Thiết kế quy trình sản xuất enzyme Protease từ Chủng Bacilus Licheniformis với công suất ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019 Page 3 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN 2 DANH MỤC HÌNH ẢNH 6 DANH MỤC BẢNG 7 ĐẶT VẤN ĐỀ 8 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 9 1 1 Giới thiệu enzyme.
TỔNG QUAN
Giới thiệu enzyme protease
Protease là một loại enzyme thuộc nhóm hydrolase, có vai trò quan trọng trong việc xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptide (-CO – NH-) trong protein, giúp giải phóng các acid amin, peptone hoặc ditripeptone Ngoài chức năng này, protease còn có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển acid amin.
H 2 N-CH-CO-NH-CH-CO - ….- NH-CH-COOH
H 2 N-CH-COOH + H 2 N-CH-CO…NH-CH-COOH
Hình 1: Phản ứng thủy phân liên kết peptide.
Các protease trong cơ thể thường tồn tại dưới dạng không hoạt động gọi là zymogen Chúng có thể trở thành hoạt động khi chính protease tương ứng cắt đứt một hoặc nhiều liên kết peptide trong phân tử của nó Quá trình này giúp thay đổi cấu trúc phân tử, tạo điều kiện thuận lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme khi chuyển sang trạng thái hoạt động.
Cấu trúc bậc bốn của protein đóng vai trò quan trọng trong việc phân giải chất dưới tác động của enzyme protease Nghiên cứu này thuộc Đồ án Kỹ thuật Các quá trình sinh học năm 2019, nhấn mạnh mối liên hệ giữa cấu trúc protein và hoạt động của enzyme trong quá trình phân giải.
Protease là enzyme thiết yếu cho sự sống, đóng vai trò quan trọng từ cấp độ tế bào đến cơ quan và toàn bộ cơ thể Chúng có mặt rộng rãi trong các sinh vật, bao gồm vi sinh vật như vi khuẩn, virus, nấm, thực vật như đu đủ và dứa, cũng như động vật như gan và dạ dày bê.
Hình 2: Cấu trúc không gian enzyme protease 1.1.2 Phân loại ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4)
Hình 3: Sơ đồ phân loại protease
Enzyme protease đƣợc phân theo những cách khác nhau, tuy nhiên hai đặc điểm chính để phân loại protease gồm có:
Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên các liên kết peptide trong phân tử protein, người ta chia protease thành hai nhóm:
Endopeptidase (proteinase): chủ yếu phân giải các liên kết peptide nằm trong phân tử protein tạo thành những đoạn peptide có trọng lƣợng phân tử nhỏ
Exopeptidase (polypeptidase): chủ yếu phân cắt peptide ở hai đầu mạch
Dựa vào thành phần amino acid và vùng pH tối ưu của protease, người ta chia protease các nhóm:
Metallo proteinase ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Protease acid: pepsin, renin, … hoạt động ở vùng pH acid
Protease kiềm: trypsin, chymotrypsin, … hoạt động ở vùng pH kiềm
Protease trung tính: papain, … hoạt động ở vùng pH trung tính
1.1.3 Cơ chế phản ứng của protease
Mặc dù các protease vi sinh vật có trung tâm hoạt động khác nhau, chúng đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung.
E: Enzyme; S: cơ chất ;ES: Phức chất enzyme – cơ chất
ES’: Phức chất trung gian enzyme- cơ chất acyl hóa Acyl enzyme)
Sản phẩm đầu tiên của chuỗi phản ứng là nhóm amin tự do mới được hình thành, trong khi sản phẩm thứ hai là nhóm carboxyl tự do mới được tạo ra.
Cơ chất kết hợp với enzyme tạo thành phức hợp trung gian ES Sau khi phức hợp ES hình thành, carbon trong nhóm cacboxyl của liên kết peptide dễ bị phân cắt bởi serin tại trung tâm hoạt động, dẫn đến việc tạo ra một chất trung gian tứ diện với một trung tâm oxylanion trên carbon cacbonyl, tương tự như trạng thái chuyển tiếp của phản ứng Trạng thái chuyển tiếp này được ổn định nhờ các tương tác liên kết hydro đặc hiệu giữa các gốc trong túi trung tâm hoạt động và trung tâm oxylanion của cơ chất.
Trong subtillizin, liên kết hydro này đƣợc tạo thành từ nitơ của serin 195 trong bộ khung và của serin 155 chuỗi bên
Trong chymotrypsin, các liên kết hydro được hình thành giữa nitơ của gốc serin ái nhân và một glyxin tại trung tâm hoạt động, đóng vai trò quan trọng trong chức năng của enzyme này.
Các gốc ser- 195 và His-57 trực tiếp tham gia trong phản ứng cắt đứt liên kết peptide của cơ chất
Các nguyên tử liên kết C của –CO- được sắp xếp theo hình khối tứ diện, dẫn đến việc giải phóng sản phẩm P1 và phức acyl-enzyme Sự hình thành phức diện tức thời còn liên quan đến hai nhóm –NH- từ mạch chính của enzyme, tạo liên kết hydrogen với oxyanion (O 2 và CO).
Phức hợp acyl-enzyme bị thủy phân bởi nước, diễn ra ngược lại với giai đoạn acyl hóa Quá trình này dẫn đến việc khử acyl cho enzyme thông qua tác động của nước, khi phân tử nước xâm nhập vào trung tâm hoạt động của enzyme Sự hình thành này liên quan đến việc làm bền liên kết hydro với enzyme Nhóm imidazole trong enzyme đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển proton từ nhóm -OH của serin cho nhóm amin, giúp tái sinh enzyme.
1.1.4 Ứng dụng của enzyme protease
Protease đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp nhƣ công nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dƣợc phẩm và nông nghiệp…
Trong ngành công nghiệp chế biến thịt, protease được sử dụng để làm mềm thịt bằng cách thủy phân một phần protein, giúp thịt trở nên mềm mại hơn và cải thiện hương vị.
Sử dụng protease từ Streptomyces fradiae để sản xuất dịch đạm là một phương pháp hiệu quả, cho phép thuỷ phân keratin từ da và lông vũ Việc sử dụng axit trong quá trình thuỷ phân có thể dẫn đến mất mát các axit amin chứa lưu huỳnh, trong khi sử dụng kiềm có thể gây ra hiện tượng racemic hoá, làm giảm giá trị sinh học của axit amin Để đạt được sự thuỷ phân triệt để protein, đặc biệt trong nghiên cứu và chế tạo dịch truyền đạm y tế, cần sử dụng các protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng.
Page 14 thường dùng phối hợp cả 3 loại protease của 3 loài: vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ lệ tổng cộng 1- 2% khối lƣợng protein cần thuỷ phân Ƣu điểm của việc thuỷ phân protease bởi enzyme là bảo toàn đƣợc vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm màu dịch thuỷ phân
Trong ngành công nghiệp sữa, protease đóng vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất phomat nhờ vào khả năng làm đông tụ sữa Các loại protease được chiết xuất từ một số vi sinh vật như A candidus và P roqueforti thường được sử dụng để cải thiện chất lượng và hương vị của sản phẩm phomat.
B mesentericus,… đƣợc dùng trong sản xuất pho mát Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn
Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình sinh tổng hợp protease
1.2.1 Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng
Tỷ lệ và loại dinh dưỡng trong môi trường ảnh hưởng lớn đến khả năng tổng hợp protease của vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn Bacillus Để tối ưu hóa sản lượng protease, cần lựa chọn nguồn carbon, nitrogen và muối khoáng phù hợp, cũng như xác định tỷ lệ hợp lý giữa các thành phần này, đặc biệt chú trọng đến nguồn cơ chất cảm ứng.
Nguồn carbon chủ yếu để nuôi cấy vi sinh vật bao gồm các glucid như mono-, di- và polysaccharide (tinh bột) Tác động của nguồn carbon này phụ thuộc vào bản chất hóa học của chúng và đặc tính sinh lý của từng loài vi sinh vật Nồng độ glucid tối ưu cho quá trình tổng hợp protease cũng khác nhau tùy vào loài vi sinh vật Các nguồn carbon tự nhiên thường được sử dụng trong nuôi cấy bao gồm bột mì, bột gạo, các loại cám, hoặc nước chiết xuất từ những nguyên liệu này.
Tinh bột là nguồn carbon của nhiều trong chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme protease
Ví dụ: Vi khuẩn B subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ở môi trường tinh bột > 8%
Glucose, sucrose, maltose, fructose, and sorbitol are the most effective carbon sources for the synthesis of protease in Bacillus subtilis bacteria.
Nguồn nitơ trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật có thể đến từ các chất hữu cơ như protein và các sản phẩm thuỷ phân của protein, hoặc từ các muối vô cơ chứa nitơ như amoni và nitrat Giá trị dinh dưỡng của các nguồn nitơ này phụ thuộc vào khả năng thu nhận nitơ dưới dạng NH3.
Nguồn nitơ hữu cơ đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp protease, hoạt động như chất cảm ứng cho quá trình này Các nguồn nitơ hữu cơ phổ biến bao gồm pepton, casein, albumin và bột đậu tương Trong số đó, peptone ở nồng độ thấp là chất cảm ứng hiệu quả nhất cho quá trình tổng hợp protease Việc thay thế peptone bằng casein, đặc biệt ở nồng độ cao, sẽ dẫn đến sự giảm đáng kể lượng protease được tổng hợp.
Nguồn nitơ vô cơ tối ưu cho vi khuẩn là (NH4)2SO4, trong khi các muối clorua, sulphate và nitrate amon có thể gây ảnh hưởng tiêu cực đến quá trình tổng hợp protease.
Khi sử dụng phối hợp nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ sẽ làm tăng đáng kể quá trình tổng hợp protease [4]
1.2.1.3 Các nguyên tố khoáng đa lƣợng và vi lƣợng
Các hợp chất khoáng đóng vai trò quan trọng trong nuôi cấy vi sinh vật, vì chúng ảnh hưởng đến trạng thái hóa keo của tế bào chất Phospho và lưu huỳnh có tác động đáng kể đến quá trình sinh tổng hợp protease, trong khi các photphase vô cơ có thể gây ảnh hưởng tiêu cực KH2PO4 thường mang lại tác động tích cực nhờ tính chất đệm của nó Lưu huỳnh có vai trò điều hòa khác nhau trong quá trình tổng hợp protease của vi sinh vật.
Trong tế bào vi sinh vật, có sự hiện diện của nhiều yếu tố khoáng như magiê, natri và sắt Các vi sinh vật có khả năng thu nhận các khoáng chất này từ môi trường xung quanh hoặc thông qua việc bổ sung muối khoáng vào môi trường nuôi cấy, hoặc chúng có thể có sẵn trong nguyên liệu pha môi trường.
1.2.1.4 Cơ chất cảm ứng sinh tổng hợp protease
Một số enzyme do vi sinh vật tổng hợp thường có hàm lượng thấp trong điều kiện bình thường, nhưng có thể gia tăng đáng kể khi bổ sung các chất cảm ứng vào môi trường nuôi cấy Những enzyme này được gọi là enzyme cảm ứng, và chất gây ra hiệu ứng này được gọi là chất cảm ứng.
Chất cảm ứng là cơ chất đặc hiệu của enzyme, bao gồm các chất tương tự hoặc sản phẩm trung gian trong quá trình biến đổi chất.
Khả năng sinh tổng hợp protease được kích thích bởi các nguồn protein như bột đậu nành, đậu phộng, bột cá, bột tôm, và các nguyên liệu khác như móng, sừng hoặc lông vũ Tuy nhiên, hoạt động của enzyme này khác nhau tùy thuộc vào loại cơ chất Do đó, trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật, việc lựa chọn bổ sung các cơ chất phù hợp là cần thiết để thu được lượng lớn protease một cách hiệu quả và khoa học.
1.2.2 Ảnh hưởng của yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp protease 1.2.2.1 Nhiệt độ
Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển và khả năng tổng hợp enzyme của vi sinh vật, cũng như ảnh hưởng đến tính chất của các enzyme được sản xuất Mỗi chủng vi sinh vật sẽ có mức nhiệt độ tối ưu khác nhau để phát triển và hoạt động hiệu quả.
Nấm sợi thường phát triển ở khoảng nhiệt độ 22 – 32 0 C Còn vi khuẩn thì phát triển ở nhiệt độ cao hơn thường là 35 – 55 0 C [7] ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Page 18 Đa số các vi sinh vật tổng hợp enzyme không bền với nhiệt độ và bị kìm hãm nhanh chóng khi ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp
Phương pháp nuôi cấy bề mặt có ưu điểm là pH của môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp enzyme của vi sinh vật nhờ vào tính đệm cao của môi trường bán rắn Đối với nấm sợi, pH tối ưu cho quá trình tổng hợp protease nằm trong khoảng 6 - 6,5, trong khi các vi khuẩn phát triển tốt và sản xuất nhiều enzyme ở pH trung tính từ 6,6 đến 7,4.
Phương pháp nuôi cấy bề sâu cho thấy pH có ảnh hưởng lớn đến sự tích lũy protease trong môi trường Sau khi thanh trùng, pH của môi trường có thể thay đổi đáng kể, đặc biệt trong quá trình nuôi cấy pH ban đầu lý tưởng cho sự phát triển của nấm sợi là từ 3,8 đến 5,6, trong khi vi khuẩn thích hợp trong khoảng 6,2 đến 7,4 Trong suốt quá trình nuôi cấy, pH sẽ thay đổi theo thành phần môi trường và sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật, thường có xu hướng chuyển sang axit hoặc kiềm Đối với chi Bacillus, pH thường chuyển về kiềm Bằng cách theo dõi pH sau nuôi cấy, người ta có thể dự đoán lượng protease tích lũy Hơn nữa, pH ảnh hưởng đến tỷ lệ giữa các loại protease được tổng hợp, vì vậy việc duy trì pH ổn định trong suốt quá trình nuôi cấy sẽ giúp vi sinh vật sản sinh một loại protease xác định chiếm ưu thế.
Khái quát về chủng Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis là một loại vi khuẩn thường xuất hiện trong đất và trên lông chim Các loài chim như chim sẻ và vịt, thường sống gần mặt đất hoặc trên mặt nước, là những vật chủ phổ biến mang loại vi khuẩn này Bacillus licheniformis chủ yếu tập trung xung quanh khu vực ngực và bộ lông của chim.
Các nhà khoa học đang nghiên cứu khả năng giảm lông cho mục đích nông nghiệp Da chứa nhiều protein không tiêu hóa, nhưng thông qua quá trình lên men B licheniformis, họ hy vọng sử dụng lông vũ để sản xuất bột lông vũ giá rẻ và bổ dưỡng cho gia súc.
Khả năng bài tiết cao của protease serine kiềm từ Bacillus licheniformis khiến vi khuẩn này trở thành một trong những loại vi khuẩn quan trọng nhất trong ngành sản xuất enzyme công nghiệp Bacillus licheniformis được giới thiệu như một nguồn enzyme tiềm năng cho nhiều ứng dụng.
Hình 4: Hình dạng của Baccilus Licheniformis ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
B licheniformis là một vi khuẩn gram dương, hình que, ưu nhiệt B
Licheniformis có nhiệt độ tăng trưởng tối ưu khoảng 30°C và nhiệt độ lý tưởng để sản xuất enzyme là 37°C Vi khuẩn này có khả năng sản sinh nhiều loại enzyme quan trọng như protease và amylase, giúp thủy phân glucid, lipid và protid Ngoài ra, enzyme cellulase của nó có khả năng biến đổi chất xơ thành các loại đường dễ tiêu Licheniformis cũng sản xuất lecitinase để thủy phân các chất béo phức hợp, enzyme phân giải gelatin và fibrin, cùng với một loại enzyme giống lysozyme có tác dụng tiêu diệt một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột như Proteus.
B licheniformis không chỉ giúp ổn định hệ vi khuẩn có lợi trong đường ruột mà còn có khả năng tổng hợp các chất kháng sinh tự nhiên, ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt nhiều vi sinh vật khác, bao gồm cả vi khuẩn gram âm và gram dương, cũng như nấm gây bệnh Nhờ vào những đặc tính này, B licheniformis có khả năng cạnh tranh hiệu quả với các vi khuẩn gây hại khác.
B licheniformis giúp cải thiện trọng lƣợng, chuyển hóa thức ăn và giảm bệnh tiêu chảy, tỷ lệ chết non ở vật nuôi
B licheniformis tiết ra enzyme phân hủy các chất nhƣ carbohydrate, chất béo và đạm thành những đơn vị nhỏ hơn Chúng cũng có khả năng phân hủy các chất hữu cơ, tích lũy trong nền đáy ao nuôi, làm sạch nước B licheniformis có tác dụng làm giảm COD, H 2 S trong ao tôm làm tăng năng suất nuôi
Chế phẩm men vi sinh chứa vi khuẩn Bacillus có khả năng phân hủy nhanh chóng hợp chất hữu cơ, khử mùi hôi và kích thích sự phát triển của vi khuẩn có lợi Điều này giúp cạnh tranh môi trường sống, giảm thiểu số lượng vi khuẩn gây bệnh, đồng thời ổn định môi trường Men vi sinh còn hỗ trợ chuyển hóa các chất hữu cơ như xác động thực vật và cặn bã, góp phần vào quá trình tái chế tự nhiên.
CO 2 và nước, chuyển các chất độc hại như NH 3 , NO 2- thành các chất không độc như
NO 3- , NH 4+ từ đó làm ổn định chất lượng nước ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Ứng dụng
B licheformis xuất hiện trong nhiều lĩnh vực nhƣ nuôi trồng thủy sản là yếu tố giúp cải thiện trọng lƣợng, chuyển hóa thức ăn và giảm bệnh tiêu chảy và tỷ lệ chết non ở vật nuôi [10]
Bacillus licheniformis được nuôi cấy để sản xuất protease cho rửa sinh học, nhờ khả năng phát triển tốt trong môi trường kiềm Protease này có khả năng chịu được độ pH cao, làm cho nó trở thành lựa chọn lý tưởng cho các chất tẩy rửa có độ pH kiềm Với độ pH tối ưu từ 9 đến 10, protease được thêm vào chất tẩy giặt để phân hủy và loại bỏ bụi bẩn từ protein.
Bacillus licheniformis có khả năng tổng hợp ống nano vàng, với các hạt nano vàng có kích thước từ 10 đến 100 nanomet Thông thường, hạt nano vàng được tổng hợp ở nhiệt độ cao, trong dung môi hữu cơ và sử dụng các thuốc thử độc hại, trong khi vi khuẩn này sản xuất chúng trong điều kiện nhẹ nhàng hơn nhiều.
LỰA CHỌN CÔNG NGHỆ
Lựa chọn phương pháp nuôi cấy
Công nghiệp sản xuất enzyme hiện nay trên thế giới áp dụng hai phương pháp nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm
2.1.1 Phương pháp lên men bề mặt
Phương pháp nuôi cấy bề mặt tạo môi trường cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường, có thể là môi trường lỏng hoặc đặc Trong môi trường lỏng, vi sinh vật phát triển trên bề mặt, hình thành ván khuẩn ngăn cách pha lỏng và pha khí, sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch và oxy để tổng hợp enzyme Phương pháp này có ưu điểm hơn so với nuôi cấy chìm nhờ lượng nước thấp, giúp enzyme và sản phẩm ở trạng thái cô đặc, dễ tinh sạch và ít bị giảm hoạt tính Nuôi cấy bề mặt không yêu cầu trang thiết bị phức tạp, chủ yếu sử dụng khay và buồng nuôi với điều kiện nhiệt độ, độ ẩm thích hợp Đặc biệt, vi sinh vật có thể được nuôi trực tiếp trên bề mặt gạo, hạt đậu tương đã nấu chín, hoặc hạt cốc sống để sản xuất tương, men thuốc bắc, và các sản phẩm khác.
Cám mì, cám gạo và ngô mảnh thường được sử dụng kết hợp với trấu làm chất phụ gia Những nguyên liệu này có bề mặt tiếp xúc lớn và độ xốp cao, không chứa các chất gây hại cho sự phát triển của nấm mốc Tỉ lệ các chất phụ gia cần được đảm bảo, với hàm lượng tinh bột trong nguyên liệu không được thấp hơn 20% Ngoài ra, có thể bổ sung nguồn nitơ vô cơ như (NH4)2SO4, (NH4)2CO3, cùng với photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô và nước lọc bã rượu.
2.1.2 Phương pháp lên men bán rắn
Lên men trên môi trường bán rắn là quá trình sinh trưởng của vi sinh vật và hình thành sản phẩm diễn ra trên bề mặt nguyên liệu với lượng nước tự do gần như không có, trong khi cơ chất chứa ẩm dưới dạng hấp phụ Hoạt động của vi sinh vật chủ yếu diễn ra trên bề mặt chất rắn, với sự trao đổi nhiệt và khí trực tiếp giữa pha rắn và pha khí Các phản ứng sinh học và chuyển hóa diễn ra tại nơi tiếp xúc giữa tế bào vi sinh vật và cơ chất Quá trình lên men bán rắn đã được áp dụng từ lâu và hiện nay đang thu hút sự quan tâm mạnh mẽ, được sử dụng để gia tăng giá trị cho các sản phẩm từ nguyên liệu rẻ tiền, phế liệu nông nghiệp và chất thải công nghiệp.
Phương pháp nuôi cấy bề mặt có một số ưu điểm:
Nồng độ enzyme thu nhận cao
Chế phẩm có khả năng sấy khô dễ dàng mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme, giúp bảo quản và vận chuyển thuận lợi Chế phẩm khô có thể được nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp mà không cần qua quá trình tách và làm sạch enzyme.
Không cần các thiết bị phức tạp, quá trình sản xuất ít tốn năng lƣợng
Loại bỏ vi sinh vật tạp nhiễm một cách dễ dàng, không cần giữ môi trường tuyệt đối trong cả quá trình
Có thể thực hiện quy mô gia đình, trang trại cũng nhƣ ở quy mô lớn đến 20 tấn/ngày
Bên cạnh đó phương pháp lên men bề mặt cũng đi kèm với những nhược điểm khác nhƣ:
Mang lại năng suất thấp ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Khó cơ khí hóa, tự động hóa, cần diện tích nuôi lớn, chất lƣợng chế phẩm ở mẻ không đều
Tốn nhiều diện tích của nơi sản xuất
2.1.3 Phương pháp lên men chìm
Nuôi cấy chìm, hay nuôi cấy bề sâu, là phương pháp sử dụng môi trường dịch thể trong các thùng lên men, nơi mà dịch dinh dưỡng được phân tán xung quanh tế bào Đặc điểm nổi bật của phương pháp này là yêu cầu sử dụng thiết bị khuấy và cung cấp oxy liên tục Hiện nay, nuôi cấy chìm đang được áp dụng rộng rãi trong công nghệ vi sinh để sản xuất nhiều sản phẩm như men bánh mì, protein đơn bào, chế phẩm vi sinh, enzyme, acid amin, vitamin, và các chất kháng sinh.
Phương pháp nuôi cấy chìm có một số ưu điểm nổi trôi sau:
Tốn ít mặt bằng trong xây dựng và lắp đặt dây chuyền
Chi phí điện năng, nhân lực và các khoản phụ cho một đơn vị sản phẩm thấp
Dễ tổ chức đƣợc xí nghiệp có sản lƣợng lớn
Các thiết bị lên men chìm có khả năng cơ khí hoá và tự động hoá cao, giúp dễ dàng kiểm soát các yếu tố quan trọng như nhiệt độ và pH trong quá trình nuôi cấy.
Tuy vậy phương pháp này vẫn còn tồn tại một số nhược điểm như: dễ bị nhiễm toàn bộ và chi phí trang thiết bị khá cao
2.1.4 Kết luận lựa chọn phương pháp lên men Để đáp ứng nhu cầu của ngành công nghiệp, chi phí sản xuất thấp đƣợc ƣu tiên hàng đầu để sản xuất một enzyme nhƣ protease kiềm Cả hai hình thức lên men trạng thái rắn (SSF) và lên men chìm (SMF) đều có thể đƣợc sử dụng để sản xuất enzyme ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Page 26 này SSF thì giống qui trình phát triển tự nhiên của vi sinh vật nhƣ ủ chua và ủ phân có thể đƣợc sử dụng một cách có kiểm soát để sản xuất sản phẩm mong muốn Mặc dù vậy, theo truyền thống thì lên men chìm vẫn đƣợc sử dụng nhiều hơn vì dễ xử lý, kiểm soát tốt hơn các yêu tố môi trường như nhiệt độ, pH Môi trường tổng hợp đã được sử dụng để lên men sản xuất amylase thông qua SMF Thành phần của môi trường tổng hợp bao gồm canh trường dinh dưỡng cơ bản và tinh bột hòa tan, những thành phần này rất đắt tiền và đƣợc thay thế bằng các phụ phẩm nông nghiệp giá rẻ hơn để giảm chi phí cho môi trường nuôi cấy nếu áp dụng vào sản xuất ở qui mô lớn
Trong SMF, phương thức nuôi cấy gián đoạn được lựa chọn để nuôi và thu enzyme theo mẻ, vì Bacillus licheniformis phát triển tốt trong môi trường dinh dưỡng cơ bản mà không bị ức chế bởi nồng độ cao Việc sử dụng gián đoạn bổ sung cơ chất ngoài không chỉ dễ bị nhiễm khuẩn mà còn tốn năng lượng và chi phí cho nhân công vận hành, quản lý.
Phương pháp lên men
Công nghệ lên men là phương pháp phát triển tế bào quy mô lớn với hiệu quả cao, đồng thời bao gồm cả quy trình hồi phục sản phẩm.
Trong phương pháp lên men gián đoạn (Batch – Culture), vi sinh vật phát triển cho đến khi một thành phần dinh dưỡng chính bị giới hạn, dẫn đến việc chuyển từ pha lũy thừa sang pha cân bằng Quá trình sinh trưởng này đi kèm với sự thay đổi điều kiện nuôi, giảm chất dinh dưỡng và tăng khối lượng tế bào, đồng thời làm thay đổi trạng thái sinh lý của tế bào Việc tạo ra sản phẩm mong muốn thường liên quan đến một trạng thái sinh lý nhất định trong pha sinh trưởng, nhưng không thể duy trì trạng thái này trong thời gian dài.
Vi sinh vật được nuôi trong bình lên men với thể tích môi trường xác định và phát triển qua các giai đoạn: pha tiềm phát, pha nhân lên chậm, pha logarit, pha cân bằng và pha suy vong Đường cong sinh trưởng của vi sinh vật có thể được vẽ bằng cách phân đôi số logarit của số lượng tế bào sống theo thời gian nuôi cấy Cuối quá trình, các công đoạn cần thiết được thực hiện để thu lấy sản phẩm Phương pháp lên men chu kỳ được ứng dụng để sản xuất nhiều hoạt chất quan trọng như amino acid và các chất kháng sinh.
Hình 5: Đường cong sinh trưởng trong hệ thống kín (Theo sách của Prescott,
Phương pháp nuôi gián đoạn thường được áp dụng cho sự lên men vô trùng do tính dễ dàng về mặt kỹ thuật, tuy nhiên, việc thực hiện theo từng mẻ dẫn đến năng suất thấp và kéo dài chu kỳ sản xuất.
Nguyên liệu liên tục đi vào và đồng thời sản phẩm lên men liên tục đi ra
Lên men liên tục là quá trình nuôi cấy vi sinh vật trong thiết bị đặc biệt, nhằm tối ưu hóa sự phát triển của chúng đến giai đoạn thích hợp để thu hoạch.
Page 28 một thể tích môi trường lên men cùng tế bào và các sản phẩm trao đổi chất của chúng, lại bổ sung đúng một thể tích môi trường dinh dưỡng mới vào bình nuôi cấy, lúc đó ta có đƣợc trạng thái cân bằng động Vi sinh vật trong bình nuôi luôn luôn ở pha logarit Các phương pháp nuôi cấy liên tục là:
Phương pháp đơn cấp là kỹ thuật nuôi vi sinh vật trong nồi lên men, trong đó môi trường dinh dưỡng được bổ sung và môi trường đã lên men được rút ra liên tục với tốc độ đồng nhất Phương pháp này đơn giản và dễ áp dụng trong sản xuất, đặc biệt cho tế bào nấm men, nhằm thu được sinh khối hoặc các sản phẩm chuyển hóa liên quan trực tiếp đến sự phát triển của tế bào.
Phương pháp nhiều cấp trong nuôi cấy vi sinh vật sử dụng hệ thống nồi lên men với nhiều cấp độ Nồi đầu tiên được thiết kế để tạo điều kiện tối ưu cho sự phát triển của vi sinh vật, trong khi các nồi tiếp theo cho phép tế bào tiết ra các chất chuyển hoá Môi trường dinh dưỡng được bổ sung vào nồi đầu tiên và sau đó tuần tự chuyển sang các nồi tiếp theo, tối ưu hóa quá trình sản xuất.
Hệ thống được điều khiển liên tục bởi các yếu tố hóa học chemostas, và khi chuyển đổi trạng thái, trạng thái cân bằng mới sẽ đạt được sau một thời gian Việc tăng tốc độ dòng vào giúp tăng cường sinh trưởng gần đạt tốc độ cực đại Trong phạm vi tốc độ pha loãng tiêu chuẩn, tốc độ pha loãng (D) và tốc độ sinh trưởng (μ) là bằng nhau.
Phương pháp lên men liên tục có vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp, được sử dụng để sản xuất protein đơn bào, acid acetic, ethanol và xử lý nước thải tại một số nhà máy Mặc dù có nhiều lợi ích, phương pháp lên men chu kỳ vẫn thường được áp dụng hơn do một số nguyên nhân nhất định Các ưu điểm của phương pháp nuôi cấy liên tục bao gồm khả năng duy trì môi trường ổn định, tăng năng suất sản xuất và giảm thời gian chu kỳ sản xuất.
Giảm bớt thời gian làm vệ sinh thiết bị, khử khuẩn và làm nguội, thể tích của toàn bộ thiết bị
Lao động dễ dàng và có khả năng tự động hóa các thao tác ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Tăng hiệu suất của toàn bộ quá trình công nghệ nhờ chọn lọc tốt nhất các điều kiện thao tác
Đòi hỏi cán bộ và công nhận thành thạo chuyên môn
Để hoạt động hiệu quả, cần phải cung cấp đầy đủ các dạng năng lượng cần thiết, trong khi chi phí cho tự động hóa và thiết bị đo lường hiện đại thường rất cao.
Trong quá trình nuôi cấy tế bào vi sinh vật có thể có những đột biến bất ngờ xảy ra làm hỏng cả quá trình
Phải vô trùng tuyệt đối trong toàn bộ thao tác
2.2.3 Kết luận lựa chọn phương pháp nuôi cấy
Hiện nay, nuôi cấy liên tục được áp dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp để sản xuất sinh khối và sản phẩm lên men Trong khi đó, quá trình sản xuất các chất trao đổi bậc một, bậc hai và enzyme thường diễn ra theo phương pháp không liên tục.
Dựa vào các đặc điểm của vi sinh vật và điều kiện nuôi cấy để thu nhận enzyme cần thời gian trong 48h nên ta chọn
Phương pháp nuôi cấy gián đoạn
Dễ thực hiện ở quy mô công nghiệp
Tiết kiệm chi phí cho đầu tƣ thiết bị
Hạn chế nhiễm ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME PROTEASE
Sơ đồ sản xuất 303.2 Thuyết minh quy trình
Để thu nhận enzyme từ vi sinh vật, việc nuôi cấy cần tuân thủ các kỹ thuật chung và thao tác kỹ thuật riêng biệt.
Kỹ thuật tạo giống và thu nhận giống
Lựa chọn phương pháp nuôi cấy phù hợp với chủng vi khuẩn và enzyme mà ta tiến hành nghiên cứu
Thiết kế thiết bị nuôi cấy phù hợp với sản lƣợng va năng suất muốn thu nhận
Tách, tinh chế thu nhận enzyme (enzyme protease)
Dựa trên các nguyên tắc kỹ thuật và bảng phân loại khả năng tổng hợp enzyme protease của Đặng Thị Thu, có thể nhận thấy rằng chủng vi khuẩn này có tiềm năng đáng kể trong việc sản xuất enzyme protease Việc nghiên cứu và ứng dụng các chủng vi khuẩn này sẽ mở ra nhiều cơ hội trong lĩnh vực công nghiệp và sinh học.
Bacillus cheniformis is a microorganism known for its production of neutral protease Our team has developed an optimal diagram for the extraction process of protease enzyme from the Bacillus cheniformis strain This work is part of the Technical Project on Biological Processes 2019.
Hình 6: Sơ đồ thu nhận enzyme protease từ chủng Baccilus licheniformis
Ly tâm Nhân giống cấp 1
Nhân giống cấp 2 Lọc màng
Mantodextrin Nước ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
3.2.1 Quy trình nuôi cấy chủng Bacillus licheniformis để thu nhận enzyme protease
Hình 7: Quy trình nuôi B lichenifomis để sinh tổng hợp protease
CaCl 2 : 0,2% Đệm Na2HPO 4 – KH 2 PO 4 pH = 7,5
Lactose: 0,5% Đệm Na2HPO 4 – KH 2 PO 4 pH = 7,5 Dịch nuôi chứa enzyme
30 – 42h ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Chủng Bacillus licheniformis – ATCC 14580 là vi sinh vật thuần chủng theo tiêu chuẩn quốc tế, được cung cấp bởi công ty Vicomtec, chuyên cung cấp các chủng vi sinh ATCC Sản phẩm từ hãng Microbiologics, Mỹ, phục vụ cho các thí nghiệm quản lý chất lượng Ngoài ra, các chủng này cũng có thể được cung cấp bởi Viện Vi Sinh Vật và Công Nghệ Sinh Học (IMBT) thuộc Đại học Quốc Gia Hà Nội.
Hoạt hóa chủng giống Bacillus licheniformis trong môi trường LB-Agar trong vòng 24h ở 37 o C
Mục đích công nghệ: Chuẩn bị cho quá trình cấy giống, thu nhận bào tử vi sinh vật chuẩn bị cho quá trình nuôi cấy thu nhận enzyme glucoamylase
Mục đích của việc nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis là để tổng hợp một lượng lớn enzyme protease trong quá trình lên men.
3.2.2 Quy trình thu nhận enzyme protease
Mục đích của nghiên cứu là tối ưu hóa điều kiện cho Bacillus licheniformis phát triển và tổng hợp enzyme protease Quá trình nuôi cấy được thực hiện trong môi trường lỏng, sử dụng phương pháp lên men chìm và nuôi cấy gián đoạn theo mẻ, với nhiệt độ 37°C trong 72 giờ và pH 7 ± 0,2.
Có tính liên tục tiết kiệm đƣợc diện tích sản xuất
Dễ cơ giới hóa, tự động hóa năng xuất cao
Sử dụng triệt để các chất dinh dưỡng của môi trường
Enzyme thu dƣợc ít lẫn tạp chất
Nồng độ enzyme trong canh trường thấp nên phải cô đặc giá thành cao
Tốn nhiều điện năng do sục khí liên tục
Dễ bị nhiễn trùng toàn bộ đòi hỏi vô trùng gần nhƣ tuyệt đối
Thiết bị lên men nuôi cấy vi sinh vật trong điều kiện tiệt trùng
Nuôi cấy vi sinh vật chủ yếu diễn ra trong điều kiện tiệt trùng, đảm bảo bằng cách tiệt trùng thiết bị lên men, ống dẫn, cảm biến và dụng cụ Môi trường dinh dưỡng và giống cấy cũng phải được tiệt trùng trước khi đưa vào thiết bị Không khí và chất khử bọt cũng cần được tiệt trùng để duy trì môi trường nuôi cấy an toàn Trong quá trình nuôi cấy chìm, nồi lên men được làm sạch và khử trùng trước khi nạp môi trường mới, nhằm ngăn ngừa nhiễm khuẩn Thiết bị sục khí và khuấy trong nồi lên men giúp phân phối đồng đều không khí, môi trường dinh dưỡng và tế bào vi sinh vật.
Hình 8: Sơ đồ dây chuyền công nghệ nuôi cấy vi sinh vật bằng phương pháp nuôi chìm
1: Thùng chuẩn bị - thanh trùng môi trường
3: Thiết bị trao đổi nhiệt
7: Phân ly dầu nước 8: Thùng chứa khí 9: Tổng lọc
10: Lọc riêng cho từng thùng nhân giống
11: Lọc riêng cho thùng lên men 12: Bơm đẩy
13: Thùng chứa dịch môi trường
Mục đích: tách riêng enzyme và tủa protein, loại bỏ cặn tửa và thu nhận dịch chứa enzyme protease ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Protease dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao nên dùng phương pháp ly tâm lạnh quá trình ly tâm tiến hành ở điều kiện nhiệt độ thấp (10 5 ): N P = 5,0
Khối lƣợng riêng: Độ nhớt canh trường: (Pa.s) (S.S Mabrouk, 1999)
N P : chuẩn số công suất (power number)
Kiểm soát nồng độ oxy
Tốc độ truyền oxy: OTR = k La (C* OL – C OL )
Xác định C* OL ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
C* OL phụ thuộc vào nhiệt độ, áp suất và thành phần môi trường Ta có thể xác định C* OL từ định luật Henrry theo công thức: = P o x H o Trong đó:
Khí trời được sử dụng với áp suất 1 atm, trong đó tỉ lệ oxy chiếm 21% Do đó, áp suất riêng phần của oxy trong khí quyển là 0.21 atm.
Quá trình lên men đƣợc duy trì ở 30 o C tại áp suất 1 atm thì hàm lƣợng oxy hòa tan:
H o = 26.1 (ml/L) (Bảng Độ hòa tan của oxy trong nước theo nhiệt độ vá áp suất - Sổ tay QT&TB)
Cùng 1mol oxy thì ta có V = 22.4(L) và m = 32 (g) Từ đó ta có hệ số chuyển đổi từ ml sang mg là: 1 ml =
H o = 26.1 x 1.4 = 36.54 (mg/L) Nồng độ oxy bão hòa:
) 0,04 0.2 = 0,176 (s -1 ) Chọn C OL = 50% × C* OL => C OL = 0.5 x 7,67 = 3,835 (mg/L)
Tốc độ truyền khối oxy:
= 0.176 × (7.67 – 3,835) ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
= 0,674 (mg.L -1 s -1 ) = 2,43(g.L -1 h -1 ) Công thức tính tốc độ sử dụng oxy: OUR = × X
Trong đó: μ: tốc độ tăng trưởng riêng (h -1 ) y o : năng suất sinh khối tạo ra bởi 1 mol oxy (g sinh khối/ mol oxy)
Với μ = 0.12 h-1 (Hanjing Huang, 2004) đối với Bacillus licheniformis trong nuôi cấy thu nhận enzyme protease
Theo Lê Văn Hoàng, 2007 thì ta có yo= 0.260 mol oxy / g sinh khối
Tốc độ sử dụng oxy riêng:
Ta thấy: OTR = 2,43 > OUR = 0,025 vì vậy hệ thống cấp khí là phù hợp cho hoạt động lên men
Qúa trình ly tâm
Thể tích cần ly tâm là V= 562,94 m 3
Thời gian ly tâm thích hợp để loại bỏ sinh khối thu Enzyme Proteae là t = 5-7h ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Năng suất của quá trình ly tâm Q 1 :
Để đạt công suất 200 tấn/năm trong quá trình phân tách vi sinh vật, thiết bị ly tâm loại đĩa là lựa chọn tối ưu Với tính chất và đặc tính vượt trội, máy ly tâm dạng đĩa cung cấp mức độ phân ly cao, rất phù hợp cho việc xử lý kích thước của Bacillus licheniformis.
Hình 13: Thiết bị ly tâm dạng đĩa Đặc điểm Thông số
Năng suất 10m 3 /h Đường kính đĩa 450-1000 mm
Công suất mô tơ 18.5 kW ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Khối lƣợng máy phân ly 1 000 kg
Bảng 5.2: Thông số kỹ thuật của thiết bị ly tâm
Với các thông số của máy li tâm dạng đĩa là: n = 85 đĩa r 0 = 1 m r i = 0,45 m
Rpm cần thực hiện để loại tủa là 4500 vòng/ phút
𝜃 - góc nghiêng tạo nên con đĩa (chọn 𝜃 = 45 độ) r 0 và ri - bán kính ngoài và bán kính trong của đĩa
Để đạt năng suất 10m³/h, cần lựa chọn 10 thiết bị ly tâm dạng đĩa.
Qúa trình lọc
Bảng 5.3: Thông số của quá trình lọc
Bezawada, J., Yan, S., John, R P., Tyagi, R D., & Surampalli, R Y
Kích thước enzyme protease 20-30KDa
Bezawada, J., Yan, S., John, R P., Tyagi, R D., & Surampalli, R Y
Kích thước lỗ lọc 10KDa
Chọn màng lọc 10kDa của hãng SynderFiltration để phù hợp với yêu cầu là cô đặc dịch enzyme protease
Vận tốc dịch lọc qua màng
Bezawada, J., Yan, S., John, R P., Tyagi, R D., & Surampalli, R Y
Thời gian lọc T=5h ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
- Khối lƣợng phân tử của protease vào khoảng 20-30kDa (Bezawada, J., Yan, S., John, R P., Tyagi, R D., & Surampalli, R Y 2011)
- Nồng độ enzyme đầu vào:
- Thể tích dòng dung dịch đƣa vào quá trình lọc là: V f = 467,24 (m 3 /năm)
Chọn quá trình lọc gián đoạn, ta có:
Cf: Nồng độ dòng dung dịch đi vào hệ thống
Vf: Thể tích dòng dung dịch đi vào hệ thống
Cr: Nồng độ dịch không qua màng lọc
Vr: Thể tích không đi qua màng lọc
Cp: Nồng độ trong dịch lọc
Vp: Thể tích dịch lọc
Hiệu suất quá trình là:
=> C r V r = 456361,72 (kg) ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Ta có, hệ số tách loại của màng lọc là : R= 99%
Tương tự, ta tính được C p = 0.01C r => C p = 182,065 ( kg/m 3 )
Có J v = 0.714 m 3 /h/m 2 (Bezawada, J., Yan, S., John, R P., Tyagi, R D., & Surampalli, R Y 2011)
(m 2 ) Chọn màng lọc 10kDa của hãng SynderFiltration để phù hợp với yêu cầu là cô đặc dịch ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Để chọn loại màng lọc phù hợp với lưu lượng dòng đã tính toán là 88,468 m³/h, cần lựa chọn màng lọc có đường kính ống 10” và lưu lượng lọc đạt 88,468 m³/h Diện tích màng lọc tương ứng là 326 ft², tương đương khoảng 30,28 m² (1 ft² = 0,2 m²).
= 4,1( thiết bị) Suy ra cần 5 ống lọc
Kết luận: Đối với quá trình lọc màng để cô đặc Protease từ vi khuẩn Bacillus licheniformis sau khi ly tâm loại bỏ sinh khối ta lựa chọn:
• Thiết bị siêu lọc có màng lọc màng lọc 10kDa Màng lọc UF KOCH – USA
• Thể tích cần lọc 467,24 m 3 /năm
• Vận tốc dịch lọc qua màng: J v = 714 (L/h/m 2 )
• Lưu lượng dòng sau lọc Qp = 88,468 m 3 /h
Sấy
Khối lƣợng đƣa vào quá trình sấy (1 mẻ): m sấy =
= 4267 (kg) với nồng độ chất khô là 40%
Quá trình sấy phun có bổ sung maltodextrin 1% cung cấp sự ổn định tốt nhất trong suốt thời gian sấy (Alya Sellami-Kamoun và cs, 2008)
Lƣợng ẩm bay hơi khỏi vật liệu: ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Chọn độ ẩm vật liệu trước khi sấy: x 1 = 55%
Độ ẩm vật liệu sau khi sấy: x 2 = 5%
Nhiệt độ tác nhân sấy đầu vào t 1 = 120 ± 2°C, nhiệt độ tác nhân sấy đầu ra t 2 = 84 ± 2°C (Alya Sellami-Kamoun, et al., 2008)
Tính toán lựa chọn thiết bị sấy Đặt các ký hiệu:
L 1 – lƣợng vật liệu đi vào máy sấy, kg hay kg/h
L 2 – lƣợng vật liệu ra khỏi máy sấy, kg hay kg/h x 1, x 2 – độ ẩm của vật liệu trước và sau khi sấy
W – lƣợng ẩm cần tách trong quá trình sấy, kg
Phương trình cân bằng vật liệu chung:
Lượng vật liệu trước khi sấy: L 1 = m sấy = 4267 (kg)
Lƣợng ẩm cần tách ra khỏi vật liệu:
Thời gian lên men cho 1 mẻ là 48h (2 ngày) nên ta cho thời gian sấy tối đa là 1 ngày (trừ thời gian máy móc nghỉ) t sấy = 1 (ngày) = 24 (h)
Công suất bốc ẩm: W’ = ∆Wt =
Để đáp ứng nhu cầu sản xuất, cần lựa chọn thiết bị sấy phun ly tâm tốc độ cao LPG với khả năng bốc hơi 150 kg/h.
Với thiết bị sấy phun ly tâm tốc độ cao LPG thì ta có:
Lượng hơi nước bốc hơi 103 kg/h
Thời gian cho quá trình sấy: t sấy =
= 24 (h) Chọn nhiệt độ không khí trước khi vào Calorife là t 0 = 35 o C và φo = 80% (theo đều kiện nhiệt độ và hàm ẩm ở Tp HCM)
Từ t 0 = 35 o C và φ o = 80% tra giảng đồ Ramzim ta đƣợc kết quả nhƣ sau: d 0 = 0,029 kg ẩm/kg không khí khô
Enthalpy của hỗn hợp không khí ẩm trước khi vào caloriphe là:
H 0 = d o Trong đó: c k = 1: nhiệt dung riêng của không khí khô, kJ/kg o C r o = 2493: enthapy của hơi nước ở 0 o C, kJ/kg ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
C h = 1,97: nhiệt dung riêng của hơi nước, kJ/kg o C
=> H o = 35 + (2493 + 1.97 35) 0.029= 109,3 (kJ/kg không khí khô)
Enthalpy của hỗn hợp không khí trước khi vào buồng sấy t 1 = 120 o C (d o = d 1 )
= 1 120 + (2493 + 1.97 120) 0.029= 199.15 (kJ/kg không khí khô)
Vì trong suốt quá trình sấy enthalpy của không khí không đổi nên:
H 1 = H 2 = 199,15 (kJ/kg không khí khô)
Với H 2 enthapy của không khí sau khi sấy
Dựa vào công thức tính enthalpy ở nhiệt độ t 2 = 84 o C ta có:
=> Hàm ẩm của không khí sau khi ra khỏi phòng sấy: d 2 =
= 0.0433 (kg ẩm/kg không khí khô)
Lƣợng không khí khô cần để bốc hơi 1kg ẩm (không khí tiêu hao riêng) là: g = = 69,86 (kg không khí khô/ kg ẩm bay hơi)
Lƣợng không khí khô cần cho quá trình sấy:
Nhiệt lƣợng riêng tiêu tốn cho quá trình sấy: q s =
Công suất tiêu thụ của quá trình sấy: ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
THIẾT KẾ THIẾT BỊ SẤY
Giả sử ta chọn thời gian lưu của khí là 20 giây và mật độ dòng khí ra là 0,89 kg/m 3 Kích thước thiết bị
Lƣợng không khí tiêu hao trong quá trình sấy: G = 7202,8 (kg KKK/h)
Thể tích không khí vào và ra khỏi thiết bị sấy:
Trong đó ta có ρ 1 , ρ 2 là khối lƣợng riêng của không khí ở nhiệt độ t 1 , t 2 t 1 = 84°C => ρ 1 = 0,898 (kg/m 3 ) t 2 = 120°C => ρ 2 = 0,986 (kg/m 3 )
Lưu lượng không khí khô chuyển động trong tháp sấy phun:
Lưu lượng không khí thực chuyển động trong tháp sấy bao gồm lượng không khí khô và lƣợng hơi ẩm bốc hơi từ vật liệu sấy: ρh=1,296
Trong đó: W: lƣợng ẩm bay hơi (kg/h) τ: thời gian lưu trong buồng sấy (h), t = 20 (s) = (h) = 5,55×10 -3 (h) Thể tích thân thiết bị: V ttb = ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Thể tích khối nón đáy thiết bị: V kn =
Chọn h 1 = 1,5D ta có tổng thể tích thiết bị là:
53,16 = 1,5 × D 3 => D = 3,28 (m) Vậy đường kính buồng sấy là 3,28 (m)
Chiều cao của buồng tỉ lệ gấp 1,5 lần so với đường kính của thiết bị nên ta chọn chiều cao của buồng sấy là: h 1 = 1,5 × 3,28 = 4,93 (m) h 2 = = √ = 2,84 (m)
=> Chiều cao thiết bị là : htb = h 1 + h 2 = 4,93 + 2,84 = 7,77 (m) Đế đáp ứng nhu cầu sản xuất, nhóm chọn thiết bị sấy phun LPG – 150: Đặc điểm LPG – 150
Lượng bốc hơi nước kg/h 150
Hình thức phun Phun sương mù li tâm tốc độ cao
Tốc độ v ng quay đĩa phun v ng/ph t 1800 ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Page 68 Đường kính đĩa phun rmp 180 – 210
Công suất gia nhiệt điện k 99
Kích thước máy đường kính chiều cao m 3,28 7,77
Bảng 5.4: Thông số của thiết bị sấy phun LPG - 150 ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
TÍNH TOÁN KINH TẾ
Vốn cố định
6.1.1 Chi phí nhà đất và xây dựng
Thuê 12 000 m 2 đất ở huyện Dĩ An, tỉnh Bình Dương, chi phí thuê đất: 45 USD/ 50 năm/m 2
Chi phí thuê đất: 45 x 22 727 x 12 000 = 12 272 580 000 VNĐ
- Xây dựng nhà máy khoảng 10 ha với chi phí: Đơn giá: 1 500 000 VNĐ/m 2
Bảng 6.1: Chi phí xây dựng
STT Tên công trình Số lƣợng
Diện tích (m 2 ) Chi phí xây dựng VNĐ
4 Tầng hầm, nhà ăn, nhà nghỉ cho nhân viên, nhà hành chính, hội trường, văn phòng
5 Nhà vệ sinh có 3 phòng 3 24 108.000.000
6 Phòng thay đồ bảo hộ 4 12,25 73.000.000
9 Đường nội bộ, cây xanh, sân vườn, hòn nam bộ
10 Trạm biến áp, nhà phát điện
1 30 45.000.000 ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Tổng tiền thuê đất và xây dựng công trình :
Bảng 6.2: Chi phí thiết bị
Sấy LPG – 150 32.000 1 32.000 Đóng gói KSFY – C60F 4.200 1 4.200
- Tổng vốn cố định thiết bị:
- Tổng vốn cố định = Vốn đầu tƣ xây dựng + Vốn cố định thiết bị ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Chi phí sản xuất trực tiếp
1 năm công nhân làm việc 11 tháng + 1 tháng tiền thưởng
Bảng 6.3: Chi phí nhân công
STT Giai đoạn Số người
Tổng cộng 37 188 800 000 2 265 600 000 ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Bảng 6.4: Chi phí nguyên liệu cho 1 năm sản xuất
STT Danh mục Đơn giá
Khối lƣợng/năm Đơn vị
Bảng 6.5: Chi phí điện nước cho 1 năm nuôi cấy
STT Dang mục Đơn vị Đơn giá
- Tổng chi phí sản xuất trực tiếp trong 1 năm = chi phí nhân công + chi phí nguyên liệu + chi phí diện nước
Chi phí sản xuất gián tiếp
- Chi phí bảo dƣỡng máy móc thiết bị bằng 10% x vốn thiết bị
= 10% x 14 280 503 632 = 1 428 050 363 VNĐ ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
- Chi phí sơn sửa công trình xây dựng bằng 8% x vốn xây dựng
- Tổng chi phí bảo trì:
- Bảo hiểm lao động: 23% lương nhân viên/năm
- Bảo hiểm y tế: 3% lương nhân viên/ năm
6.3.3 Chi phí bên ngoài nhà máy:
- Chi phí quảng cáo marketing chương trình đặc biệt: 7% chi phí sản xuất trực tiếp
- Chi phí vận chuyển: 5% chi phí sản xuất trực tiếp
- Chi phí kiểm tra chất lƣợng sản phẩm: 1% chi phí sản xuất trực tiếp
- Chi phí hoa hồng cho các đại lý: 15% chi phí sản xuất trực tiếp
- Chi phí xử lý môi trường: 3% chi phí trực tiếp
Tổng chi phí bên ngoài nhà máy:
280 = 4 509 748 560 VNĐ ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
- Tổng chi phí gián tiếp:
- Tổng chi phí sản xuất sinh khối B Licheniformis trong 1 năm (Vốn lưu động) = Chi phí trực tiếp + chi phí gián tiếp
Vốn đầu tƣ
- Tổng vốn đầu tư = Vốn cố định + vốn lưu động
Lãi và doanh thu
- Giả sử tiền đầu tƣ là 100% vay vốn ngân hàng 1 năm
- Theo lãi suất ngân hàng VP Bank trung bình hiện nay 7%/năm
Lãi vốn vay đầu tƣ:
Tổng chi phí hằng năm = Vốn lưu động + khấu hao hằng năm + lãi suất hằng năm
- Xác định mức lợi nhuận là 25% vốn đầu tƣ cho 1 kg enzyme, ta có giá bán 1 kg sản phẩm ra thị trường:
- Căn cứ vào giá enzyme trên thị trường công ty quyết định chọn giá sản phẩm trên thị trường là 340 000 VNĐ
Lợi nhuận và dòng tiền
- Lợi nhuận trước thuế: LNTT = Doanh thu – chi phí sản xuất ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
- Khấu hao: 10% vốn cố định
- Thuế thu nhập doanh nghiệp: 21% lợi nhuận trước thuế
- Lợi nhuận sau thuế = Lợi nhuận trước thuế - Thuế doanh nghiệp
- Dòng tiến (CF) = lợi nhuận sau thuế + khấu hao
- Lợi nhuận ròng = lợi nhuận sau thuế - thuế thu nhập doanh nghiệp
- Thời gian hoàn vốn = năm Vậy thời gian hoàn vốn của dự án này là: 1 năm 4 tháng
Bảng 6.6: Thống kê chi phí đầu tƣ
Danh mục Thành tiền VNĐ
Tổng chi phí đầu tƣ 67 402 623 682
Bảng 6.7: Thống kê lợi nhuận dự án ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Lợi nhuận Thành tiền VNĐ
Thuế thu nhập doanh nghiệp (21%) 7 265 449 027
Gía trị hiện tại thuần
CF O : Là tiền đầu tƣ ban đầu (vốn cố định)
: là tổng giá trị hiện tại của dòng tiền trong dự án
: là tuổi thọ dự án
: là hệ số chiết khấu
Giả sử vòng đời 10 năm ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
Bảng 6.8: Bảng tính giá trị hiện tại dự án
(n) CF n Hệ số chiết khấu chọn 7% Giá trị hiện tại Hiện tại 67 02 623 682 1 -67 402 623 682
- Để tránh sai số do 1 + r nên sử dụng excel tính NPV
NPV = 73 535 900 000 VNĐ > 0; do đó ta chấp nhận dự án
Tỷ suất nội tại (IRR)
- Tỷ suất hoàn vốn nội bộ là lãi suất chiết khẩu mà tại đó NPV của dự án bằng
- phần mềm Exel tính IRR ta đƣợc IRR = 19% > 7% dự án khả thi ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
RỦI RO KINH TẾ
Rủi ro khi giá biến động
Bảng 7.1: Rủi ro khi giá biến động
- Nhận xét: Khi giá trị trường biến động, giá trị IRR thay đổi nhưng vẫn lớn hơn 7%
Dự án trong những trường hợp này có thể thực hiện được
Rủi ro do sản phẩm tồn kho
- Gỉa sử 1 năm lƣợng sản phẩm tồn kho là 1%
- Lƣợng sản phẩm tồn kho trong 1 năm là: ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
- Chi phí tổn thất do sản phẩm tồn kho là:
Tổn thất do sản phẩm không đạt chất lƣợng
Giả sử tỷ lệ sản phẩm không đạt chất lƣợng là 0,1%
- Lƣợng sản phẩm không đạt chất lƣợng là:
- Chi phí tổn thất cho sản phẩm không đạt chất lƣợng là:
Tổng tổn thất chi phí do sản phẩm biến động và tồn kho trong 1 năm
1 020 000 000 + 102 000 000 = 1 122 000 000 VNĐ ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC 2019
