CHƢƠNG 2 LỰA CHỌN, PHÂN TÍCH, QUY TRÌNH SẢN XUẤT
2.4. Phƣơng pháp thu nhận enzyme ɑ-amylase
Dịch enzyme thô trong canh trƣờng sau khi lên men chứa những thành phần cơ bản nhƣ nƣớc chiếm khối lƣợng lớn nhất, protein khơng có hoạt tính sinh học, các tạp chất từ môi trƣờng nuôi cấy và các loại enzyme (hay protein có hoạt tính sinh học). Nhƣ vậy để thu đƣợc sản phẩm cuối cùng có nồng độ enzyme cần thiết cao thì cần phải loại bỏ các thành phần khác. (Nguyễn Đức Lƣợng, 2004) Lipase từ vi sinh vật chủ yếu là enzyme ngoại bào (RK Saxena, 2003), để sản xuất chế phẩm enzyme kỹ thuật thƣờng đƣợc sử dụng trong công
thức chất tẩy rửa, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp kết tủa là chính. Tuy nhiên, đối với một số ứng dụng trong ngành dƣợc phẩm, thực phẩm và da thì cần thêm các biện pháp tính sạch khác nhƣ sắc ký lọc gel, săc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực,...(Abhishek Kumar Singh, 2012)
Kết tủa là phƣơng pháp đƣợc sử dụng rất rộng rãi trong các nghiên cứu enzyme trong phòng thi nghiệm và sản xuất enzyme trong quy mô sản xuất công nghiệp, 80% công nghệ tinh sạch chế phẩm enzyme sử dụng phƣơng pháp kết tủa, trong đó kết tủa bằng muối ammonium sulphate chiếm 60%, kết tủa bằng ethanol, acetone hoặc axit (thƣờng sử dụng HCl) chiếm 35%. (RK Saxena,
2003)
Phƣơng pháp kết tủa muối dựa trên nguyên tắc là khi bổ sung muối vào dung dịch enzyme, muối sẽ lôi kéo các phân tử nƣớc chen giữa các phân tử protein, làm chuyển hóa điện tích và độ hịa tan của enzyme giảm nhanh và protein enzyme có thể kết tủa. Với mỗi enzyme sẽ có một khoảng nồng độ muối mà protein enzyme đó bị kết tủa hồn tồn là khơng giống nhau, vì vậy có thể
dùng muối để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng. (Đặng Thị Thu
& Ngô Tiến Hiển, 2004)
Ammonium sulphate khá rẻ và phổ biến, trọng lƣợng phân tử thấp và độ hịa tan rất cao, có khả năng giữ hoạt tính cho protein enzyme, tuy nhiên các thiết bị dễ bị ăn mòn bởi muối. Ngƣời ta thƣờng dùng muối ở dạng rắn, hòa tan từ từ vào canh trƣờng cho đến khi đạt nồng độ 30 – 70%, thực hiện ở nhiệt độ lạnh 4oC. (Da cam Kumar 2012)
Phƣơng pháp kết tủa bằng dung môi hữu cơ nhƣ ethanol, acetone, .... Khi cho dung môi vào dung dịch enzyme sẽ làm giảm hằng số điện môi của dung dịch, làm tăng lực hút tĩnh điện giữa các phân tử protein, làm cho các phân tử protein kết hợp lại tạo thành tủa. Enzyme rất nhảy cảm với nhiệt độ trong dung mơi hữu cơ. Tùy tính chất của từng loại protein enzyme, đƣợc tủa ở nồng độ dung môi hữu cơ khác nhau. (Đặng Thị Thu & Ngô Tiến Hiển, 2004)
Bảng 2.4: So sánh dung môi dùng để kết tủa enzyme
Nhận xét:
Xét về hiệu suất thu hồi: Từ dung dịch enzyme thô của hai nghiên cứu trên có hoạt tính enzyme gần nhƣ nhau, sau khi tiến hành tinh sạch bằng phƣơng pháp kết tủa phân đoạn với hai hóa chất khác nhau ta thấy đƣợc hiệu suất thu hồi cũng nhƣ hoạt tính enzyme sau kết tủa khi sử dụng Ammonium sulphate cao hơn so với ethanol. Mặt khác ta thấy kết tủa với Ammonium sulphate mất nhiều thời gian hơn, số mẻ thực hiện đƣợc sẽ ít hơn.
Xét về chi phí hóa chất: giá thành của ethanol cao hơn Ammonium sulphate, từ đó giá thành sản phẩm cũng cao hơn.
Ammonium
sulphate Ethanol
Hoạt tính trong dung dịch enzyme thô chƣa kết tủa (U/mg)
1,9 1,73
Hiệu suất thu hồi enzyme (%) 70 40,12
Hiệu quả tinh sạch (lần) 11,5 7,12
Thời gian (phút) 60 30 Chi phí hóa chất Amonium sulfate (NH4)2SO4: 1kg : 4 000 VNĐ Ethanol: 1lit : 20 000 VNĐ
Từ những so sánh trên chúng tôi lựa chọn phƣơng pháp kết tủa bằng muối ammonium sulphate để sản xuất ɑ -amylase.
QUY TRÌNH SẢN XUẤT
Hình 2.5. Sơ đồ quy trình cơng nghệ
Mơi trƣờng Len men Lọc khung bản Kết tủa enzyme Ly tâm Enzyme ɑ -amylase Giống B.subtillis Nhân giống Sấy phun Loại cặn
Thuyết minh quy trình
Nguyên liệu
Nguyên liệu đầu vào là mật rỉ đƣờng phụ phẩm từ ngành công nghiệp đƣờng, phải đảm bảo nguồn thu mua ngun liệu ổn định, giá thành hợp lí, có uy tín về chất lƣợng.
Chuẩn bị mơi trƣờng: các thành phần của môi trƣờng ở Bảng 2.1 đƣợc phối trộn vào nhau, sau đó đem mơi trƣờng vào thiết bị thanh trùng ở t = 121 oC trong 15 phút và làm nguội trực tiếp trong bể lên men xuống 30 oC.
Giống vi sinh vật
Giống sử dụng: nấm mốc Bacillus subtillis
Mục đích ni cấy: sinh nhiều enzyme ɑ - amylase có hoạt tính cao trong q trình lên men.
Q trình lên men
Mục đích là tạo điều kiện tối ƣu cho Bacillus subtillis sinh trƣởng và
sinh tổng hợp nhiều enzyme ɑ - amylase. Sử dụng môi trƣờng nuôi cấy mật rỉ đƣờng lên men chìm và ni cấy gián đoạn theo mẻ (đã phân tích).
Mơi trƣờng ni cấy và vi khuẩn sau khi nhân giống đủ số lƣợng sẽ đƣợc chuyển vào thiết bị lên men chính. Trong bể lên men có lắp đặt hệ thống cánh khuấy, hệ thống cung cấp oxy, hệ thống điều chỉnh pH, nhiệt độ để theo dõi các yếu tố ảnh hƣởng đến q trình lên men nhằm duy trì mơi trƣờng tối ƣu cho Bacillus subtillis tăng sinh và các sản phẩm phụ có thể
sinh ra gây ức chế vi sinh vật. Bacillus subtillis là sinh vật hiếu khí thì kiểm sốt nồng độ oxy cung cấp là rất cần thiết qua cánh khuấy và thiết bị cấp khí oxy giúp xáo trộn môi trƣờng để vi sinh vật phân bố đều trong bể, tăng diện tích tiếp xúc cơ chất-vi sinh vật.
Lọc tách sinh khối
Mục đích: loại bỏ sinh khối khỏi canh trƣờng, sử dụng dịch lọc (có chứa enzyme) vào các khâu sau.
Thiết bị sử dụng: lọc khung bản Cấu tạo:
Máy lọc ép khung bản là một thiết bị làm việc theo nguyên tắc nén áp suất. Thiết bị lọc gồm 2 phần chính, phần thứ nhất là bộ phận lọc và phần thứ 2 là bộ phận bơm để hút và nén dung dịch lọc qua vật liệu lọc.
Phần thứ nhất của thiết bị lọc bao gồm các khung và các tấm lọc (tấm vải lọc khung bản) đƣợc ép lại với nhau nhờ một đĩa quay bằng tay. Số tấm lọc sử dụng tối đa có thể đến 50 – 100 tấm. Tấm vải lọc khung bản hay còn
gọi là vải lọc khung bản này đƣợc làm bằng vật liệu polypropylene (PP), có độ bền, khả năng chịu trong mơi trƣờng hóa chất cao.
Phần thứ hai là bộ phận hút và nén dung dịch lọc gồm bơm nén áp suất cao và hai thùng chứa bằng thép không rỉ. Mỗi thùng có dung tích 200 lít, có chỉ thị mức dung dịch trong thùng. Một thùng đựng dung dịch đục (hỗn hợp lọc), một thùng đựng dịch lọc (Filtrat).
Ngồi ra, cịn có thùng thứ 3 cũng đƣợc nối với máy dùng để chứa hỗn hợp nƣớc và diatomit, chất này nhằm phủ lên màng lọc một lớp màng cho chất lỏng đi qua đƣợc dễ dàng.
Nguyên lý hoạt động:
Đây là thiết bị lọc áp lực làm việc gián đoạn nghĩa là nhập liệu vào liêu tục, nƣớc lọc tháo ra liên tục nhƣng bã đƣợc tháo ra chu kì.
Nó đƣợc cấu tạo chủ yếu là khung và bản. Khung giữ vai trò chứa bã lọc và là nơi nhập huyền phù vào. Bản tạo ra bề mặt lọc với các rãnh dẫn nƣớc lọc hoặc là các lỗ lọc.Khung và bản thƣờng đƣợc chế tạo dạng hình vng và phải có sự bịt kín tốt khi ghép khung và bản.Khung và bản đƣợc xếp liên tiếp nhau trên giá đỡ. Giữa khung và bản là vách ngăn lọc. Ép chặt khung và bản nhờ cơ cấu đai vít xoắn nhờ tay quay. Lỗ dẫn huyền phù nhập liệu của khung và bản đƣợc nối liền tạo thành ống dẫn nhô ra để ghép với hệ thống cấp liệu. Nƣớc lọc chảy ra từ bản qua hệ thống đƣờng ống và lấy ra ngoài. Bã đƣợc giữ lại trên bề mặt vách ngăn lọc và đƣợc chứa trong khung. Khi bã trong khung đầy thì dừng quá trình lọc để tiến hành rửa và tháo bã.Trong quá trình lọc, chất rắn trong huyền phù đƣợc giữ lại nhờ một lớp vật liệu lọc (vải lọc bùn khung bản).
Màng lọc hoạt động trên cơ chế chuyển động của các phần tử nƣớc nhờ lực nén của máy bơm tạo ra một dòng chảy mạnh. Trong khi đó, các phần tử cần lọc sẽ lọt qua mạng lọc với kích cỡ trung bình 0.001µm nhờ áp lực, với kích thƣớc này thì các thành phần nhƣ sinh khối, kim loại,…sẽ không qua đƣợc.
Kết tủa enzyme
Mục đích: Thu nhận enzyme có hoạt tính cao hơn.
Các bƣớc tiến hành: Bổ sung muối ammonium sulphate vào dung dịch enzyme một cách từ từ, kết hợp với khuấy trộn, quá trình kết tủa thực hiện ở nhiệt độ thấp (40C) để tránh làm mất hoạt tính enzyme cho đến khi đạt nồng độ muối bảo hòa 70% và giữ trong vòng 5 giờ, thiết bị sử dụng đƣợc làm từ thép khơng rỉ để tránh sự ăn mịn của muối. (Silvana Menoncin, 2010)
Mục đích: ly tâm tách riêng tủa protein với nƣớc, loại bỏ nƣớc và thu nhận tủa có chứa enzyme nồng độ cao.
Enzyme dễ bị mất hoạt tính ở nhiệt độ q cao, q trình ly tâm sẽ sinh ra nhiệt dễ gây biến tính enzyme. Để đảm bảo hoạt tính cho amylase nên thực hiện ly tâm lạnh ở nhiệt độ thấp (<5oC).
Sấy
Mục đích: giảm độ ẩm của chế phẩm enzyme, thƣờng độ ẩm sau khi sấy phải dƣới 10%. (Lê Văn Hoàng, 2004)
Cách tiến hành: sau khi kết thúc quá trình ly tâm hịa trộn cặn lắng thu đƣợc với 12% maltodextrin, 6% gum arabic và 1% CaCl2, sau đó chuyển hỗ hợp này vào thiết bị sấy phun liên tục, và thực hiện quá trình sấy ở 160 oC là nhiệt độ đầu vào, nhiệt độ đầu ra 85oC. (Waze Aimée Mireille Alloue,