THIẾT KẾ QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYMEɑ AMYLASE TỪBACILLUS SUBTILLIS VỚI NĂNG SUẤT 200TẤNNĂMMỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1 1 1 Sơ lược về emzyme ɑ Amylase 1 1 1 1 Khái niệm 1 1 1 2 Phân loại, danh pháp 2 1 1 3 Cấu trúc phân tử 2 1 1 4 Tính chất α amylase 2 1 1 5 Cơ chế xú. Nƣớc ta là nƣớc có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, rất thuận lợi cho sự pháttriển của vi sinh vật. Đó là lợi thế giúp cho ngành công nghiệp sản xuất enzymepháttriển mạnh mẽ. Chế phẩm enzyme amylase của nấm mốc có vai trò đặcbiệt quan trọng đối với rƣợu cồn, thực phẩm lên men, công nghiệp dệt, sản xuấtthức ăn gia súc và cả trong y học.Để đáp ứng nhu cầu sử dụng enzyme ngày càng cao với quy mô côngnghiệp, các nhà máy công suất lớn ra đời để sản xuất lƣợng enzyme cần thiếtcho thị trƣờng. Từ đó đƣa đến vấn đề tính toán thiết kế các thiết bị, quy mô, sảnlƣợng lợi nhuận cũng nhƣ những rủi ro có thể xảy ra đối với hệ thống nhà máysản xuất. Xuất phát từ nhƣ cầu và tính ứng dụng rộng rãi của enzyme lipase, đềtài “Thiết kế quy trình sản xuất enzyme ɑ amylase từ Bacillus subtillis vớinăng xuất 200 tấnnăm”.
TỔNG QUAN
Sơ lƣợc về emzyme ɑ-Amylase
1.1.1 Khái niệm α-amylase là enzyme xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4-glucoside nằm bên trong phân tử tinh bột và glycogen Là một enzyme kim loại Nếu không có sự hiện diện của ion Canxi trong phân tử enzyme sẽ không hoạt động đƣợc α-amylase phân cắt cacbonhydrate chuỗi dài tạo maltotriose và maltose từ amylose hay tạo maltose, glucose và dextrin từ amylopectin Do có thể hoạt động ở bất kỳ vị trí α-1,4 nào trên cơ chất nên hoạt động phân cắt của α-amylase nhanh hơn β-amylase Ở động vật, α-amylase làenzyme tiêu hóa chính
Hình 1.2 Công thức của enzyme ɑ- amylase
1.1.2 Phân loại, danh pháp α-amylase (1,4-α-D-glucan glucanhydrolase) thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), họ 13 (GH 13), mã số EC 3.2.1.1
Xúc tác phản ứng nội thủy phân liên kết 1,4-α-D-glucosidic trong chuỗi đường đa có chứa 3 hoặc nhiều hơn những đơn vị D-glucose liên kết với nhau ở vị trí α-1,4
Tên khác: glycogenase; endoamylase; Taka-amylase A
Tên hệ thống: 1,4-α-D-glucan glucanhydrolase
Gồm 3 tiểu đơn vị A, B, C A là tiểu đơn vị lõi có cấu trúc đặc trƣng helix (α/β)8 – barrel, đƣợc nối với tiểu đơn vịC (C-terminal) có cấu trúc 8 đoạn β– sheet song song Tiểu đơn vị B gồm 2 đoạn β – sheet đƣợc lồng vào giữa đoạn β–sheet thứ ba và đoạn β – helix thứ hai của tiểu đơn vị A Tiểu đơn vị B quyết định độ bền và liên kết enzyme và cơ chất Một ion Canxi nối giữa hai tiểu đơn vị A và B
Tùy thuộc vào loại enzyme, có thể có các tiểu đơn vị gắn vào đầu C hoặc đầu N của phân tử protein Trung tâm hoạt động của α-amylase bao gồm nhóm –COOH và -NH2.
Khối lượng phân tử α-amylase ở các loài Bacillus có sự khác biệt, với α-amylase vi khuẩn công nghiệp chủ yếu được sản xuất từ B subtilis var amyloliquefaciens và var Amylosacchariticus có trọng lượng phân tử lần lượt là 49.000 dalton (Da) và 60.000 Da Khi có mặt Zn, enzyme này sẽ liên kết và tạo thành dạng dimer với trọng lượng phân tử 100.000 Da Mặc dù α-amylase không chứa co-enzyme, nhưng nó vẫn cần một nguyên tử gam để hoạt động hiệu quả.
Ca 2+ cho 1 mol enzyme để ổn định cấu trúc và ngăn không cho protease phân hủy enzyme
α-amylase có khả năng dextrin hóa cao, làm biến đổi nhanh chóng phản ứng màu của tinh bột với iod, dẫn đến giảm nhanh độ nhớt của hồ tinh bột, vì vậy nó được gọi là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa Enzyme này dễ tan trong nước, dung dịch muối, dung dịch đệm và rượu loãng, hoạt động mà không cần chất hoạt hóa, nhưng cần canxi như đồng yếu tố để xúc tác sự thủy phân tinh bột Canxi giúp ổn định α-amylase trong quá trình thủy phân bằng nhiệt hoặc kiềm, tăng độ bền của enzyme trước các tác nhân gây biến tính và protease pH tối ưu của α-amylase vi khuẩn nằm trong khoảng 6,0 – 7,0, nhưng enzyme này bị bất hoạt nhanh ở pH thấp 4,5 – 4,7 và khi có mặt các tác nhân tạo phức với canxi như EDTA, polyphosphate, oxalate, chlorine tự do và các chất oxy hóa α-amylase từ vi khuẩn thường bền nhiệt hơn so với các loại enzyme từ vi sinh vật khác và cây trồng, vẫn hoạt động hiệu quả ở nhiệt độ mà α-amylase của nấm mốc và ngũ cốc bị bất hoạt.
Nhiệt độ tối ưu cho α-amylase của Bacillus subtilis có thể đạt từ 70 đến 80 o C, trong khi các loại α-amylase khác có nhiệt độ tối ưu từ 54 đến 63 o C (Hopek, 2006) Mỗi loại α-amylase có cấu trúc amino acid khác nhau, tạo thành từ tổ hợp amino acid đặc trưng riêng Tuy nhiên, hàm lượng tryptophan và tyrosine thường chiếm ưu thế trong thành phần amino acid của chúng.
Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng 1/4 tổng lƣợng amino acid cấu thành phân tử enzyme
Phản ứng thủy phân tinh bột bởi α-amylase diễn ra qua hai giai đoạn chính Giai đoạn đầu, gọi là giai đoạn dịch hóa, chỉ làm đứt một số liên kết trong phân tử tinh bột, dẫn đến việc giảm nhanh độ nhớt của hồ tinh bột Giai đoạn tiếp theo là thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa được tạo thành, giúp chuyển hóa tinh bột thành maltose
Bảng 1.1 Enzyme từ một số loại vi sinh vật
Nhiệt độ tối ƣu pH tối ƣu
Enzyme là một trong những yếu tố quan trọng hiện nay, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, dược phẩm, công nghiệp dệt và chăn nuôi Trong ngành công nghiệp thực phẩm, enzyme đóng vai trò thiết yếu trong việc cải thiện chất lượng sản phẩm và tăng cường quy trình chế biến.
- Sản xuất rượu, bia, nước trái cây
Sản xuất bánh và bánh mì thường gặp hạn chế về hàm lượng amylase tự nhiên trong tinh bột ngũ cốc Việc bổ sung α-amylase giúp cải thiện chất lượng sản phẩm, tăng độ nở xốp và hương vị của bánh, từ đó nâng cao trải nghiệm người tiêu dùng.
Chế biến tinh bột và sản xuất các loại đường như maltose, syroglucose và syro fructose đóng vai trò quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp Dịch giàu glucose được ứng dụng trong sản xuất bột ngọt, ngành lên men, nước trái cây và mứt Glucose tinh thể không chỉ được sử dụng trong y tế mà còn trong khẩu phần dinh dưỡng cho bệnh nhân và sản xuất dịch truyền Ngoài ra, syro fructose được sử dụng rộng rãi trong sản xuất đồ uống ít năng lượng, bánh kẹo, nước quả và sản phẩm sữa.
Trong ngành công nghiệp dệt, quá trình làm mềm vải là rất quan trọng Giai đoạn hồ hóa giúp tăng cường độ chắc chắn của vải, thường được thực hiện bằng tinh bột Sau khi hoàn tất quá trình dệt, việc loại bỏ các chất hồ hóa là cần thiết, và điều này được thực hiện thông qua xử lý với enzyme α-amylase.
Sản xuất thức ăn gia súc với việc bổ sung hỗn hợp enzyme như α-amylase, cellulase, và β-glucanase vào sinh khối cỏ ủ chua giúp cải thiện đáng kể khả năng tiêu hóa, từ đó nâng cao năng suất tiêu hóa của vật nuôi.
Bổ sung α-amylase và protease vào khẩu phần ăn cho heo con dưới 5 tuần tuổi giúp tăng cường tốc độ phát triển và ngăn ngừa bệnh tiêu chảy phổ biến ở heo con.
Trong y học: chẩn đoán bệnh lâm sàng các bệnh thông thường và cácbệnh thiếu enzyme.
Bacillus subtillis
Bacillus subtilis là một loại vi khuẩn Gram dương, có hình dạng trực khuẩn nhỏ với kích thước từ 0,5 – 0,8 µm x 1,5 – 3 µm, thường xuất hiện đơn lẻ hoặc theo chuỗi ngắn Vi khuẩn này có khả năng di động nhờ vào 8 – 12 lông và sinh ra bào tử hình bầu dục, có kích thước từ 0,8 – 1,8 µm, nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào Bào tử phát triển qua quá trình nảy mầm do sự nứt của bào tử, chúng không kháng acid nhưng có khả năng chịu nhiệt tốt.
Bào tử Bacillus subtilis có khả năng sống sót trong điều kiện khắc nghiệt như nhiệt độ 100 độ C trong 180 phút, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, và áp suất cao Chúng có thể tồn tại từ vài năm đến hàng chục năm, với bằng chứng cho thấy sức sống của bào tử này có thể kéo dài từ 200 đến 300 năm Thường được tìm thấy trong đất, tế bào sinh dưỡng của Bacillus subtilis có hình dạng que, không kết thành chuỗi, bắt phẩm nhuộm đồng đều và không tạo bao nang.
Bào tử B subtilis có hình dạng ellip hoặc hình cầu, kích thước chiều rộng từ 0,6 đến 0,9 μm và chiều dài từ 1,0 đến 1,5 μm, thường nằm ở trung tâm hoặc gần cuối tế bào, chủ yếu được hình thành sau 48 giờ Mỗi cá thể chỉ sản xuất một bào tử với khả năng chịu nhiệt, tia bức xạ, chất sát khuẩn và chất hút ẩm Khi nuôi cấy trên môi trường thạch, khuẩn lạc có hình dạng tròn, không đều hoặc phân tán, với đường kính từ 3 đến 5 mm, màu vàng xám và rìa có hình răng cưa Sau 1 đến 4 ngày, bề mặt khuẩn lạc trở nên nhăn nheo và có màu hơi nâu.
B subtilis là một loại vi khuẩn có khả năng gây hư hỏng thực phẩm hộp do bào tử chịu nhiệt cao, tạo ra mùi vị khó chịu Chúng có khả năng sinh acid từ các đường như xylose, arabinose, glucose, sucrose và mannitol mà không tạo khí, sử dụng muối amonium làm nguồn nitơ Ngoài ra, B subtilis có khả năng phân giải nitrate và sinh nitrit từ nitrate, nhưng trong điều kiện kỵ khí, chúng không sinh khí từ môi trường lỏng chứa nitrate Một đặc điểm nổi bật giúp phân biệt B subtilis với các vi khuẩn khác là khả năng làm tan chảy gelatine một cách nhanh chóng.
Hình 1.3 Vi khuẩn Bacillus subtilis
Năm 1997, nghiên cứu về trình tự gen của vi khuẩn B subtilis đã được hoàn tất và công bố lần đầu tiên Bộ gen này có kích thước 4,2 mega-base với khoảng 4100 gen, trong đó có 192 gen là không thể thiếu.
79 gen đƣợc dự đoán là thiết yếu Phần lớn gen thiết yếu đều có liên quan với quá trình trao đổi chất của tế bào
Vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng phát triển trong điều kiện hiếu khí và cả trong môi trường thiếu oxy Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn này là 37 độ C, trong khi pH thích hợp dao động từ 7,0 đến 7,4.
– Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển hầu hết trên các môi trường dinh dƣỡng cơ bản:
Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA), khuẩn lạc xuất hiện với hình dạng tròn, rìa răng cưa không đều, có màu vàng xám và đường kính từ 3 đến 5 mm Sau 1 đến 4 ngày, bề mặt khuẩn lạc trở nên nhăn nheo và có màu hơi nâu.
+ Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB): vi khuẩn phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan
Trong môi trường giá đậu – peptone, vi khuẩn hình thành các khuẩn lạc tròn, lồi, nhẵn bóng, đôi khi lan rộng với rìa răng cưa không đều, có đường kính từ 3 đến 4 cm sau 72 giờ nuôi cấy Để phát triển tốt, vi khuẩn cần các nguyên tố dinh dưỡng chủ yếu như C, H, O, N cùng với một số nguyên tố vi lượng khác, đặc biệt là nguồn carbon từ glucose và nitơ từ peptone.
Môi trường cấy cho sự phát triển của B.subtilis được chuẩn bị với các thành phần sau: 5,0 g chiết xuất thịt bò, 5,0 g peptone, 0,5 g NaCl, 5,0 g chiết xuất nấm men và 1,0 g tinh bột Độ pH của môi trường được điều chỉnh đến 7,0 để tối ưu hóa sự phát triển của vi khuẩn.
250 ml chứa 50 ml đƣợc cấy nghiêng B subtilis và ủ ở 45 ° C trên máy lắc quay
Bảng 2.1 Môi trường nuôi cấy B.subtilis
Môi trường cơ bản để sản xuất α-amylase bao gồm các thành phần như peptone (10,0 g), chiết xuất nấm men (0,2 g), tinh bột hòa tan (10,0 g), NaCl (2,0 g), MgSO4.7H2O (0,5 g), KH2PO4 (3,0 g) và CaCl2 (0,5 g), với độ pH được điều chỉnh về 8,0 50ml môi trường này được cấy ở tỷ lệ 10% (v/v) và ủ ở nhiệt độ 45 °C trong 48 giờ trên máy lắc quay Hoạt động của enzyme được xác định tại các khoảng thời gian khác nhau, nhằm tối ưu hóa các điều kiện để tạo ra α-amylase cao từ B subtilis.
Nghiên cứu về tác động của thành phần môi trường và các điều kiện của nó là cần thiết để đạt được sản lượng tối đa của enzyme Các nguồn carbon khác nhau như tinh bột, glycogen, maltose, glucose, xylose và glycerol được sử dụng ở nồng độ 10 g/L Việc xác định nồng độ nitơ và tinh bột tối ưu cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình này.
Các nồng độ tinh bột khác nhau từ 0 đến 20 g/L cùng với nguồn nitơ cố định ở mức 3 g/L đã được bổ sung vào môi trường cơ bản Các nguồn nitơ được sử dụng bao gồm peptone, chiết xuất nấm men, chiết xuất thịt bò, chiết xuất mạch nha, kết hợp nấm men và peptone (1,5 + 1,5 g), chiết xuất thịt bò với peptone, NaNO3, (NH4)2SO4, cũng như các tổ hợp peptone với NaNO3 và (NH4)2SO4 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ cũng đã được xem xét trong nghiên cứu này.
Môi trường cơ bản được điều chỉnh ở khoảng pH (5,5 - 9,0) và ở các nhiệt độ khác nhau (25-70°C) e Thời gian tối ưu để sản xuất α -amylase
Môi trường lên men được thiết lập với tinh bột 10 g/L làm nguồn carbon và peptone 3 g/L, pH được điều chỉnh ở mức 8,5 Nghiên cứu nhằm xác định thời gian tối ưu cho sản xuất α-amylase, với hai bình mẫu được lấy sau mỗi 24 giờ trong khoảng thời gian từ 0 đến 7 ngày để đánh giá sự phát triển của tế bào, pH cuối cùng và hoạt tính của α-amylase.
– Lên men không sinh hơi các loại đường như: glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose và arabinose
– Thử nghiệm indol (-), VP (+), nitrate (+), H 2 S (-), NH 3 (+), catalase (+), amylase (+), casein, (+), citrate (+), có khả năng di động (+) và hiếu khí (+)
1.2.6 Ứng dụng của Bacillus subtilis
Trong công nghiệp sản xuất amino acid, thức ăn gia súc, Bacillus subtilis là một trong những chủng vi sinh vật tổng hợp lysine có hàm lƣợng khá lớn (15
Trong y dược, Bacillus subtilis được sử dụng dưới dạng ống thuốc Subtilis 10 ml để điều trị tiêu chảy ở trẻ em do vi khuẩn Coliform, bệnh dường ruột do lị trực trùng, và hỗ trợ trong việc làm lành các vết thương lở loét ngoài Ngoài ra, Bacillus subtilis còn có khả năng sản xuất các kháng sinh thực vật, được ứng dụng hiệu quả trong việc phòng trừ các vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp, và Pylicularia oryzae.
Sự phát triển của Bacillus subtilis trong cây giúp tăng cường khả năng tổng hợp các peptide kháng nấm từ vi khuẩn nốt rễ (Rhizobacterium), điều này có ý nghĩa quan trọng trong kiểm soát sinh học Ứng dụng của nó trong sản xuất chế phẩm sinh học (probiotic) không chỉ cải thiện tiêu hóa và sức tăng trưởng của gia súc mà còn giảm nguy cơ tái phát bệnh tiêu chảy Ngoài ra, việc bổ sung Bacillus subtilis vào ao nuôi giúp duy trì chất lượng nước và hạn chế bệnh tật cho thủy sản.
Lựa chọn phương pháp nuôi cấy
Hiện nay, có ba phương pháp chính để nuôi cấy vi sinh vật: phương pháp nuôi cấy gián đoạn, phương pháp nuôi cấy liên tục bổ sung cơ chất và phương pháp nuôi cấy liên tục.
Trong 3 phương pháp này đều có ưu và nhược điểm riêng, nhưng phương pháp nuôi cấy liên tục có những ƣu điểm nhƣ hiệu suất sinh khối cao nhất, rút ngắn đƣợc thời gian lên men, giảm bớt đƣợc thể tích của toàn bộ thiết bị, thao tác đơn giản và thực hiện quá trình tự động hóa, giảm bớt thời gian làm vệ sinh thiết bị khử khuẩn và làm nguội, mật độ tế bào đƣợc tạo ra cao do khả năng phục hồi và tái sử dụng tế bào Ngoài ra, phương pháp lên men liên tục có những hạn chế nhƣ cần điều kiện vô trùng tuyệt đối vì trong quá trình nuôi liên tục đã tạo ra môi trường tối ưu cho chủng nuôi cấy nhưng các vi khuẩn khác có điều kiện tương tự sẽ nhiễm vào, dễ bị nhiễm khuẩn và khó xử lí, cần nhân viên chuyên nghiệp có tay nghề cao để vận hành thiết bị, cần nhiều nguồn năng lƣợng cho quá trình vận hành và chi phí thiết bị cao cho tự động hóa Theo
Theo Biền Văn Minh (2008), việc tách các hệ sợi vi sinh vật như nấm mốc một cách vô khuẩn là rất khó khăn Đặc biệt, hiệu suất chuyển hóa trong quá trình này thường thấp hơn so với phương pháp nuôi cấy từng mẻ.
Phương pháp nuôi cấy gián đoạn bổ sung cơ chất có hiệu suất thu hồi sinh khối thấp hơn so với phương pháp nuôi cấy liên tục, nhưng lại đơn giản và dễ vận hành Tuy nhiên, phương pháp này tiềm ẩn nguy cơ ngoại nhiễm cao trong quá trình bổ sung cơ chất, đòi hỏi đội ngũ nhân viên tay nghề cao và điều kiện vô trùng tuyệt đối Chi phí cho trang thiết bị và vận hành cũng cao, nhưng vi sinh vật không bị ức chế bởi nồng độ môi trường cao, làm cho phương pháp này phù hợp với quy mô công nghiệp mà không cần yêu cầu kỹ thuật quá phức tạp.
Khi lựa chọn phương pháp nuôi cấy Bacillus subtilis ở quy mô công nghiệp, cần xem xét các yếu tố như chi phí đầu tư thiết bị thấp, yêu cầu trình độ nhân viên không quá cao, và thiết bị phải đơn giản, dễ vận hành cũng như khắc phục sự cố Phương pháp nuôi cấy gián đoạn được coi là phù hợp nhất cho quy mô công nghiệp nhằm sản xuất enzyme α-amylase với chi phí sản xuất thấp Cả hai hình thức lên men trạng thái rắn (SSF) và lên men chìm (SMF) đều có thể áp dụng, nhưng cần xác định hình thức nuôi cấy nào là tối ưu cho nhu cầu của ngành công nghiệp.
Theo Nguyễn Hoàng Lộc (2007), phương pháp nuôi bề mặt cho phép cấy vi sinh vật trực tiếp trên bề mặt môi trường rắn hoặc lỏng Đối với môi trường rắn, cần làm ẩm trước khi cấy để vi sinh vật sử dụng chất dinh dưỡng và oxy từ không khí cho sự sinh trưởng Môi trường rắn nên mỏng (2-5 cm) để đảm bảo tiếp xúc tốt với không khí Phương pháp này thích hợp cho nấm mốc và vi khuẩn, thường được thực hiện trên khay phẳng trong buồng chứa vô trùng Nguyên liệu tự nhiên như cám, gạo tấm, ngô thường được sử dụng cho môi trường rắn, trong khi môi trường lỏng có thể là rỉ đường hoặc dịch thủy phân Để đảm bảo dinh dưỡng, có thể bổ sung các nguồn N, P, K Độ ẩm tối ưu cho nuôi cấy nấm mốc là 58-60%, trong khi vi khuẩn phát triển tốt ở độ ẩm 60% Tuy nhiên, độ ẩm thấp hơn 45-50% có thể làm giảm hoạt tính enzyme Trong quá trình nuôi cấy, cần duy trì độ ẩm 50-60% và độ ẩm không khí phòng nuôi cấy ở mức 90-100% Mặc dù không cần điều kiện vô trùng tuyệt đối, môi trường nhân giống cần được vô trùng để đảm bảo sự phát triển bình thường của giống, đặc biệt trong giai đoạn đầu.
Trong sản xuất môi trường rắn, cần vô trùng ở áp suất 1-1,5 atm bằng hơi nóng trong 45-60 phút Nếu môi trường được trộn với acid hydrochloric hoặc sulfuric đến pH thích hợp, hoặc thêm một ít formalin, chỉ cần vô trùng ở 0,2-0,3 atm Việc thêm acid và duy trì pH nhất định giúp tăng cường enzyme Môi trường được dàn mỏng trong các khay vô trùng dày khoảng 2-2,5 cm, sau đó để nguội đến 30°C để tiến hành cấy giống Giống được nhân bằng phương pháp bề mặt hoặc tách bào tử khỏi môi trường, sau đó chứa trong bình nút kín hoặc túi polyethylene.
Thời gian nuôi cấy mốc phụ thuộc vào các đặc tính sinh lý riêng biệt của từng loại mốc, với mục tiêu đạt được lượng enzyme tối đa Ưu điểm của việc này là tối ưu hóa quy trình sản xuất enzyme, giúp tăng hiệu suất và chất lượng sản phẩm.
Nồng độ enzyme tạo thành ở môi trường rắn cao hơn nhiều lần so với nuôi cấy chìm
Không cần các thiết bị phức tạp, chủ yếu nuôi trên khay và buồng nuôi giữ ở nhiệt độ và độ ẩm thích hợp
Quá trình sản xuất tiêu tốn ít năng lƣợng
Tốn nhiều diện tích mặt bằng
Khó cơ khí hoá và tự động hoá
Chi phí cho nhân công cao
Lên men chìm là phương pháp phổ biến trong quy trình lên men công nghiệp nhờ khả năng kiểm soát dễ dàng toàn bộ các khâu trong quá trình (Phạm Thành Hổ, 2005) Khi nuôi cấy vi sinh vật, việc lựa chọn thành phần môi trường và tỷ lệ các chất dinh dưỡng phù hợp với từng chủng là rất quan trọng, đặc biệt là chất cảm ứng cần thiết để vi sinh vật sản sinh enzyme ở mức tối đa.
Quá trình sinh tổng hợp enzyme qua phương pháp nuôi cấy chìm thường kéo dài từ 2-4 ngày, với phần lớn enzyme thủy phân do nấm mốc và xạ khuẩn tiết ra môi trường xung quanh, chỉ còn 10-15% trong hệ sợi sau ba ngày nuôi cấy Độ pH của môi trường đóng vai trò quan trọng, trong đó pH tối ưu cho sinh tổng hợp ɑ-amylase là 7-8 và cho glucoamylase là 4,5-5 Sử dụng muối ammonium làm nguồn nitrogen sẽ dẫn đến việc acid hóa môi trường, trong khi việc sử dụng nitrate sẽ làm kiềm hóa môi trường.
Sự sục khí không chỉ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật mà còn tác động đến quá trình tạo thành enzyme Tốc độ tiêu thụ oxy của nấm mốc đạt đỉnh sau khoảng 24 giờ nuôi cấy và sau đó giảm dần Việc tăng nồng độ các chất dinh dưỡng và oxy hòa tan trong môi trường có thể cải thiện khả năng tổng hợp ɑ-amylase.
Khi so sánh với phương pháp lên men bề mặt, thì phương pháp lên men chìm có nhiều ƣu điểm đó là:
Chiếm diện tích nhỏ trong việc xây dựng và lắp đặt dây chuyền sản xuất
Tổ chức chức theo quy mô lớn dễ dàng và đơn giản
Quá trình quan sát dễ cơ giới hóa và tự động hóa
Tuy nhiên phương pháp lên men chìm cũng có nhiều nhược điểm cần khắc phục:
Đòi hỏi trang bị kĩ thuật cao
Dễ bị nhiễm trùng toàn bộ
Trang thiết bị đắt tiền
Công nghệ xử lý phụ phẩm từ quá trình lên men là cần thiết để ngăn chặn ô nhiễm môi trường Phương pháp này áp dụng cho cả vi sinh vật hiếu khí và kị khí Đối với vi sinh vật hiếu khí, cần sục khí liên tục trong suốt quá trình lên men, trong khi vi sinh vật kị khí chỉ cần khuấy trộn thỉnh thoảng Sự sục khí không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật mà còn tác động đến quá trình tạo enzyme.
Phương pháp nuôi cấy chìm hiện đang được áp dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, bao gồm sản xuất men bánh mì, protein đơn bào, chế phẩm vi sinh cho phân bón và thuốc trừ sâu, cũng như enzyme, acid amin, vitamin, kháng sinh và chất kích thích sinh học Phương pháp này cho phép kiểm soát dễ dàng các yếu tố môi trường như nhiệt độ và pH.
LỰA CHỌN, PHÂN TÍCH, QUY TRÌNH SẢN XUẤT
Lựa chọn công nghệ
Thiết bị lọc khung bản
Máy lọc ép khung bản hoạt động dựa trên nguyên tắc nén áp suất Thiết bị này bao gồm hai phần chính: bộ phận lọc và bộ phận bơm, có nhiệm vụ hút và nén dung dịch qua vật liệu lọc.
Phần đầu tiên của thiết bị lọc bao gồm khung và tấm lọc, được ép lại với nhau bằng một đĩa quay tay Số lượng tấm lọc tối đa có thể lên đến 50 - 100 tấm Tấm vải lọc khung bản, hay còn gọi là vải lọc khung bản, được làm từ polypropylene (PP), mang lại độ bền cao và khả năng chịu đựng tốt trong môi trường hóa chất.
Phần thứ hai của hệ thống bao gồm bộ phận hút và nén dung dịch lọc, với bơm nén áp suất cao và hai thùng chứa bằng thép không rỉ, mỗi thùng có dung tích 200 lít và chỉ thị mức dung dịch Một thùng chứa dung dịch đục (hỗn hợp lọc) và thùng còn lại chứa dịch lọc (Filtrat) Bên cạnh đó, còn có thùng thứ ba nối với máy để chứa hỗn hợp nước và diatomit, giúp phủ lên màng lọc một lớp màng, tạo điều kiện cho chất lỏng dễ dàng đi qua.
Thiết bị lọc khung bản là một loại thiết bị lọc áp lực hoạt động theo phương thức gián đoạn, cho phép nhập liệu liên tục và thu hồi nước lọc một cách liên tục Tuy nhiên, bã được tháo ra theo chu kỳ.
Khung và bản là hai thành phần chính của hệ thống lọc, trong đó khung giữ bã lọc và nhập huyền phù, còn bản tạo ra bề mặt lọc với các rãnh dẫn nước Cả hai thường được chế tạo hình vuông và cần được bịt kín tốt khi ghép lại Chúng được xếp liên tiếp trên giá đỡ, với vách ngăn lọc nằm giữa Ép chặt khung và bản được thực hiện bằng cơ cấu đai vít xoắn, kết nối lỗ dẫn huyền phù thành ống dẫn Nước lọc chảy ra qua hệ thống ống, trong khi bã được giữ lại trên vách ngăn và chứa trong khung Khi khung đầy bã, quá trình lọc sẽ dừng lại để rửa và tháo bã Trong suốt quá trình lọc, chất rắn trong huyền phù được giữ lại nhờ lớp vật liệu lọc.
Màng lọc hoạt động dựa trên lực nén từ máy bơm, tạo ra dòng chảy mạnh giúp các phần tử nước di chuyển Trong quá trình này, các phần tử cần lọc có kích thước trung bình 0.001µm sẽ bị giữ lại bởi mạng lọc, ngăn chặn sự đi qua của các thành phần như sinh khối và kim loại.
Máy lọc màng hoạt động ở áp suất dư có thiết kế hình trụ với các tấm hình chữ nhật gắn chặt vào nắp, cho phép nắp và tấm di động nhờ hai con lăn trên đường ray Mỗi tấm được trang bị ống tháo và van để xả nước lọc, cùng với cửa huyền phù vào và cửa đẩy không khí Bên cạnh đó, thiết bị lọc màng chân không được sử dụng để lọc huyền phù có độ pha rắn nhỏ, bao gồm nhiều tấm lọc lắp trên khung, bể chứa huyền phù, bể rửa và bể tháo bã có vít tải để xử lý bã Khung lọc được treo trên con chạy để tối ưu hóa hiệu suất.
Hình 2 2: Thiết bị lọc màng
Máy lọc tấm làm việc ở áp suất dƣ:
Huyền phù đƣợc bơm hay nhờ không khí nến đƣa vào thiết bị qua ống, không khí trong thùng bị đẩy ra cửa qua van tự động
Khi thùng chứa đầy huyền phù, van tự động đóng lại và áp suất dư bên trong khiến chất lỏng chảy qua vách lọc ra ngoài Khi lớp bã đạt chiều dài yêu cầu, người ta sử dụng không khí nén để đẩy huyền phù dư ra ngoài Để rửa bã, nước được cho vào thùng, sau đó không khí nén được sử dụng để đẩy nước ra ngoài và sấy khô bã Cuối cùng, để tháo bã, người ta tháo nắp, kéo tấm lọc ra ngoài và sử dụng nước hoặc không khí để tách bã.
Máy lọc tấm làm việc ở áp suất chân không:
Khi nhúng khung vào bể huyền phù dưới áp lực chân không, nước sẽ được lọc qua vải và chảy vào bên trong khung, sau đó dẫn đến bộ phận chứa Bã sẽ bám lại trên vải và đạt độ dày từ 5 đến 33mm Sau khi hoàn tất quá trình này, khung sẽ được chuyển sang bể rửa nhưng vẫn duy trì áp lực chân không Cuối cùng, sau khi rửa xong, khung sẽ được chuyển sang bể để loại bỏ bã bằng không khí hoặc chất lỏng.
Bảng 2.1 So sánh ưu - nhược điểm của máy lọc khung bản và lọc bằng màng
Lọc khung bản bằng màng có nhiều ưu điểm nổi bật, bao gồm bề mặt lọc lớn trên một đơn vị diện tích, giúp tăng hiệu quả sản xuất Quy trình lọc diễn ra với động lực lớn nhờ vào hiệu số áp suất cao, đảm bảo quá trình tách lọc diễn ra nhanh chóng và hiệu quả.
Có thể kiểm tra quy trình làm việc đƣợc
Có thể ngừng không cho một vài bản làm việc (khi thấy nước lọc chảy ra qua van của bản nào bị đục thì ta đóng van đó lại)
Tốn ít nước rửa Vải lọc ít bị hao mòn Năng suất cao
Thao tác bằng tay nhiều Rửa bã chƣa thật tốt Vải lọc nhanh bị rách
Giá thành thiết bị cao Khó kiểm tra bề dày bã Khó thay vải lọc
Từ các đặc điểm của các máy lọc sử dụng máy lọc khung bản có bột trợ lọc là tối ƣu nhất
Ly tâm là phương pháp hiệu quả để tách các phân tử có khối lượng riêng khác nhau, thường được sử dụng để tách pha rắn ra khỏi pha lỏng trong các hỗn hợp không đồng nhất Trong ngành công nghiệp, quá trình này thường áp dụng cho hỗn hợp rắn-lỏng hoặc lỏng-lỏng với khối lượng riêng khác nhau Để đạt hiệu quả tách biệt, vật liệu đưa vào ly tâm cần phải dễ phân ly, có khả năng tách rời và không có độ nhớt quá lớn, đồng thời pha rắn nên ở dạng to và chắc Sản phẩm thu được từ quá trình ly tâm là chất rắn có độ tinh khiết cao nhưng vẫn còn độ ẩm, trong khi các chất lỏng sẽ có khối lượng riêng khác nhau.
Sau quá trình ly tâm, hỗn hợp được tách biệt chủ yếu thông qua việc thay đổi trạng thái mà không có biến đổi hóa học hay hóa lý đáng kể Tuy nhiên, chất lượng sản phẩm được cải thiện nhờ việc loại bỏ các tạp chất hòa tan không phải dạng tinh thể, đặc biệt là các chất màu Do đó, sau khi ly tâm, sản phẩm sẽ sạch hơn và chất lượng được nâng cao.
Trong ngành công nghiệp, phương pháp ly tâm liên tục được ứng dụng phổ biến nhờ vào những ưu điểm như thu nhận sản phẩm nhanh chóng và liên tục, đồng thời không làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme Phương pháp này chủ yếu được sử dụng để thu nhận dung dịch chứa các enzyme ngoại bào Đối với enzyme nội bào, quá trình thu nhận yêu cầu phải thực hiện thêm một giai đoạn phá vỡ tế bào.
Thiết bị ly tâm dạng đĩa bao gồm thùng quay với hình nón cụt bên trong Chất lỏng được đưa vào qua ống dẫn, sau đó chảy xuống dưới thùng và phân tán thành lớp mỏng qua các lỗ ở đĩa Nhờ lực ly tâm, chất rắn (protein tủa) lắng xuống đáy đĩa và được thu hồi để thực hiện quy trình tiếp theo, trong khi phần chất lỏng phía trên được xả ra ngoài qua ống dẫn.
Sấy là công đoạn quan trọng trong sản xuất, giúp giảm độ ẩm của chế phẩm enzyme, từ đó dễ bảo quản và vận chuyển Các sản phẩm có hoạt tính sinh học như enzyme và sinh khối vi sinh vật yêu cầu phương pháp sấy phức tạp hơn Việc lựa chọn phương pháp sấy phù hợp với đặc tính sản phẩm và tính kinh tế là điều cần thiết.
Lựa chọn nguồn nuôi cấy Bacillus subtillis
Nguồn carbon đóng vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, vừa là nguồn dinh dưỡng vừa là nguồn năng lượng Suman và Ramesh (2010) cho biết rằng khi nuôi cấy chủng Bacillus.sp trong môi trường có bổ sung lactose, khả năng tổng hợp amylase tăng cao hơn so với các nguồn carbon khác Kinsoula và Liakopoulou-Kyriakides (2007) cũng kết luận rằng tinh bột hòa tan là nguồn tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp ɑ-amylase của chủng B subtilis.
Trong ngành công nghiệp, phụ phẩm nông nghiệp như mật rỉ đường trở thành lựa chọn lý tưởng nhờ vào lợi nhuận kinh tế và giá thành nguyên liệu thấp Mật rỉ đường, hay còn gọi là rỉ đường, là sản phẩm phụ trong quá trình sản xuất đường từ mía hoặc củ cải đường Đây là chất lỏng đặc sánh còn lại sau khi đường đã được tách ra qua phương pháp cô đặc và kết tinh, và việc tận dụng nguồn nguyên liệu dồi dào này sẽ giúp giảm thiểu chi phí sản xuất đáng kể.
Bảng 2.1: Thành phần mật rỉ đường
Ngoài ra, trong nguyên liệu mật rỉ đường còn chứa một số vitamin
Bảng 2.2: Thành phần vitamin của mật rỉ đường
Nitơ là thành phần thiết yếu trong quá trình chuyển hóa năng lượng và cấu tạo tế bào, bao gồm acid nucleic, protein và enzyme Nguồn nitơ có hai dạng chính: vô cơ và hữu cơ Nitơ hữu cơ thường ở dạng phức tạp, cần được chuyển hóa thành dạng đơn giản để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ và sử dụng Các nguồn nitơ mà vi sinh vật thường sử dụng bao gồm muối nitrat, protein, ure và pepton Ngoài ra, vi sinh vật cũng có thể tận dụng phụ phẩm nông nghiệp như bã mía, bã dừa và bã đậu nành làm nguồn nitơ.
Sarikaya (2004) identified that salt, urea, and protein are nitrogen sources that contribute approximately 1% in environments supplemented with 1% olive oil Kinsoula and Liakopoulou-Kyriakides (2007) suggested that tryptone serves as a nitrogen source that stimulates the synthesis of amylase in specific strains.
Nguồn khoáng và các yếu tố khác
Khoáng là yếu tố thiết yếu cho sự phát triển của vi sinh vật, chiếm khoảng 2-5% khối lượng khô của tế bào Chúng thường được bổ sung dưới dạng muối như sunphat, cacbonat, và clorua, và tồn tại trong tế bào vi sinh vật dưới dạng ion như Na+, Mg2+, K+, Ca2+, Cl-, HCO3-, và (HPO4)2-.
Hàm lượng khoáng chất trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật thay đổi theo từng giai đoạn phát triển của chúng Việc bổ sung khoáng chất vào môi trường không chỉ thúc đẩy sự phát triển của vi sinh vật mà còn đặc biệt quan trọng với phospho, vì nó đóng vai trò như một chất đệm thiết yếu.
Các chất khoáng có mặt trong các chế phẩm như bã mía, bã dừa, bã đậu nành và mật rỉ đường, giúp giảm đáng kể lượng khoáng cần bổ sung vào môi trường.
B subtilis có nguồn carbon và nito đa dạng nên sẽ có rất nhiều môi trường nuôi cấy có thể sử dụng như PGA, PDA, Czapek Dox, mật rỉ đường, bã mía Để lựa chọn môi trường cấy B subtilis ở quy mô công nghiệp cần đảm bảo giá thành rẻ, dễ tìm, hiệu suất thu hồi cao,
Lựa chọn phương pháp nuôi cấy B subtillis
Hiện nay, có ba phương pháp chính để nuôi cấy vi sinh vật, bao gồm phương pháp nuôi cấy gián đoạn, phương pháp nuôi cấy liên tục với việc bổ sung cơ chất, và phương pháp nuôi cấy liên tục.
Trong 3 phương pháp này đều có ưu và nhược điểm riêng, nhưng phương pháp nuôi cấy liên tục có những ƣu điểm nhƣ hiệu suất sinh khối cao nhất, rút ngắn đƣợc thời gian lên men, giảm bớt đƣợc thể tích của toàn bộ thiết bị, thao tác đơn giản và thực hiện quá trình tự động hóa, giảm bớt thời gian làm vệ sinh thiết bị khử khuẩn và làm nguội, mật độ tế bào đƣợc tạo ra cao do khả năng phục hồi và tái sử dụng tế bào Ngoài ra, phương pháp lên men liên tục có những hạn chế nhƣ cần điều kiện vô trùng tuyệt đối vì trong quá trình nuôi liên tục đã tạo ra môi trường tối ưu cho chủng nuôi cấy nhưng các vi khuẩn khác có điều kiện tương tự sẽ nhiễm vào, dễ bị nhiễm khuẩn và khó xử lí, cần nhân viên chuyên nghiệp có tay nghề cao để vận hành thiết bị, cần nhiều nguồn năng lƣợng cho quá trình vận hành và chi phí thiết bị cao cho tự động hóa
Phương pháp nuôi cấy gián đoạn bổ sung cơ chất có hiệu suất thu hồi sinh khối thấp hơn so với phương pháp nuôi cấy liên tục, nhưng lại dễ vận hành và chi phí thiết bị thấp Tuy nhiên, phương pháp này tiềm ẩn nguy cơ ngoại nhiễm cao trong quá trình bổ sung cơ chất, do đó yêu cầu đội ngũ nhân viên có tay nghề cao và điều kiện vô trùng nghiêm ngặt Mặc dù hiệu suất thu hồi thấp hơn hai phương pháp còn lại, phương pháp nuôi cấy gián đoạn vẫn phù hợp với quy mô công nghiệp mà không cần yêu cầu kỹ thuật quá cao.
Khi lựa chọn phương pháp nuôi cấy ở quy mô công nghiệp, cần đảm bảo các yếu tố như chi phí đầu tư trang thiết bị thấp, yêu cầu trình độ nhân viên không quá cao, thiết bị đơn giản dễ vận hành và dễ khắc phục sự cố Phương pháp nuôi cấy B subtilis phù hợp cho quy mô công nghiệp là nuôi cấy gián đoạn Để đáp ứng nhu cầu ngành công nghiệp, chi phí sản xuất thấp là ưu tiên hàng đầu trong sản xuất enzyme như lipase Cả hai hình thức lên men trạng thái rắn (SSF) và lên men chìm (SMF) đều có thể được áp dụng để sản xuất enzyme này, nhưng cần xác định hình thức nuôi cấy nào là phù hợp nhất cho quy mô công nghiệp.
Theo Nguyễn Hoàng Lộc (2007), trong phương pháp nuôi bề mặt, vi sinh vật được cấy trực tiếp trên bề mặt môi trường rắn hoặc lỏng Đối với môi trường rắn, cần làm ẩm trước khi nuôi cấy để vi sinh vật có thể sử dụng chất dinh dưỡng và oxy từ không khí cho quá trình hô hấp và phát triển Để đảm bảo vi sinh vật phân tán đều và tiếp xúc tốt với oxy, lớp môi trường rắn nên mỏng (2-5 cm) Phương pháp này thích hợp cho việc sản xuất enzyme từ một số loại nấm mốc và vi khuẩn, và đôi khi cũng sử dụng môi trường lỏng Quá trình nuôi cấy thường diễn ra trên các khay phẳng xếp chồng và ủ trong buồng chứa vô trùng, với giống vi sinh vật được cấy bằng cách thổi bào tử vào buồng Môi trường rắn thường được làm từ nguyên liệu tự nhiên như cám, gạo tấm, ngô, bã bia, bã củ cải đường, khoai tây, lõi ngô, hoặc hỗn hợp của chúng, trong khi môi trường lỏng thường là rỉ đường, dịch thủy phân từ thóc mầm, nước bã rượu, và có thể bổ sung muối khoáng.
Để đảm bảo đầy đủ chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy, cần bổ sung các nguồn N, P, K hoặc chất sinh trưởng như nước khoai tây Độ ẩm thích hợp cho việc nuôi cấy bề mặt trên khay hở đối với nhiều chủng nấm mốc là 58-60% Tuy nhiên, độ ẩm 60% có thể tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển, gây tạp nhiễm và khó thông khí Độ ẩm từ 45-50% ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme trong môi trường nuôi cấy Do đó, nên duy trì độ ẩm môi trường ở mức 50-60% và độ ẩm không khí phòng nuôi cấy ở mức 90-100% Mặc dù nuôi cấy bề mặt không yêu cầu điều kiện vô trùng tuyệt đối, nhưng môi trường nhân giống cần được vô trùng để giống phát triển bình thường, đặc biệt là trong giai đoạn đầu.
Trong sản xuất môi trường rắn, quá trình vô trùng cần thực hiện ở áp suất 1-1,5 atm bằng hơi nóng trong 45-60 phút Nếu môi trường được trộn với chlohydric acid hoặc sulfuric acid đến pH thích hợp, hoặc thêm một ít formalin, có thể vô trùng ở áp suất 0,2-0,3 atm Việc điều chỉnh pH bằng acid giúp tăng cường sản xuất enzyme Môi trường sau khi vô trùng được dàn mỏng khoảng 2-2,5 cm trong các khay và để nguội đến 30°C trước khi cấy giống Giống được nhân bằng phương pháp bề mặt hoặc tách bào tử từ môi trường, sau đó được lưu trữ trong các bình nút kín hoặc túi.
Phương pháp thu nhận enzyme ɑ -amylase
Dịch enzyme thô sau quá trình lên men chứa nước, protein không hoạt tính sinh học, tạp chất từ môi trường nuôi cấy và enzyme có hoạt tính sinh học Để đạt được sản phẩm cuối cùng với nồng độ enzyme cao, cần loại bỏ các thành phần không cần thiết Lipase từ vi sinh vật chủ yếu là enzyme ngoại bào.
Để sản xuất chế phẩm enzyme kỹ thuật cho chất tẩy rửa, phương pháp kết tủa là chính Tuy nhiên, trong ngành dược phẩm, thực phẩm và da, cần áp dụng thêm các biện pháp tinh sạch khác như sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion và sắc ký ái lực.
Kết tủa là phương pháp phổ biến trong nghiên cứu và sản xuất enzyme, với 80% công nghệ tinh sạch enzyme sử dụng kỹ thuật này Trong đó, kết tủa bằng muối ammonium sulphate chiếm 60%, trong khi kết tủa bằng ethanol, acetone hoặc axit (thường là HCl) chiếm 35%.
Phương pháp kết tủa muối dựa trên nguyên tắc rằng khi muối được thêm vào dung dịch enzyme, nó sẽ kéo các phân tử nước ra khỏi protein, dẫn đến sự thay đổi điện tích và giảm độ hòa tan của enzyme Mỗi loại enzyme có một nồng độ muối tối ưu riêng để đạt được sự kết tủa hoàn toàn, cho phép tách biệt các protein trong hỗn hợp.
Ammonium sulfate là một loại muối phổ biến và giá cả phải chăng, với trọng lượng phân tử thấp và độ hòa tan cao Nó có khả năng duy trì hoạt tính cho protein enzyme, nhưng cần lưu ý rằng các thiết bị có thể bị ăn mòn do muối Thông thường, muối được sử dụng ở dạng rắn và hòa tan từ từ vào dung dịch cho đến khi đạt nồng độ từ 30% đến 70%, và quá trình này nên được thực hiện ở nhiệt độ lạnh khoảng 4 độ C (Da cam Kumar 2012).
Phương pháp kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ như ethanol và acetone giúp giảm hằng số điện môi của dung dịch, từ đó tăng cường lực hút tĩnh điện giữa các phân tử protein, dẫn đến sự hình thành tủa Enzyme rất nhạy cảm với nhiệt độ trong dung môi hữu cơ, và nồng độ dung môi cần thiết để kết tủa protein enzyme sẽ khác nhau tùy thuộc vào tính chất của từng loại protein.
Bảng 2.4: So sánh dung môi dùng để kết tủa enzyme
Về hiệu suất thu hồi enzyme, hai nghiên cứu cho thấy dung dịch enzyme thô có hoạt tính gần như tương đương Tuy nhiên, sau khi tinh sạch bằng phương pháp kết tủa phân đoạn, hiệu suất thu hồi và hoạt tính enzyme sau kết tủa với Ammonium sulphate cao hơn so với ethanol Mặc dù vậy, quá trình kết tủa bằng Ammonium sulphate tốn nhiều thời gian hơn, dẫn đến số mẻ thực hiện được sẽ ít hơn.
Xét về chi phí hóa chất: giá thành của ethanol cao hơn Ammonium sulphate, từ đó giá thành sản phẩm cũng cao hơn
Hoạt tính trong dung dịch enzyme thô chƣa kết tủa
Hiệu suất thu hồi enzyme (%) 70 40,12
Hiệu quả tinh sạch (lần) 11,5 7,12
Từ những so sánh trên chúng tôi lựa chọn phương pháp kết tủa bằng muối ammonium sulphate để sản xuất ɑ -amylase
Hình 2.5 Sơ đồ quy trình công nghệ
Nguyên liệu đầu vào cho sản xuất là mật rỉ đường, một phụ phẩm từ ngành công nghiệp đường Để đảm bảo chất lượng sản phẩm, cần duy trì nguồn thu mua nguyên liệu ổn định, giá thành hợp lý và uy tín trong chất lượng.
Chuẩn bị môi trường bằng cách phối trộn các thành phần theo Bảng 2.1, sau đó tiến hành thanh trùng ở nhiệt độ 121 oC trong 15 phút Cuối cùng, làm nguội môi trường trực tiếp trong bể lên men đến 30 oC.
Giống sử dụng: nấm mốc Bacillus subtillis
Mục đích nuôi cấy: sinh nhiều enzyme ɑ - amylase có hoạt tính cao trong quá trình lên men
Mục tiêu của nghiên cứu là tối ưu hóa điều kiện cho Bacillus subtilis phát triển và tổng hợp enzyme α-amylase Để đạt được điều này, chúng tôi sử dụng môi trường nuôi cấy mật rỉ đường kết hợp với phương pháp lên men chìm và nuôi cấy gián đoạn theo mẻ, đã được phân tích kỹ lưỡng.
Môi trường nuôi cấy vi khuẩn sau khi đạt đủ số lượng sẽ được chuyển vào thiết bị lên men chính, nơi có hệ thống cánh khuấy, cung cấp oxy, và điều chỉnh pH, nhiệt độ để duy trì điều kiện tối ưu cho Bacillus subtilis Việc kiểm soát nồng độ oxy là cần thiết vì Bacillus subtilis là sinh vật hiếu khí, giúp tăng cường sự phân bố của vi sinh vật trong bể và tăng diện tích tiếp xúc giữa cơ chất và vi sinh vật, từ đó tối ưu hóa quá trình lên men và giảm thiểu sản phẩm phụ gây ức chế.
Mục đích: loại bỏ sinh khối khỏi canh trường, sử dụng dịch lọc (có chứa enzyme) vào các khâu sau
Thiết bị sử dụng: lọc khung bản
Máy lọc ép khung bản hoạt động dựa trên nguyên tắc nén áp suất, bao gồm hai phần chính: bộ phận lọc và bộ phận bơm Bộ phận bơm có nhiệm vụ hút và nén dung dịch lọc qua vật liệu lọc, giúp quá trình lọc diễn ra hiệu quả.
Phần đầu tiên của thiết bị lọc bao gồm khung và các tấm lọc (tấm vải lọc khung bản) được kết nối với nhau thông qua một đĩa quay bằng tay Số lượng tấm lọc tối đa có thể lên tới 50 – 100 tấm Tấm vải lọc khung bản, hay còn gọi là vải lọc khung bản, được chế tạo từ vật liệu polypropylene (PP), nổi bật với độ bền cao và khả năng chịu đựng tốt trong môi trường hóa chất.
Phần thứ hai của hệ thống bao gồm bộ phận hút và nén dung dịch lọc, với bơm nén áp suất cao và hai thùng chứa bằng thép không rỉ, mỗi thùng có dung tích 200 lít Hệ thống được trang bị chỉ thị mức dung dịch trong từng thùng, trong đó một thùng chứa dung dịch đục (hỗn hợp lọc) và thùng còn lại chứa dịch lọc (Filtrat).
Thùng thứ ba được kết nối với máy để chứa hỗn hợp nước và diatomit, giúp tạo ra một lớp màng trên bề mặt lọc, từ đó cho phép chất lỏng đi qua một cách dễ dàng hơn.
TÍNH TOÁN CÂN BẰNG VẬT CHẤT
Kế hoạch sản xuất
Năng suất nhà máy sản xuất α-amylase là 200 tấn/năm
Một năm 365 ngày, trừ các ngày lễ (15 ngày) và thời gian bảo trì máy móc thiết bị (20 ngày) Số ngày làm việc của công ty trong 1 năm:
Thời gian nuôi cấy thu đƣợc hoạt tính α-amylase cao nhất đối với
Bacillus subtillis là 60 giờ tại 50 0 C (2.5 ngày) (AltafAhmed Simair, 2017) Thời gian nghỉ giữa các mẻ để vệ sinh thiết bị là 0,5 ngày
Vậy thời gian của một mẻ là 3 ngày = 72 giờ
Vậy số mẻ một năm là:
Năng suất của nhà máy:
(tấn/mẻ) = 1818.18 (kg/mẻ) Hoạt lực của enzyme α-amylase thương mại:
Tổng đơn vị hoạt lực chế phẩm enzyme thu đƣợc trên 1 mẻ nuôi cấy:
Tính toán cân bằng vật chất cho từng giai đoạn
Dựa vào tài liệu tham khảo, nhóm quyết định hiệu suất và tỷ lệ hao hụt của các quá trình
Hiệu suất chuyển hóa của quá trình sấy để thu chế phẩm enzyme là 98% Qua mỗi quá trình tinh sạch thì đảm bảo hoạt tính enzyme α-amylase không giảm
Tỉ lệ hao hụt trong quá trình sấy: 2%
Lƣợng sản phẩm sau quá trình sấy:
Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Hiền (2006), độ ẩm của vật liệu trước khi sấy cần được duy trì dưới 25%, cụ thể là 24% Sau quá trình sấy, độ ẩm của vật liệu sẽ được xác định theo các tiêu chí đã đề ra bởi Quản Lê Hà và Nguyễn Thị.
Theo quyển “Sổ tay quá trình và thiết bị công nghệ hóa chất tập 2”
Từ (2) => Lƣợng ẩm tách ra khỏi vật liệu:
Hiệu suất thu hồi đạt 98% nên sản phẩm trước khi sấy là:
Khối lƣợng riêng 𝜌 = 1070 kg/m 3 (Sổ tay quá trình thiết bị 1)
Tổng đơn vị hoạt lực thực tế thu được trước quá trình sấy:
= 7.42 × 10 12 (UI) 3.2.2 Quá trình ly tâm
Quá trình ly tâm để thu enzyme thô đạt hiệu suất chuyển hóa 95%, tuy nhiên, tỉ lệ hao hụt lên đến 5% do không thể tách hoàn toàn nước ra khỏi canh trường (Rajiv Datar, 1987)
Lượng sản phẩm trước khi ly tâm là :
Tổng đơn vị hoạt lực thực tế thu được trước quá trình ly tâm
= 7.81× 10 12 (UI) 3.2.3 Quá trình kết tủa
Tỉ lệ hao hụt khi kết tủa enzyme thô bằng muối Ammonium Sulfate ở nồng độ 60% dao động từ 3% đến 6% (King, 1972) Trong quy mô công nghiệp, các yếu tố liên quan đến thiết bị vận hành có thể ảnh hưởng đến tỷ lệ này, do đó, tỉ lệ hao hụt trung bình được khuyến nghị là 5%.
Hiệu suất chuyển hóa của quá trình kết tủa để thu nhận enzyme là 95% Lượng sản phẩm trước kết tủa:
Hoạt lực enzyme amylase thu được trước khi bước vào quá trình kết tủa:
3.2.4 Quá trình lọc bỏ sinh khối
Hiệu suất chuyển hóa của quá trình lọc để thu nhận enzyme là 90% (M.R.Bilada, 2013)
Tỉ lệ hao hụt trong quá trình lọc: 10%
Khối lượng trước lọc: M trước lọc
Khối lượng sau lọc: M sau lọc = M trước kết tủa = 2120.63 (kg/mẻ)
Hiệu suất thu hồi đạt 90% nên sản phẩm trước lọc là:
Hoạt lực enzyme amylase thu được trước khi bước vào quá trình lọc:
Để đạt năng suất 200 tấn/năm cho chế phẩm enzyme, quy trình bể lên men cần được thiết kế với năng suất thực tế là 2356,26 kg/mẻ Tỉ lệ hao hụt trong quá trình thu hồi enzyme cũng cần được tính toán, đảm bảo hoạt lực enzyme đạt 9.13 × 10^12 (UI).
Hiệu suất tạo thành sinh khối của quá trình lên men là Y XS = 0.55 g/g (Ikram-ul-Haq 2002)
Tốc độ tăng trưởng của Bacillus subtillis là μ = 0.58 h -1 (MICHAEL DAUNER, 2001)
Nồng độ sinh khối: X = 12.01 g/l (Ikram-ul-Haq 2002)
TÍNH TOÁN THIẾT BỊ
Tính toán thiết bị lên men
Với tỉ lệ hao hụt trong các quá trình tinh sạch nhƣ trên thì để đạt năng suất
200 tấn/năm thì ta cần thiết kế bể lên men để thu đƣợc năng suất kg/mẻ và tổng hoạt lực enzyme thu đƣợc là 9.13 x 10 12 UI
Nồng độ sinh khối trong canh trường nuôi cấylà X= 12.01 g/l (Ikram-ul-Haq 2002)
Hoạt tính enzyme lipase trong dịch canh trường sau khi nuôi cấy là
Hệ số chứa đầy của bể lên men là 70% (Gulati, 2011)
1g sinh khối sẽ tạo ra =
1 L canh trường sẽ có = 4000 x 1000 = 4 000 000 (UI)
Với tổng hoạt lực enzyme thu đƣợc là 9.13 × 10 12 UI thì thể tích bể lên men:
Khối lƣợng sinh khối sinh ra trong 1 mẻ lên men: m sinh khối =
Tỉ lệ cấy giống là 1% (w/v) cho bể nhân giống ban đầu và lấy dịch nhân giống cấy vào bể lên men với tỉ lệ 10% (v/v)
Thể tích bể nhân giống 1% (v/v):
Khi lựa chọn bể lên men, nên ưu tiên loại bể hình trụ làm từ thép không gỉ với đáy lồi Bên trong bể cần trang bị các cảm biến và đầu dò để theo dõi các thông số điều kiện nuôi cấy Ngoài ra, bể cũng nên có 2 cánh khuấy dạng mái chèo và ống sục khí để đảm bảo quá trình lên men diễn ra hiệu quả.
Với thể tích bể lên men lên đến 2282.5m³, việc thiết kế và xây dựng một bể duy nhất gặp nhiều khó khăn Do đó, giải pháp tối ưu là chia nhỏ thành nhiều bể hoạt động đồng thời.
Một bể có thể tích 120 m 3 phù hợp với quy mô công nghiệp và thích hợp với các thiết kế về tốc độ cánh khuấy (Lê Văn Hoàng, 2004)
Số bể lên men hoạt động là:
4.1.1 Tính toán thiết kế 1 bể lên men
Tổng thể tích 1 bể lên men:
Chọn tỉ lệ chiều cao (H T ) và đường kính (D T ) là 2:1 (Nguyễn
Thể tích bể hình trụ tròn:
Vậy đường kính của 1 bể lên men cần xây dựng là 5 (m) và chiều cao của bể là 10 (m)
Với thể tích nhân giống 22.83 m³, thiết bị nhân giống được lựa chọn là CCT-24000C, một bể lên men hình nón áp suất thấp có thể tích sử dụng 24.000 lít và tổng khối lượng 25.990 lít, phù hợp cho quá trình lên men và trưởng thành của bia, rượu táo, rượu, cũng như các loại đồ uống khác.
Số tank nhân giống với thể tích 4.06 m 3 là :
Hình 4.1 Thiết bị lên men CCT-24000C
Giả sử tỉ lệ đường kính cánh khuấy (D ck ) và đường kính bể (DT) là 0.3 (D ck = 0.3D T ) (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007)
Bốn vách ngăn cách đều nhau được thiết kế để ngăn chặn dòng xoáy, từ đó nâng cao hiệu suất pha trộn Chiều rộng của các vách ngăn thường đạt tỷ lệ 1/10 đường kính của bể, cụ thể là D vách ngăn = 1/10 D T (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007).
Chiều rộng của vách ngăn:
Chọn chiều cao của cánh khuấy bằng 0.2 đường kính cánh khuấy
Giả sử chiều rộng của cánh khuấy bằng 0.25 so với đường kính cánh khuấy
Chiều rộng của cánh khuấy:
Để thiết kế bể lên men hiệu quả, chiều cao bể cần được xác định, và việc trang bị cánh khuấy là rất quan trọng Khoảng cách giữa hai cánh khuấy cũng như khoảng cách từ cánh khuấy đầu tiên đến đáy bể nên được đặt ở mức 1,5 lần đường kính của cánh khuấy (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007)
Khoảng cách giữa 2 cánh khuấy = 1.5 x D ck = 1.5 x 1.5 = 2.3 (m)
4.1.3 Kiểm soát nồng độ oxy
Công thức tính tốc độ cung cấp oxy:
K L : hệ số truyền khối trong pha lỏng (m/s) a: tổng diện tích của các bọt khí trong bể lên men
C* OL : nồng độ oxy bão hòa trong pha lỏng cân bằng với pha khí
C OL : nồng độ oxy thực tế trong pha lỏng
Theo định luật Henry thì C* OL phụ thuộc vào áp suất riêng phần của oxy trong không khí và độ hòa tan của oxy
Áp suất riêng phần của oxy trong khí quyển được xác định bằng áp suất khí quyển là 1 atm Do tỉ lệ oxy trong khí quyển chiếm 21%, nên áp suất riêng phần của oxy được tính là p o = 0.21 atm.
Độ hòa tan của oxy trong pha lỏng của bể lên men được xác định là H o = 26.1 ml/L, theo bảng độ hòa tan của oxy trong nước dựa trên nhiệt độ và áp suất, như đã nêu trong Sổ tay QT & TB tập 1.
Cùng 1 mol oxy thì ta có thể tích của oxy V= 22.4 (L) và khối lƣợng mol oxy m = 32 (g)
Bể lên men có sử dụng cánh khuấy, nên hệ số truyền khối:
P S : công suất của cánh khuấy (W) V: thể tích lên men (L) u G : vận tốc bọt khí (m/s)
Theo tốc độ cánh khuấy trong các bể lên men vi sinh vật ở quy mô công nghiệp nằm trong khoảng 120 – 200 rpm (Lê Văn Hoàng,
Tốc độ của cánh khuấy:
Trong đó: Q: lưu lượng chất lỏng được khuấy trộn (m/s)
D ck : đường kính của cánh khuấy (m)
Mà lưu lượng chất lỏng được khuấy trộn:
V: thể tích lên men t m : thời gian để các phân tử khí trong môi trường được khuấy trộn 15(s)
Giả sử khối lượng riêng của canh trường là ρ 50 kg/m 3
Giả sử độ nhớt của canh trường là μ = 10 -2 Pa.s
> 10 5 Trong đó: Ni: tốc độ cánh khuấy (rad/s)
D ck : đường kính cánh khuấy (m) ρ: khối lượng riêng của canh trường (kg/m 3 ) μ: độ nhớt của canh trường (Pa.s)
Dòng chảy trong bể lên men thuộc dạng chảy rối
Chọn chuẩn số công suất của cánh khuấy máy chèo dạng chảy rối N p 0.35 (Bài giảng thiết kế bể phản ứng)
Trong đó: N p : chuẩn số công suất ρ: khối lượng riêng của canh trường (kg/m 3 )
N i : tốc độ cánh khuấy (rad/s)
D ck : đường kính cánh khuấy (m)
Chọn vận tốc bọt khí: u G = 0.04 (m/s) (Lê Văn Hoàng, 2004) Từ đó ta có hệ số truyền khối K L a: k L a = 2.10 -3 ( ) u G 0.2 = 2.10 -3 x (
Tốc độ truyền khối oxy cung cấp:
Công thức tính tốc độ sử dụng oxy
OUR = q O2 X Trong đó: q O2 : tốc độ sử dụng oxy riêng (mmol oxy/g sinh khối.h)
X: nồng độ sinh khối trong canh trường (g/L canh trường)
Theo quy luật: OTR OUR hay k L a (C* OL – C OL ) q O2
Xác định tốc độ sử dụng oxy riêng q O2 Trong đó: μ: tốc độ tăng trưởng riêng (h -1 ) y o : năng suất sinh khối tạo ra bởi 1 mol oxy (g sinh khối/ mol oxy)
Theo (Lê Văn Hoàng, 2004) thì ta có yo= 0.26 mol O 2 /g sinh khối y o =
Tốc độ sử dụng oxy riêng: q O2 =
Nồng độ sinh khối canh trường X = 12,01 (g/L)
Tốc độ sử dụng oxy:
OTR OUR vì vậy hệ thống cấp khí là phù hợp cho bể lên men và hoạt động của thiết bị.
Các thiết bị tinh sạch
Sau quá trình lên men, hỗn hợp thu được bao gồm sinh khối vi sinh vật và canh trường chứa enzyme cần thu nhận Để tách biệt sinh khối vi sinh vật khỏi canh trường, cần thực hiện quá trình lọc khung bản.
Giả sử khối lượng riêng của môi trường nuôi cấy vào thiết bị lọc là ρ = 1050 kg/m 3
Khối lƣợng sinh khối tạo ra sau quá trình lên men : m sk = kg
Bể lên men chính có thể tích lên men là V = 2282.5m 3 khối lƣợng tổng khi lên men đƣợc tính nhƣ sau: m lên men = ρ V = 1050 2282.5 = 2396625(kg)
Lượng canh trường thu được sau khi loại bỏ sinh khối theo lý thuyết: m canh trường = m lên men – m sinh khối #96625 – 27412.83 = 2369212.17kg)
Tỉ lệ hao hụt trong quá trình lọc đạt 3%, tương ứng với hiệu suất thu hồi 97% (Bilad et al., 2013) Điều này cho thấy sinh khối vi sinh sau khi lọc vẫn còn chứa một lượng nhất định.
1 lượng nhỏ canh trường enzyme, nên lượng canh trường thu được sau khi lọc là: m = m canh trường 97% = 2369212.17 x 0.97 = 2298135.81 (kg)
Nồng độ sinh khối thu đƣợc sau quá trình lên men X= 12.01 (g/l) =
Do khối lượng sinh khối trong canh trường là 12.01 kg/m 3 và khối lượng riêng của canh trường nuôi cấy là D = 1050 kg/m 3
Nên khối lượng riêng của canh trường sau khi loại bỏ sinh khối:
Thể tích canh trường thực tế thu được sau quá trình lọc có tính tỉ lệ hao hụt 3% (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007)
Tổng hoạt lực enzyme sau quá trình lọc khung bản HL 3 = (tính toán ở chương 4)
Hoạt lực enzyme trong canh trường sau khi lọc (hao hụt do quá trình lọc 3%):
Bảng 4.1 Thông tin thiết bị khung bản
Thông tin thiết bị Thông số
Tên thiết bị Máy ép khung bản 1500 x 1500mm
Kích thước tấm lọc 1500x1500x80mm
Thể tích lọc 7 - 40m 3 /h Áp lực làm việc 5 -7Bar Công suất động cơ 5.5kW
Hình 4.2 Thiết bị lọc khung bản MPF – 1500
Tổng thời gian cho một chu kì lọc:
: thời gian tháo bã, rửa cặn (s)
: thời gian dở tải và chuẩn máy móc (s)
Giả sử một chu kì (vòng) lọc sẽ mất khoảng 60 giây
Thể tích lọc 40m 3 /h mà thể tích lên men V= 2282.83 m 3 , để tiết kiệm thời gian cho quy trình sản xuất nên ta chọn thể tích lọc là 40000 L/h
Thời gian để lọc hết thể tích lên men:
Do nồng độ chất cặn (sinh khối) cao, sau 2 chu kỳ, cần tiến hành tháo bã một lần Thời gian cho mỗi lần tháo bã và rửa khung là 90 giây, do đó tổng thời gian tiêu tốn cho việc tháo bã và rửa khung sẽ được tính toán dựa trên số lần thực hiện.
Thời gian dở tải và chuẩn bị máy móc sau mỗi lần thải bã cho trung bình là 60s nên:
Tổng thời gian cần cho quá trình lọc là:
Với thời gian lên men là 3 ngày thì thời gian dành cho quá trình lọc 2.14 giờ là phù hợp
Số thiết bị lọc là: =
Mà với thời gian mỗi máy lọc làm việc là 2.14 thì chọn 2 máy lọc cho 2282.83m 3 là hợp lý
Sau khi lọc, ta có tổng lƣợng dung dịch cần kết tủa là 2298135.81 kg với thể tích 2214.02 m 3
Để đảm bảo hoạt tính enzyme, cần bổ sung muối ammonium sulphate vào dung dịch enzyme từ từ, kết hợp với khuấy trộn ở nhiệt độ thấp (4°C) cho đến khi đạt nồng độ muối bão hòa 60% Sử dụng thiết bị làm từ thép không gỉ để tránh hiện tượng ăn mòn trong suốt quá trình thực hiện.
Muối (NH4)2SO4 ở nhiệt độ 4°C có độ bão hòa 70%, tương đương với 70 g/100 ml nước Để đạt được 70% độ bão hòa (NH4)2SO4 cho 100 ml dịch enzyme thô, cần bổ sung 47.2 g (NH4)2SO4 và 100 ml dung môi.
Khối lƣợng (NH4) 2 SO 4 bổ sung vào bể kết tủa
Tổng khối lƣợng của bể kết tủa m kết tủa = M muối + m = 1045017.44 + 2298135.81 = 3343153.25 (kg)
Sau khi kết tủa xong, để dung dịch lắng trong 5 giờ, mục đích là tạo kết tủa hoàn toàn (Silvana Menoncin, 2010)
Quá trình kết tủa có tỉ lệ hao tổn trong chuyển hóa là 3%, do phản ứng kết tủa không hoàn toàn và còn một lượng enzyme nhỏ chưa kết tủa.
Thiết kế bể kết tủa enzyme:
(NH 4 ) 2 SO 4 có khối lƣợng riêng là 1770 kg/m 3 (Sổ tay QT và TB tập 1) nên với khối lƣợng muối (NH 4 ) 2 SO 4 chiếm thể tích là:
Thể tích bể kết tủa cần thiết kế:
V kết tủa = V sau lọc + V muối = 2214.02 + 590.41 = 2804.43 (m 3 )
Khối lượng riêng của canh trường sau kết tủa
Để dễ dàng trong thiết kế và điều khiển các thông số, bể kết tủa sẽ được chia thành nhiều bể nhỏ hơn với thể tích 120m³ mỗi bể, tương tự như bể lên men.
Giả sử hệ số chứa đầy của bể kết tủa là 75%
Gọi: H tủa là chiều cao hình trụ (m) h tủa là chiều cao nắp và đáy (m)
D tủa là đường kính bể kết tủa (m)
Các tỉ lệ về đường kính và chiều cao được thiết kế tương tự như bể len men
Chọn H tủa = 2 D tủa và h tủa = 0.1D tủa
Thể tích tổng của bể:
Trong đó: Vtrụ: thể tích của hình trụ
V đáy : thể tích của đáy bể
Thể tớch đỏy bể (hỡnh cầu), mỗi đỏy là ẵ thể tớch hỡnh cầu nờn 2 đáy là thể tích của một hình cầu:
Thể tích toàn bộ của thiết bị:
Vậy đường kính bể cần tìm là:
Từ đó ta có: H tủa = 8.48 (m) và h = 0.42 (m)
Thiết kế cánh khuấy cho bể kết tủa
Các tỉ lệ ta chọn tương tự như bể lên men chính:
Chiều rộng của vách ngăn
Chiều cao lƣỡi cánh khuấy:
Chiều rộng của cánh khuấy
4.2.3 Thiết bị ly tâm lạnh
Enzyme amylase dễ bị mất hoạt tính khi nhiệt độ quá cao, và quá trình ly tâm có thể tạo ra nhiệt, gây biến tính enzyme Để bảo toàn hoạt tính của amylase, cần thực hiện ly tâm ở nhiệt độ lạnh, dưới 5 độ C.
Bảng 4 1: Bảng thông tin thiết bị ly tâm lạnh
0 Đĩa Đường kính trong d 1 (mm)
Tốc độ quay (vòng/phút)
Tốc độ quay tối đa (vòng/phút)
Công suất động cơ ( kW) 55
Năng suất của máy (NS) (m 3 /h) 30
Trọng lƣợng máy ly tâm ( kg) 2500
Hình 4.3 Thiết bị ly tâm DHC630
Thể tích cần ly tâm là 2214.02 m 3 Mà 1 máy ly tâm liên tục dạng đĩa có năng suất ly tâm là 30 m 3 /h nên ta cần chọn 5 máy ly tâm
Thời gian cần ly tâm là:
Sau khi quá trình ly tâm kết thúc thì khối lƣợng enzyme trong canh trường là: 2416.76 kg (Theo chương cân bằng vật chất)
Nồng độ chất khô cần cho quá trình sấy phun enzyme phải lớn hơn 10%
(Lê Văn Hoàng, 2004), ta chọn nồng độ chất khô là 20%
Do vậy, khối lượng canh trường cần thu sau quá trình ly tâm để được nồng độ chất khô là 20% là
Thể tích canh trường trước khi ly tâm đạt 2214,02 m³ Với hiệu suất ly tâm là 95% (Rajiv Datar, 1987), quá trình này loại bỏ 95% lượng nước trong canh trường, dẫn đến thể tích canh trường thu hồi sau ly tâm chỉ còn 5%.
V canh trường sau ly tâm = 2214.02 0.05 = 110.70 (m 3 )
Hoạt lực enzyme trong canh trường sau quá trình ly tâm:
Khối lượng canh trường thu được sau quá trình ly tâm là 2416.76 kg (mục 3.1.1 chương cân bằng vật chất)
Nồng độ enzyme trong canh trường sau ly tâm:
Tốc độ ly tâm phù hợp cho việc thu hồi enzyme là 4500 vòng /phút (Lê
Tốc độ góc của máy ly tâm cần đạt: ω =
Trong đó: n - lƣợng đĩa, thiết bị DHC630 có 85 đĩa
- góc nghiêng tạo nên con đĩa, độ (chọn = 45 độ) r 0 và ri: bán kính ngoài và bán kính trong của đĩa (m)
Vận tốc dịch đi vào máy ly tâm
V: thể tích canh trường cần ly tâm (lít)
Vận tốc lắng của hạt:
Trong nghiên cứu này, khối lượng riêng của pha rắn (muối) và pha lỏng (enzyme và nước) lần lượt được xác định là r = 1770 kg/m³ và l = 1050 kg/m³ Đường kính quy đổi của hạt rắn được chọn trung bình là 0.6 μm, với kích thước tế bào dao động từ 0.25 - 1 μm Bán kính trống được xác định là ro = 0.4 m Cuối cùng, số vòng quay của đĩa được thiết lập ở mức ω = 4.500 vòng/phút.
Tính toán lựa chọn thiết bị sấy
Ta có lƣợng ẩm tách ra khỏi vật liệu trong quá trình sấy 550.24 (kg/mẻ)
Bảng 4 2: Thông số thiết bị sấy phun LPG-300 Đặc điểm Thông số
Năng suất (NS) 300 kg/h Nhiệt độ đầu vào 140-550 o C Nhiệt độ đầu ra 60-120 o C Hiệu suất chuyển hóa
Hình 4.4 Thiết bị sấy phun LPG - 300
Nhiệt độ tác nhân sấy đầu vào là (t 1 ) 160 0 C, nhiệt độ tác nhân sấy đầu ra (t 2 ) là 85 0 C (Waze Aimée Mireille Alloue, 2007)
Khối lƣợng chất khô (enzyme) thu đƣợc sau quá trình sấy với tỉ lệ hao hụt 2%: m chất khô = ( – ) = 1829.19 (kg)
Hoạt lực enzyme thu đƣợc sau quá trình sấy phun:
Tính toán các thông số cho quá trình sấy
Giả sử nhiệt độ không khí ngoài trời là t 0 = 30 0 C và có 70%
Chọn nhiệt độ đầu vào t 1 = 160 0 C và nhiệt độ đầu ra t 2 = 85 0 C
Từ t 0 = 30 0 C và = 70% tra giảng đồ Ramzim ta có d o = 0,018 kg ẩm/kg không khí khô
Khi đó enthalpy của hỗn hợp không khí ẩm trước khi vào calorifer là:
:nhiệt dung riêng của không khí khô, kJ/kg; (Ck = 1 kJ/kg)
: enthapy của hơi nước ở 0 0 C, kJ/kg; (r 0 = 2493 kJ/kg)
: nhiệt dung riêng của hơi nước, kJ/kg 0 C; (C h = 1.97 kJ/kg 0 C) t o : nhiệt độ không khí bên ngoài ( o C)
Enthalpy của hỗn hợp không khí trước khi vào buồng sấy t 1 160 0 C (với d o d 1 )
Trong đó: : nhiệt dung riêng của không khí khô (kJ/kg) t 1 : nhiệt độ đầu vào
: enthapy của hơi nước ở 0 0 C, kJ/kg; (r 0 = 2493 kJ/kg)
: nhiệt dung riêng của hơi nước, kJ/kg 0 C; (C h = 1.97 kJ/kg 0 C)
Trong quá trình sấy, enthalpy của không khí giữ nguyên, tức là H1 = H2 Sau khi không khí ra khỏi buồng sấy với nhiệt độ t2 = 85°C, giá trị enthalpy H2 đạt 210.55 kJ/kg.
Độ ẩm của không khí sau khi ra khỏi phòng sấy
= 0.047 (kJ/ kg không khí khô)
Lƣợng không khí khô cần để làm bay hơi 1kg ẩm: g k
= (kg kkk/ kg ẩm bay hơi)
Nhiệt lƣợng riêng tiêu tốn cho quá trình sấy: q s =
Công suất tiêu thụ của quá trình sấy:
Thiết kế thiết bị sấy
Giả sử ta chọn thời gian lưu của khí là 25 s và mật độ dòng khí ra là 0,98 kg/m 3
Ta có thể tích buồng sấy là:
Chọn thiết bị sấy có buồng sấy hình trụ với đường kính D, chiều cao H, đáy có dạng hình nón với góc nghiêng của hình nón và chiều cao là h
Thiết bị sấy có chiều cao
Giả sử: Đường kính = chiều cao (D = H) và góc = 60 o
Thể tích của buồng sấy:
Vậy đường kính buồng sấy là
Chiều cao của thiết bị sấy H sấy = 43.5 (m).
TÍNH HIỆU QUẢ KINH TẾ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO
Chi phí thiết bị và lắp đặt
8 Thiết bị nhân giống HG-FJ 200L 2 1.980 91.575.00
Tủ lạnh bảo quản mẫu Blood Bank A
Thiết bị chiếu sáng LP-50CODT 5 80 9.250.000
Chi phí lắp đặt =8% chi phí thiết bị 738.336.8
Tổng chi phí cho thiết bị và lắp đặt:
Tổng vốn đầu tƣ cho thiết bị phụ khác chiếm 5% chi phí thiết bị chính:
Tổng chi phí đầu tƣ cho lắp đặt và mua sắm toàn bộ hệ thống thiết bị:
T thiết bị = T TB chính + T TB phụ
Chi phí xây dựng các nhà xưởng
4 Khu xử lí rác thải 1 200 200
Tổng diện tích xây dựng 4.500
Tham khảo giá thuê đất 35.000VND/m 2 /tháng = 157.500.000 VNĐ Tổng chi phí thuê đất cho 1 năm = 1.890.000.000 VNĐ
Chi phí xây dựng các nhà xưởng 2.000.000 VNĐ/m 2 = 9.000.000.000
Tổng chi phí xây dựng nhà đất T xây dựng = 10.890.000.000 VNĐ
Xe nâng (nguyên liệu và thành phẩm)
Xe vận chuyển nguyên liệu+ hóa chất
3 Xe vận chuyển sản phẩm 2 400.000
4 Xe vận chuyển rác thải 3 300.000
Tổng chi phí vận chuyển
T CĐ = T thiết bị + T vận chuyển + T xây dựng
Chi phí sản xuất trực tiếp
Chi phí nhiên liệu trong 1 năm của nhà máy
TT Nhiên liệu Đ ơn vị Số lƣợng Đơn giá
2 Nước (sản xuất + sinh hoạt) m
Tổng chi phí nhiên liệu ( cập nhật ngày 2.6)
Chi phí nguyên liệu trong 1 năm
(kg) Đơn giá (VNĐ/kg)
Tổng chi phí nguyên liệu T nguyên liệu 5.485.927.500
TT Chức vụ Số lƣợng
Tiền thưởng tết = 1 tháng lương 299.500.000
Tổng quỹ lương nhân sự trong 1 năm 4.953.730.0
→ Tổng chi phí trực tiếp T TT = T nhân sự + T nguyên liệu + T nhiên liệu
TT Chi phí Thành tiền (VNĐ)
1 Chi phí xử lý môi trường = 2%
2 Bảo dƣỡng thiết bị = 10% *Chi phí thiết bị 670.305.875
3 Chi phí vận chuyển = 5% *Chi phí trực tiếp 573.911.250
4 Chi phí quảng cáo = 6% *Chi phí trực tiếp 688.693.500
Tổng chi phí sản xuất gián tiếp 2.162.475.125
Vốn lưu động = Chi phí trực tiếp + chi phí gián tiếp
Tổng vốn đầu tư = vốn cố định + vốn lưu động
Khấu hao 10 năm = 10% *Vốn cố định
Giả sử tiền đầu tƣ 100% vay vốn ngân hàng với lãi suất 14%/năm
Lãi vốn vay đầu tƣ = 14%* Vốn đầu tƣ
Tổng chi phí = Vốn lưu động+ Khấu hao + Lãi suất hằng năm
Lợi Nhuận và dòng tiền
Giá sản xuất 1kg enzyme
Giá bán sản phẩm ra thị trường
Giả sử công ty lấy lợi nhuận 50%
So với giá thị trường, sản phẩm enzym amylase có giá 14 USD/kg
Nên nhóm chọn giá sản phẩm là 180.000 VNĐ/kg
Tổng doanh thu trong 1 năm:
Lợi nhuận trước thuế = Doanh thu – VLĐ – Khấu hao
Thuế TNDN (20%) = mức thuế * lợi nhuận trước thuế
Lợi nhuận ròng = Lợi nhuận trước thuế - Thuế TNDN
Dòng tiền thuần = Lợi nhuận ròng + Khấu hao
Thời gian hoàn vốn : khoảng 17 tháng
Giá trị hiện tại thuần NPV:
CF t : dòng tiền thuần của dự án ở năm t
CF o : vốn đầu tƣ ban đầu của dự án n: tuổi thọ của dự án
(1 + r) t : tỉ lệ chiết khấu hay tỉ lệ hiện đại hóa
Tiêu chuẩn lựa chọn dự án dựa trên giá trị hiện tại ròng (NPV) rất quan trọng Nếu NPV < 0, doanh nghiệp nên từ chối dự án Khi NPV = 0, doanh nghiệp có thể xem xét lựa chọn hoặc từ chối Ngược lại, nếu NPV > 0, dự án được coi là khả thi và nên được thực hiện.
Giả sử: o Thời gian vận hành tính trong khoảng 10 năm o Hệ số chiết khấu 10% o Dòng tiền không đổi
Dòng tiền Hệ số chiết khấu 10%
NPV 1 > 0 => dự án nên đầu tƣ
Tỉ lệ hoàn vốn nội tại IRR:
Tỷ suất thu hồi vốn nội bộ (IRR) là lãi suất chiết khấu mà tại đó NPV của dự án bằng 0
Dựa theo công thức, ta tính đƣợc
Giả sử: o Thời gian vận hành tính trong khoảng 10 năm o Hệ số chiết khấu 15% o Dòng tiền không đổi
Dòng tiền Hệ số chiết khấu 15%
Từ đó ta có bảng thông số sau:
1 Abhishek Kumar Singh, M M (2012) Overview of Fungal Lipase:
A Review Appl Biochem Biotechnol doi:10.1007/s12010-011-9444-3
2 AltafAhmed Simair, A S Q., et (2017) Production and Partial Characterization of Hindawi Publishing Corporation doi:10.1155/2017/9173040
3 Biền Văn Minh (2008) Vi sinh vật công nghiệp Đại học Huế
4 Bilad, M R., Discart, V., Vandamme, D., Foubert, I., Muylaert, K.,
& Vankelecom, I F J (2013) Harvesting microalgal biomass using a magnetically induced membrane vibration (MMV) system: Filtration performance and energy consumption Bioresource Technology, 138,
5 Cihangir, N., & Sarikaya, E (2004) Investigation of lipase production by a new isolate of Aspergillus sp World Journal of Microbiology & Biotechnology, 20, 193-197
6 Da cam Kumar , L K., et (2012) Isolation, production and application of lipase/esterase from Bacillus sp strain DVL43 Journal of Microbiology and Biotechnology Research, tr 521 - 528
7 Đặng Thị Thu, & Ngô Tiến Hiển (2004) Nghiên cứu công nghệ sản xuất một số loại dầu béo bằng lipase Viện công nghệ thực phẩm
9 ) Fermentation and downstream processing of lipase from Aspergillus terreus Process Biochemistry 36(1-2), tr 146 - 155
10 Hoàng, L V (2004) Các quá trình và thiết bị Công nghệ Sinh học trong thực phẩm NXB Khoa học và Kĩ thuật Hà Nội
11 Ikram-ul-Haq , H A., Javed Iqbal, M.A Qadeer (2002) Production of alpha amylase by Bacillus licheniformis using an economical medium Department of Botany, GC University
12 King, T P (1972) Separation of proteins by ammonium sulfate gradient solubilization Biochemistry doi:10.1021/bi00753a010
13 Lê Văn Hoàng (2004) Các quá trình và thiết bị trong công nghệ sinh học NXB Khoa học và kỹ thuật
14 Lê Văn Việt Mẫn (2011) Công nghệ chế biến thực phẩm ĐH
15 M.R.Bilada, V D., et (2013) Harvesting microalgal biomass using a magnetically induced membrane vibration (MMV) system: Filtration performance and energy consumption Bioresource Technology, tr 329-338
16 MICHAEL DAUNER, T S., AND UWE SAUER (2001) Bacillus subtilis Metabolism and Energetics in Carbon-Limited and Excess-Carbon Chemostat Culture JOURNAL OF BACTERIOLOGY
17 Nguyễn Đức Lƣợng (2004) Công nghệ enzyme Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
18 Nguyễn Hoàng Lộc (2007) Giáo trình nhập môn công nghệ sinh học Đại học Huế
19 Nguyễn Thị Hiền (2006) Công nghệ sản xuất mì chính và các sản phẩm lên men cổ truyền Đại học Bách khoa Hà Nội
20 Phạm Thành Hổ (2005) Giáo trình Nhập môn công nghệ sinh học NXB Giáo dục Việt Nam
21 Quản Lê Hà, & Nguyễn Thị Hiền (2011) Công nghệ sản xuất axit amin và ứng dụng NXB Giáo dục Việt Nam
22 Rajiv Datar, C.-G R (1987) Centrifugal separation in the recovery of intracellular protein from E coli The Chemical Engineering Journal, tr 49-56
23 RK Saxena, A S., et (2003) Purification strategies for microbial lipases Journal of Microbiological Methods, tr 1-18
24 Silvana Menoncin, N M D (2010) Study of the Extraction, Concentration, and Partial Characterization of Lipases Obtained from Penicillium verrucosum using Solid-State Fermentation of Soybean Bran
