đương với khoản đầu tư ban đầu.

Sử dụng phần mêm Excel, ta tính đƣợc IRR của dự án bằng 42 % > 7% (tỷ lệ chiết khấu của dự án) Do đó, dự án đƣợc chấp nhận

Dựa trên kết quả NPV và IRR, dự án sản xuất enzyme Cellulase có khả năng triển khai hiệu quả Sau 2 năm 11 tháng, công ty sẽ hoàn vốn và từ năm tiếp theo, công ty sẽ bắt đầu thu lợi nhuận.

TÍNH TOÁN RỦI RO

Sản phẩm không đạt chất lƣợng

Cho tỉ lệ sản phẩm lỗi là 0.05% (Cứ 6000 kg sản phẩm sẽ có 1 kg sản phẩm không đạt chất lƣợng)

Số lƣợng sản phẩm không đạt chất lƣợng trong 1 năm: =0.05% × (600 × 1000) = 300 (kg sản phẩm)

Chi phí hao hụt do sản phẩm không đạt:

Tổn kho cuối năm

Giả sử hàng tồn kho cuối năm là 2%

Cuối năm tồn kho: 2% x (600 x 1000)= 12000 (kg sản phẩm)

Hao hụt do hàng tồn kho là: 12000 x 131.000 = 1.572.000.000 (VND)

2.1 Rủi ro trong quá trình vận chuyển

Giả sử tỉ lệ rủi ro trong quá trình vận chuyển là 0.005%

Hao hụt chi phí: 0.005% × (600 × 1000) × 131.000 = 3.930.000 (VNĐ)

Giả sử tỉ lệ hư sản phẩm do tác động của môi trường xung quanh (mưa, côn trùng) trong quá trình vận chuyển là 0.1%

Chi phí hao hụt: 0.1% × (600 × 1000) × 131.000= 78.600.000 (VNĐ)

2.2 Tổng chi phí rủi ro