CHƢƠNG 2 LỰA CHỌN, PHÂN TÍCH, QUY TRÌNH SẢN XUẤT
2.3. Lựa chọn phƣơng pháp nuôi cấy B.subtillis
Hiện nay có 3 phƣơng pháp dùng để nuôi cấy vi sinh vật gồm phƣơng pháp nuôi cấy gián đoạn, phƣơng pháp nuôi cấy liên tục bổ sung cơ chất và phƣơng pháp nuôi cấy liên tục.
Trong 3 phƣơng pháp này đều có ƣu và nhƣợc điểm riêng, nhƣng phƣơng pháp ni cấy liên tục có những ƣu điểm nhƣ hiệu suất sinh khối cao nhất, rút ngắn đƣợc thời gian lên men, giảm bớt đƣợc thể tích của toàn bộ thiết bị, thao tác đơn giản và thực hiện q trình tự động hóa, giảm bớt thời gian làm vệ sinh thiết bị khử khuẩn và làm nguội, mật độ tế bào đƣợc tạo ra cao do khả năng phục hồi và tái sử dụng tế bào. Ngoài ra, phƣơng pháp lên men liên tục có những hạn chế nhƣ cần điều kiện vơ trùng tuyệt đối vì trong q trình ni liên tục đã tạo ra môi trƣờng tối ƣu cho chủng nuôi cấy nhƣng các vi khuẩn khác có điều kiện tƣơng tự sẽ nhiễm vào, dễ bị nhiễm khuẩn và khó xử lí, cần nhân viên chun nghiệp có tay nghề cao để vận hành thiết bị, cần nhiều nguồn năng lƣợng cho quá trình vận hành và chi phí thiết bị cao cho tự động hóa.
Cịn đối với phƣơng pháp ni cấy gián đoạn bổ sung cơ chất hiệu suất thu hồi sinh khối sẽ ít hơn phƣơng pháp ni cấy liên tục. Tuy nhiên phƣơng pháp này có nguy cơ ngoại nhiễm rất cao trong giai đoạn bổ sung cơ chất vào mơi trƣờng. Vì vậy đối với phƣơng pháp này cần đội ngũ nhân viên có tay nghề cao và đảm bảo điều kiện vơ trùng tiệt đối ở các giai đoạn. Đối với phƣơng pháp này cần chi phí cao cho các trang thiết bị và vận hành thiết bị.
Đối với phƣơng pháp ni cấy gián đoạn thì hiệu suất thu hồi thấp hơn 2 phƣơng pháp còn lại. Tuy nhiên phƣơng pháp này đơn giản dễ vận hành và chi phí cho thiết bị thấp, vi sinh vật không bi ức chế bởi nồng độ môi trƣờng cao, phù hợp với quy mô công nghiệp mà không cần yêu cầu kỹ thuật quá cao. (Lê
Văn Hoàng, 2004)
Lựa chọn phƣơng pháp nuôi cấy ở quy mô công nghiệp phải đáp ứng các yếu tố về chi phí đầu tƣ trang thiết bị thấp, yêu cầu về trình độ nhân viên khơng quá cao, thiết bị đơn giản dễ vận hành và dễ khắc phục khi sự cố xảy ra...Từ đó, phƣơng pháp nuôi cấy B. subtillis phù hợp ở quy mô công nghiệp là nuôi cấy
gián đoạn.
Để đáp ứng nhu cầu của ngành cơng nghiệp, chi phí sản xuất thấp đƣợc ƣu tiên hàng đầu để sản xuất một enzyme nhƣ lipase. Cả hai hình thức lên men trạng thái rắn (SSF) và lên men chìm (SMF) đều có thể đƣợc sử dụng để sản xuất enzyme này. Nhƣng ở quy mô công nhiệp cần phải xác định hình thức ni cấy nào phù hợp.
Theo (Nguyễn Hồng Lộc, 2007) trong phƣơng pháp ni bề mặt, các vi sinh vật đƣợc cấy trực tiếp trên bề mặt môi trƣờng rắn hoặc lỏng. Đối với môi trƣờng rắn thì trƣớc khi ni cấy vi sinh vật, cần phải đƣợc làm ẩm. Các vi sinh sẽ sử dụng những chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng và oxy của khơng khí để hơ hấp, sinh trƣởng và phát triển. Nhằm giúp cho các vi sinh vật phân tán đều trên bề mặt môi trƣờng và có thể sử dụng đƣợc nhiều chất dinh dƣỡng sinh ra enzyme, những lớp môi trƣờng rắn cần phải mỏng (chỉ dày khoảng 2-5 cm), do đó chúng tiếp xúc trực tiếp với khơng khí nên đƣợc cung cấp đầy đủ oxy.
Phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt trên mơi trƣờng rắn với mục đích sản xuất enzyme thích hợp cho một số loại nấm mốc và vi khuẩn, một vài trƣờng hợp thì có thể dùng mơi trƣờng lỏng. Q trình ni cấy thƣờng đƣợc tiến hành trên các khay phẳng, xếp chồng lên nhau và ủ trong các buồng chứa vơ trùng kín, giống vi sinh vật đƣợc cấy vào bằng cách thổi bào tử vào bên trong buồng chứa. Môi trƣờng rắn thƣờng dùng các nguyên liệu tự nhiên nhƣ cám, gạo tấm, ngô, bã bia, bã củ cải đƣờng, khoai tây, lõi ngô… hoặc cũng có thể sử dụng hỗn hợp những nguyên liệu này. Môi trƣờng lỏng thƣờng là rỉ đƣờng, dịch thủy phân từ thóc mầm, nƣớc bã rƣợu… đồng thời còn có pha thêm muối khống. (Nguyễn
Hoàng Lộc, 2007)
Để đảm bảo các chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng đƣợc đầy đủ, ngƣời ta có thể bổ sung các nguồn N, P, K hoặc các chất sinh trƣởng (nƣớc khoai tây…). Độ ẩm thích hợp để ni cấy bề mặt trên khay hở đối với nhiều chủng nấm mốc là 58-60%. Tuy nhiên, vi khuẩn dễ phát triển ở độ ẩm 60%, dễ gây tạp nhiễm, khó thơng khí. Trƣờng hợp độ ẩm từ 45-50%, môi trƣờng nuôi cấy sẽ
tính của enzyme tạo thành. Trong thời gian nuôi cấy, nên giữ độ ẩm của mơi trƣờng ở 50- 60%, độ ẩm khơng khí phịng ni cấy ở 90-100%. Tuy rằng, nuôi cấy bề mặt không cần điều kiện vô trùng tuyệt đối nhƣng môi trƣờng nhân giống cần đƣợc vơ trùng để cho giống phát triển bình thƣờng quan trọng, nhất là giai đoạn đầu. (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007)
Trong sản xuất môi trƣờng rắn cần phải vô trùng ở 1-1,5 atm bằng hơi nóng trong 45- 60 phút. Nếu môi trƣờng trƣớc khi vô trùng đƣợc trộn với chlohydric acid hoặc sulfuric acid đến pH thích hợp, hay thêm một ít formalin hoặc một số chất sát trùng khác thì chỉ cần vô trùng dƣới ở 0,2-0,3 atm. Việc thêm acid và giữ môi trƣờng ở pH nhất định nhằm giúp cho enzyme đƣợc tạo ra nhiều hơn. Môi trƣờng đƣợc dàn mỏng ra các khay đã vô trùng dày khoảng 2- 2,5 cm, để nguội tới 30 o
C thì tiến hành cấy giống. Giống đƣợc nhân cũng theo phƣơng pháp bề mặt hoặc bằng bào tử thu đƣợc theo phƣơng pháp tách bào tử khỏi mơi trƣờng nhân giống, sau đó chúng đƣợc chứa vào các bình nút kín hoặc trong các túi. (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007)