Thiết kế mồi tổng hợp gen sản sinh α amylase từ chủng bacillus subtillis

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI BÁO CÁO THÍ NGHIỆM TIN SINH HỌC Thiết kế mồi tổng hợp gen sản sinh α-amylase từ chủng Bacillus subtillis GVHD: PGS.TS Nguyễn Văn Cách Phân tích đề • Quy trình tách dòng gen: Chủng Bacillus subtilis => Tinh thu DNA tổng số => PCR đoạn gen sản xuất α-amylase (đoạn gen đích) tạo số lượng đoạn gen đủ lớn => Tạo vector tách dòng gen Vậy để tách đặc hiệu đoạn gen đích ? => Cần thiết kế mồi đặc hiệu để PCR cho đoạn gen đích • Thiết kế mồi ảo => Đặt mua mồi dựa sở mồi thiết kế • Thiết kế mồi ảo dựa vùng bảo thủ từ khuôn ảo • Khn ảo trình tự Nu chủng Bacillus subtilis có quan hệ họ hàng gẫn gũi, điều kiện sinh trưởng tương đồng với điều kiện ta • Mượn trình tự Nu nhà khoa học nghiên cứu gene tổng hợp enzyme α-amylase từ Bacillus subtilis để tìm vùng bảo thủ chủng Bacillus subtilis • Thiết kế mồi, thực PCR ảo khn ảo • So sánh sản phẩm PCR ảo với kho liệu Database NCBI • Dự đốn tính trạng sản phẩm Tìm kiếm thơng tin chủng Bacillus subtilis sản xuất α-amylase sở liệu NCBI Chọn báo nghiên cứu Bacillus Subtilis có sản xuất enzyme α-amylase Bài báo • • • • Locus: DQ124370 Độ dài: 1977 bp Version: DQ124370.1 Strain: Bacillus subtilis 233 Bài báo • • • • Locus: KC113313 Độ dài: 1980 bp Version: KC113313 Strain: Bacillus subtilis AS01a Bài báo • • • • Locus: JQ768415 Độ dài: 1983 bp Version: JQ768415.1 Strain: Bacillus subtilis JN16 • Các đối tượng dùng tham khảo nghiên cứu thuộc loài Bacillus subtilis => Lựa chọn chủng làm khn ảo có họ hàng gần có điều kiện sinh trưởng phát triển tương đồng với điều kiện sinh trưởng chủng thực ta • Chọn chủng Bacillus subtilis strain AS01a – nghiên cứu Ấn Độ Sử dụng phần mềm Clustal Omega để tìm vùng cấu trúc bảo thủ từ chủng Đếm số thứ tự Nucleotide thuộc vùng mà ta chọn để thiết kế mồi + Chọn Nu bắt đầu thiết kế mồi xuôi từ Nu 7– 30 + Chọn Nu bắt đầu thiết kế mồi ngược 1977– 1954 Sử dụng phần mềm Primer-Blast NCBI để thiết kế mồi cho phản ứng PCR ảo Chạy chương trình, đưa kết cặp mồi Tiến hành PCR ảo với khuôn ảo cặp mồi ảo thứ – sử dụng phần mềm smsPCR Sản phẩm PCR ảo Kích thước sản phẩm PCR ảo 1977 bp Dựa vào phần mềm Blast NCBI, tiến hành so sánh sản phẩm PCR ảo với sở liệu Mục đích: Dựa vào tương đồng trình tự Nu mà phán đốn tương đồng tính trạng => Cụ thể: Xem xét sản phẩm PCR có trình tự tương đồng với chủng Bacillus subtilis sản xuất amylase không qua phán đốn có khả sản xuất amylase ? Tìm đọc thơng tin chủng có tương đông lớn với sản phảm PCR ảo KẾT LUẬN:  Sản phẩm thu qua thực chươn g trình PCR có khả biểu tính trạng sản xuất enzyme α- amylase  Kết thu mang tính tham khảo ban đầu mượn thêm trình tự để tìm vùng bào thủ, để có kết luận xác ta cần tiến hành tìm hiểu để đưa khn ảo tốt hơn, so sánh với nhiều trình tự nhiều báo khác Phương án tách dòng gen ảo Chọn vector tách dịng Chọn đoạn DNA insert (đoạn gen đích tách riêng PCR lên số lượng lớn) Lựa chọn enzyme thích hợp cắt nối thích hợp với vị trí vector Chèn đoạn DNA inseart vào vector Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ giữ gen (E.coli DH5α loại bỏ độc tính) Phân lập tế bào có chứa vector tái tổ hợp thị (kháng sinh, lac Z) Giữ giống glycerol đơng khơ Vector pCR2.1 • Thuộc nhóm vector Plasmid • Kích thước nhỏ, chép nhanh tế bào vi khuẩn, tạo số lượng lớn • Mạnh đa năng, phù hợp với nhiều RE khác với hàng chục trình tự nhận biết chúng nối tiếp thành đoạn dài gọi polylinker • Vùng polylineker gồm 13 trình tự nhận biết 13 enzymee cắt hạn chế tương tự vùng polylineker pUC19 => cho phép gắn xen trình tự DNA lạ nào, cho phép tạo dịng đoạn DNA có hai đầu dính khác mà khơng cần chất gắn Plasmid: pCR2.1 – 3929 bp Bài báo cáo em nhiều thiếu sót, mong nhận góp ý, bảo từ thầy bạn Em cảm ơn thầy bạn quan tâm lắng nghe ... ? => Cần thiết kế mồi đặc hiệu để PCR cho đoạn gen đích • Thiết kế mồi ảo => Đặt mua mồi dựa sở mồi thiết kế • Thiết kế mồi ảo dựa vùng bảo thủ từ khn ảo • Khn ảo trình tự Nu chủng Bacillus. .. sinh trưởng tương đồng với điều kiện ta • Mượn trình tự Nu nhà khoa học nghiên cứu gene tổng hợp enzyme α- amylase từ Bacillus subtilis để tìm vùng bảo thủ chủng Bacillus subtilis • Thiết kế mồi, ... vùng mà ta chọn để thiết kế mồi + Chọn Nu bắt đầu thiết kế mồi xuôi từ Nu 7– 30 + Chọn Nu bắt đầu thiết kế mồi ngược 1977– 1954 Sử dụng phần mềm Primer-Blast NCBI để thiết kế mồi cho phản ứng PCR