SẢN XUẤT ENZYME PROTEASE TỪ BACILLUS SUBTILIS VỚI NĂNG SUẤT 200 TẤN NĂM

Trước đây con người thường thu nhận enzyme từ thực vật và động vật, nhưngtrong thời gian gần đây cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, việc sửdụng vi sinh vật để sản xuất enzyme ngày càng phổ biến trên thế giới, được tiến hành ởmức độ công nghiệp, quy mô lớn với sản lượng hàng nghìn tấn mỗi năm. Bởi vì, các visinh vật phát triển rất nhanh và nhiều, ít tốn chi phí thức ăn, hệ enzyme phong phú và chohoạt tính sinh học cao.Protease là một enzyme thuộc nhóm hydrolasee xúc tác thủy phân protein đượcứng dụng rộng rãi trong: công nghiệp thực phẩm, y dược, công nghiệp thuộc da, nôngnghiệp… Trong các loại vi sinh vật, thì chủng Bacillus subtilis được sử dụng khá phổbiến. Bacillus subtilis là một vi khuẩn hình que, Gram dương và hiếu khí, phạm vi phânbố rộng giúp cho việc chọn mẫu và phân lập dễ dàng hơn. Đặc biệt chủng vi khuẩn nàycó khả năng sản sinh ra enzyme protease cao.Vì vậy chúng tôi chọn chủng Bacillus subtilis để sản xuất enzyme protease với sảnlượng 200 tấn năm.ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC công Type text Type text Type text BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM  KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỒ ÁN KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC SẢN.

CƠ SỞ LÝ THUYẾT

Tổng quan về Enzyme Protease

Protease, hay còn gọi là peptidase hoặc proteinase, là một nhóm enzyme có khả năng phân hủy protein thành các thành phần đơn giản hơn như chuỗi polypeptide ngắn và acid amin tự do Chúng hoạt động bằng cách cắt đứt các liên kết peptide (-CO-NH-), giúp quá trình tiêu hóa protein diễn ra hiệu quả hơn.

Dựa vào cơ chế xúc tác: Protease được phân chia thành 2 loại là endopeptidase và exopeptidase:

Exo-peptidase, còn được gọi là peptidase hay enzyme phân cắt đầu mạch, có chức năng thủy phân đầu tận cùng của chuỗi polypeptide Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại.

+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một acid amin ,một dipeptide hoặc tripeptide

+ Carboxypeptide: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một acid amin hoặc một dipeptide

Endo-peptidase, hay còn gọi là protease, là enzyme có khả năng cắt đứt các liên kết peptide bên trong chuỗi polipeptidase thông qua phản ứng thủy phân Dựa trên động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được phân loại thành bốn loại khác nhau.

Serin proteinase là các enzyme chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động, đóng vai trò quan trọng trong hoạt động xúc tác Nhóm này được chia thành hai tiểu nhóm: chymotrypsin và subtilisin Chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin và elastase, trong khi subtilisin gồm các enzyme vi khuẩn như subtilisin Carsberg và subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động hiệu quả ở pH kiềm và có tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.

Cysteine proteinase là loại enzyme có nhóm –SH trong trung tâm hoạt động, bao gồm các proteinase từ thực vật như papain và bromelain, cùng với một số protein động vật và ký sinh trùng Những enzyme này thường hoạt động hiệu quả trong môi trường pH trung tính và có tính đặc hiệu cơ chất khá rộng.

Aspartic proteinase là một nhóm enzyme tiêu hóa chủ yếu thuộc loại pepsin, bao gồm các enzyme như pepsin, chymosin, cathepsin và renin Nhóm enzyme này có đặc điểm là chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động hiệu quả nhất ở pH trung tính.

Metallo proteinase là nhóm enzyme proteinase được phát hiện ở vi khuẩn, nấm mốc và các vi sinh vật bậc cao hơn Chúng thường hoạt động hiệu quả trong môi trường có pH trung tính, tuy nhiên, hoạt động của chúng giảm mạnh khi tiếp xúc với EDTA.

Dựa vào cấu tạo của trung tâm hoạt động người ta chia enzyme làm 4 nhóm:

- Protease-serin (OH): trypsin, chymotrypsin, alastase, subtilisin,

- Protease -thiol (SH): Papain, bromelin, ficine,

- Protease-acide (COOH): Pepsin, rennin, trong trung tâm hoạt động có chứa asparagyl hay glutamyl

Dựa vào nguồn thu nhận enzyme có thể chia làm 3 loại:

- Protease động vật: Trypsin, chymotry psin, pepsin, rennin, …

- Protease thực vật: Papain, bromelin, ficine,

- Protease vi sinh vật: colagenase, protease acide, protease bazo, protease trung tính, (Đỗ Thị Thu Nga, 2012)

Protease được phân loại thành ba nhóm dựa trên hoạt tính ở các điều kiện pH khác nhau: protease acid, protease trung tính và protease kiềm tính Protease acid hoạt động hiệu quả nhất trong khoảng pH từ 2,0 đến 5,0, trong khi protease trung tính có pH tối ưu khoảng 7 Đối với protease kiềm tính, hoạt tính tốt nhất được ghi nhận khi pH lớn hơn 8, tức là trong môi trường kiềm (Khan et al., 2011).

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử protease

1.1.2 Cơ chế phản ứng của protease:

Các protease có 7 nếp gấp β và 9 vòng xoắn α, với trung tâm hoạt động là bộ 3 amino acid truyền thống Asp-His-Ser của serine protease Nhóm serine protease là nhóm peptidase lớn nhất, được tìm thấy ở mọi giới sinh vật như eukaryote, prokaryote, archaea và virus Tất cả các enzyme này đều có cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân thông qua hai bước chính.

Trong bước 1 của quá trình acyl hóa, liên kết cộng hóa trị được hình thành giữa nhóm -OH của serine và nguyên tử cacbon trong nhóm cacboxyl của phân tử cơ chất Quá trình này được hỗ trợ bởi nhóm imidazole từ histidine.

Bước 2 của quá trình khử acyl hóa diễn ra khi phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử H2O, ngược lại với bước đầu Trong giai đoạn này, nhóm imidazole thực hiện việc chuyển proton từ gốc -OH của serine cho nhóm amine, giúp tái sinh enzyme.

Phương trình phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cơ chế chung:

ES: phức chất enzyme – cơ chất

ES’: phức chất trung gian enzyme – cơ chất acyl hóa

P 1 : sản phẩm đầu tiên của chuỗi phản ứng (nhóm amin tự do mới được tạo thành)

P 2 : sản phẩm thứ 2 của chuỗi phản ứng (nhóm cacboxyl tự do mới được tạo thành)

1.1.3 Giá trị kinh tế của enzyme Protease:

Protease là enzyme công nghiệp chiếm thị phần lớn nhất thế giới, với giá trị 1,3 tỷ đô la Mỹ vào năm 1998 Hiện nay, protease được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, bao gồm sản xuất chất tẩy rửa, chế biến thực phẩm, thuộc da, dược phẩm và xử lý môi trường.

Protease là thành phần quan trọng trong mọi loại chất tẩy rửa, từ sản phẩm gia đình đến chất làm sạch kính, răng giả và kem đánh răng Enzyme này thường được ứng dụng nhiều nhất trong bột giặt, nhờ vào khả năng loại bỏ hiệu quả các vết bẩn từ thức ăn, máu và các chất tiết ra từ cơ thể con người Các protease thích hợp có tính đặc hiệu cơ chất rộng, giúp tăng cường hiệu quả làm sạch.

Ngành công nghiệp thuộc da trải qua nhiều công đoạn chế biến như ngâm ướt, tẩy lông, làm mềm và thuộc da Tuy nhiên, nhiều phương pháp thuộc da hiện nay sử dụng hóa chất độc hại như natri sulfide, gây ô nhiễm nghiêm trọng cho môi trường khi nước thải từ các nhà máy được thải ra sông Việc áp dụng enzyme để thay thế hóa chất độc hại đã chứng minh hiệu quả trong việc nâng cao chất lượng da và giảm thiểu ô nhiễm Đặc biệt, protease được sử dụng để thủy phân các thành phần phi collagen và loại bỏ protein phi fibrin như albumin, globulin, góp phần nâng cao hiệu quả trong quá trình thuộc da.

Protease kiềm từ Bacillus được sản xuất với số lượng lớn và có tính bền vững, hoạt động hiệu quả ở nhiệt độ và pH cao Chúng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, bao gồm xử lý phim X-quang đã qua sử dụng để thu hồi bạc, sản xuất nước mắm cá, chế biến thức ăn gia súc, xử lý chất thải từ động vật giáp xác, và xử lý rác thải tại các lò mổ gia cầm nhờ vào Bacillus subtilis.

1.1.4 Ưu điểm của enzyme protease sản xuất từ Bacillus:

Tổng quan về Bacillus subtilis

Vi khuẩn Bacillus subtilis là loại vi sinh vật hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, phân bố rộng rãi trong môi trường tự nhiên Chúng chủ yếu sống trong đất, rơm rạ và cỏ khô, do đó thường được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”.

Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, hình que, bắt màu tím Gram dương

Vi khuẩn có kích thước từ 0,5 – 0,8 µm đến 1,5 – 3 µm, tồn tại đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Chúng có khả năng di động và sinh bào tử hình bầu dục, kích thước từ 0,8 – 1,8 µm, phát triển bằng cách nảy mầm qua sự nứt bào tử Vi khuẩn này không kháng acid nhưng có khả năng chịu nhiệt ở 100°C trong 180 phút, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất và chất sát trùng Bào tử của chúng có thể sống từ vài năm đến hàng chục năm.

Vi khuẩn Bacillus subtilis là nguồn cung cấp quan trọng các enzym công nghiệp như amylase, protease, pullulanase, chitinase, xylanase và lipase Những enzym này không chỉ được sản xuất thương mại mà còn chiếm khoảng 60% tổng sản lượng enzym công nghiệp trên thị trường.

Hình 1.2 Hình thái của Bacillus subtilis

Vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng phát triển trong điều kiện hiếu khí và cả trong môi trường thiếu oxy Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng là 37 độ C, trong khi pH thích hợp dao động từ 7,0 đến 7,4.

LỰA CHỌN CÔNG NGHỆ

Lựa chọn phương pháp nuôi cấy Bacillus subtilis để sản xuất enzyme protease

Trong ngành công nghiệp sản xuất enzyme hiện nay, hai phương pháp chủ yếu được áp dụng là nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm Những phương pháp này được sử dụng để nuôi vi sinh vật nhằm thu được chế phẩm enzyme hiệu quả.

2.1.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt (phương pháp rắn, phương pháp nổi: solid state fermentation): (Đặng Thị Thu, 2018)

Vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường dinh dưỡng rắn đã được làm ẩm và vô trùng, thường bao gồm các nguyên liệu tự nhiên như cám gạo, khô cám, cám mỳ, tấm gạo và ngô, chiếm 90-95% tổng thành phần Để cải thiện độ xốp của môi trường, người ta thường bổ sung trấu nhỏ hoặc mùn cưa (khoảng 5-10%), giúp oxy không khí dễ thâm nhập và tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật.

Các nguyên liệu cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng như nitơ, cacbon, vitamin và muối khoáng cho vi sinh vật phát triển Để cải thiện môi trường dinh dưỡng, có thể bổ sung nitơ vô cơ như amonsulfat, natri nitrat, ure, hoặc nitơ hữu cơ như cao nấm men, cao ngô, dịch chiết malt, cùng với các chất cảm ứng phù hợp với từng loại enzyme Trước khi cấy vi sinh vật, cần làm ẩm môi trường đến 50-65% và thanh trùng ở 120°C để tiêu diệt vi sinh vật lạ, sau đó hạ nhiệt độ xuống 30-40°C và tiến hành cấy vi sinh vật, nuôi ở nhiệt độ 28-32°C trong 36-48 giờ, giúp tổng hợp hầu hết các enzyme.

 Ưu nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt:

- Phương pháp này cho nồng độ enzyme cao hơn phương pháp chìm

- Canh trường sau khi sấy khô vận chuyển dễ dàng

- Tránh được nhiễm trùng toàn bộ khối canh trường và ít tốn điện nãng

Phương pháp nuôi cấy hiện tại gặp phải nhiều hạn chế như tính gián đoạn, chiếm diện tích lớn và khó khăn trong việc cơ giới hóa cũng như tự động hóa Điều này dẫn đến năng suất thấp và yêu cầu nhiều lao động thủ công.

2.1.2 Phương pháp nuôi chìm (Phương pháp lỏng, phương pháp bề sâu: Liquid State fermentation) Ở phương pháp này người ta cho vi sinh vật phát triển trong môi trường dinh dưỡng lỏng, có sục khí liên tục Thành phần dinh dưỡng của môi trường lỏng thích hợp cho mỗi vi sinh vật để sinh tổng hợp ra một enzyme này hay enzyme khác là không giống nhau Nói chung môi trường dinh dưỡng phải có thành phần dinh dưỡng chính sau: Ở phương pháp nuôi chìm, sự tiết các enzyme vào môi trường xảy ra trong suốt quá trình phát triển

Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp nuôi cấy chìm cần đáp ứng các thành phần dinh dưỡng sau:

Nguồn carbon, hay nguồn năng lượng, chủ yếu được cung cấp từ các loại đường dễ đồng hóa như glucose, maltose, rỉ đường, hoặc tinh bột đã thủy phân sơ bộ Ngoài ra, nguồn carbon cũng có thể đến từ các hợp chất phi glucid như glycerol và các axit béo.

- Nguồn nitơ: có thể ở dạng vô cơ hoặc hữu cơ

+ Nitơ vô cơ : (NH4) 2 SO 4 , NaNO 3 ,( NH 4 )NO 3 , ure,…

Thành phần và tính chất của muối vô cơ không chỉ cung cấp nitơ mà còn ảnh hưởng đến giá trị pH của môi trường nuôi Khi nitơ ở dạng muối amon, ion amoni (NH4+) được vi sinh vật sử dụng, dẫn đến axit hoá môi trường do gốc anion còn lại Ngược lại, nếu nguồn nitơ là nitrat, việc sử dụng anion (NO3-) sẽ tạo ra ion kim loại tự do, gây kiềm hoá môi trường Do đó, việc lựa chọn nguồn nitơ vô cơ phù hợp cho vi sinh vật để tổng hợp enzyme là rất quan trọng.

+ Nitơ hữu cơ: Thường là nước chiết malt, nước chiết ngô, hoặc cao ngô, cao nấm men, pepton, bột cá, khô dầu

Muối khoáng và vitamin đóng vai trò quan trọng trong môi trường dinh dưỡng, ngay cả khi sử dụng nguyên liệu tự nhiên như bột, tinh bột và cellulose Để đảm bảo vi sinh vật sinh trưởng và phát triển tốt, cần bổ sung các muối vô cơ và vitamin thiết yếu như MgSO4 và K2HPO4.

KH 2 PO 4 , K 2 SO 4 , FeSO 4 , Vitamin B1, B 12 , Biotin

Dịch dinh dưỡng được đưa vào thùng lên men và được tiệt trùng bằng hơi nước nóng ở nhiệt độ 118-125 độ C trong khoảng 45-60 phút Sau đó, nhiệt độ được hạ xuống và bổ sung vi sinh vật, nuôi cấy trong 2-4 ngày dưới điều kiện sục khí liên tục và môi trường vô trùng Quá trình nuôi cấy chìm thường tạo ra nhiều bọt, vì vậy có thể sử dụng các chất hoạt động bề mặt như tween 20 hoặc axit oleic để phá bọt.

 Ưu nhược điểm phương pháp nuôi cấy chìm:

- Có tính liên tục tiết kiệm được điện tích sản xuất

- Dễ cơ giới hoá và tự động hoá, do đó năng suất cao

- Sử dụng hợp lý các chất dinh dưỡng của môi trường

- Enzyme thu được ít lẩn tạp chất

Song phương pháp chìm có một số nhược điểm:

- Nồng độ enzyme trong canh trường thấp, do đó phái cô đặc, nên giá thành cao

- Tốn nhiều điện năng do sục khí liên tục Khi không đảm bảo dược vô trùng tuyệt đối thì dễ xảy ra sự nhiễm toàn bộ khối môi trường

Phương pháp nuôi chìm được đánh giá là một phương pháp hiện đại và tiến bộ, với những ưu điểm và nhược điểm rõ ràng Chính vì vậy, phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi tại nhiều quốc gia phát triển.

Lựa chọn công nghệ

Cả nuôi cấy bề mặt (SSF) và nuôi cấy chìm (SLF) đều có thể sản xuất enzyme protease, mỗi phương pháp mang lại những ưu và nhược điểm riêng Để lựa chọn phương pháp phù hợp với yêu cầu về năng suất và hiệu quả kinh tế, như chi phí đầu tư thấp nhưng vẫn đạt được nồng độ enzyme cao, nhóm đã quyết định chọn nuôi cấy chìm (SLF).

Phương pháp nuôi cấy chìm không chỉ nâng cao hiệu suất mà còn tự động hóa quy trình, giúp giảm chi phí nhân công Bên cạnh đó, việc sử dụng phụ phẩm nông nghiệp làm vật liệu nuôi cấy vi sinh vật ở quy mô công nghiệp mang lại hiệu quả sản xuất và đáp ứng yêu cầu kinh tế.

Hiện nay, nuôi cấy liên tục đang được áp dụng rộng rãi trong công nghiệp để sản xuất sinh khối và các sản phẩm lên men Trong khi đó, sản xuất các chất trao đổi bậc một, bậc hai và enzyme thường được thực hiện theo phương pháp gián đoạn, tức là nuôi cấy theo mẻ.

Lựa chọn môi trường nuôi cấy

Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis với đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết là rất quan trọng để vi sinh vật phát triển và sinh enzyme hiệu quả Bên cạnh đó, giá thành của môi trường cũng cần được xem xét để đảm bảo tính khả thi trong sản xuất.

Bảng 2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis thu protease

Tỉ lệ nguyên liệu (w/v) Khối lượng (kg/mẻ)

- Môi trường pH kiềm (pH) được điều chỉnh bằng HCl/NaOH 1N ở nhiệt độ 37 0 C

- Tỉ lệ cấy giống là 5% (Muhammad Irfan, et al., 2010).

Quy trình công nghệ

Hình 2.3 Quy trình sản xuất enzyme protease từ Bacillus subtilis

Hấp khử trùng Làm nguội

- Giống Bacillus subtilis: được mua từ các công ty cung cấp giống vi sinh vật công nghiệp đã đạt chuẩn ATCC

Nhân giống vi khuẩn được thực hiện bằng cách cấy vào bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường dinh dưỡng đã khử trùng Vi khuẩn được cấy vô trùng từ một mẻ mới và cho phép phát triển ở 37°C trong 24 giờ trong máy lắc quay Sau 24 giờ, nuôi cấy vi khuẩn này được sử dụng làm giống cấy (SabaImtiaz, 2013).

2.4.2.2 Lên men chìm: Áp dụng phương pháp nuôi cấy chìm gián đoạn trong bể có cánh khuấy giúp môi trường được đảo trộn giúp vi sinh vật dễ dàng tiếp xúc với cơ chất trong môi trường nuôi cấy Ngoài ra có thể sử dụng các phụ phẩm nông nghiệp như bã đậu nành, cám gạo… để làm vật liệu nuôi cấy vi sinh vật ở quy mô công nghiệp Vừa có hiệu quả về sản xuất vừa đáp ứng được về mặt kinh tế

Tinh sạch enzyme là quá trình loại bỏ protein không phải enzyme, nước và các thành phần khác của tế bào khỏi enzyme Để tách enzyme từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật, phương pháp bề mặt được sử dụng Sau khi nuôi cấy, môi trường được đưa vào dung dịch đệm, dung dịch muối loãng hoặc nước với tỷ lệ thích hợp, sau đó khuấy đều và lắc trong thời gian nhất định Cuối cùng, dịch trong được thu bằng cách lọc hoặc ly tâm Trong sản xuất, nước máy thường được dùng để chiết rút với thể tích gấp hai lần thể tích môi trường, và quá trình chiết rút diễn ra trong 1 giờ.

 Mục đích : Loại bỏ sinh khối vi sinh vật ra khỏi canh trường

Phương pháp lọc khung bản sử dụng chênh lệch áp suất giữa hai bên vách ngăn để cho phép chất lỏng (canh trường) đi qua các lỗ mao dẫn, trong khi chất rắn (sinh khối vi sinh vật) được giữ lại bởi màng lọc.

Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4 là kỹ thuật phổ biến để loại bỏ protein tạp trong dịch enzyme, dựa trên sự khác biệt về khả năng kết tủa của các enzyme ở nồng độ muối xác định Các loại muối thường được sử dụng trong phương pháp này bao gồm (NH4)2SO4, Na2SO4 và MgSO4.

- Muối (NH 4 ) 2 SO 4 là tốt nhất vì nó không làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại enzyme

- Loại muối này lại rẻ và phổ biến

- Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bão hòa 767g/l ở 25ºC)

 Phương pháp: Kết tủa phân đoạn bằng muối ammonium sulfate (NH 4 ) 2 SO 4

Amoni sunfat rắn được thêm vào phần nổi phía trên không có tế bào để đạt độ bão hòa 80%, sau đó khuấy trong 1 giờ và để qua đêm ở 4 °C Kết tủa thu được được ly tâm ở 10.000 × g trong 15 phút, sau đó hòa tan trong dung dịch đệm Tris 20 mM (pH 8.8) và thẩm tách qua đêm ở 4 °C (Abdelnasser S S Ibrahim, 2015)

Mục đích của quá trình này là tách phần tủa chứa enzyme protease khỏi dịch canh trường bằng lực ly tâm Các thành phần có khối lượng phân tử lớn sẽ lắng xuống đáy, trong khi các thành phần nhẹ hơn sẽ nổi lên trên.

Có hai dạng ly tâm phổ biến là ly tâm dạng ống và ly tâm dạng đĩa Việc lựa chọn loại ly tâm phù hợp phụ thuộc vào nồng độ sinh khối vi sinh vật trong canh trương.

- Ly tâm dạng ống: sinh khối thấp hơn 1% (w/v)

- Ly tâm dạng đĩa: nồng độ sinh khối lớn

Với quy mô công nghiệp năng suất 200 tấn/ năm, áp dụng ly tâm dạng đĩa sẽ phù hợp hơn

Ngoài ra, Enzyme rất dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao nên áp dụng ly tâm ở nhiệt độ lạnh, tức < 5 o C

 Mục đích: là giảm độ ẩm của enzyme, đưa enzyme từ dạng dung dịch sang dạng bột để dễ dàng bảo quản và vận chuyển

 Phương pháp: áp dụng thiết bị sấy phun vì một số ưu điểm sau:

- Dễ kiểm soát quá trình sấy

- Nhiệt độ sấy thấp không ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme nên được áp dụng rộng rãi trong tất cả ngành công nghiệp.

CÂN BẰNG VẬT CHẤT

Cân bằng vật chất

Bảng 3.2 Tóm tắt hiệu suất các quá trình trong sản xuất enzyme protease

Quá trình Hiệu suất Tài liệu tham khảo

Lọc 96% Serpil Takac, et al., 2000

Kết tủa 89,7% Trần Quốc Hiền và cộng sự

Ly tâm lạnh 95% Rajiv Datar, et al., 1987

Sấy 98% Murray Moo-Young, et al.,1986

* Giả sử hiệu suất quá trình lên men là 95%

Chọn sản xuất enzyme protease với hoạt lực là 20000 UI/g

 Tổng hoạt lực thu được sau 1 mẻ nuôi cấy là:

Sinh khối đạt được sau quá trình lên men là 60 mg/ml (Zheng Yuguo, et al., 2001)

 Khối lượng sinh khối ban đầu là:

95 × 4% = 11536,20 (𝑔/𝑚ẻ) Khối lượng riêng của B subtilis 𝜌 = 1,250 (kg/m 3 ) (Moitinho Mda L, 1992)

Thể tích sinh khối ban đầu: 𝑉 𝑋 0 = 11536,20

 Khối lượng sinh khối sau lên men:

Thể tích sinh khối sau lên men: 𝑉 𝑋 𝑡 = 10959,39

 Lượng Enzyme sau quá trình lên men:

Menzyme sau lên men = Menzyme sau ly tâm×100

 Thể tích sau quá trình lên men:

Thể tích trước khi lọc :

𝑉 𝑡𝑟ướ𝑐 𝑙ọ𝑐 = 𝑉𝑠𝑎𝑢 𝑙ê𝑛 𝑚𝑒𝑛 = 51306,49 (𝐿) Thể tích trước sau lọc :

Hiệu suất quá trình là 89,7% (Trần Quốc Hiền và ctv)

Thể tích trước quá trình kết tủa là sản phẩm của quá trình lọc:

Khối lượng muối (NH 4 ) 2 SO 4 bổ sung vào là 50 - 60% thể tích enzyme

Chọn bổ sung 50% muối (NH4) 2 SO 4

 Khối lượng riêng của muối là 1,77 kg/L

Hiệu suất quá trình ly tâm là 95% (Rajiv Datar, et al., 1987)

𝑉𝑡𝑟ướ𝑐 𝑙𝑦 𝑡â𝑚 = 𝑉 𝑠𝑎𝑢 𝑡ủ𝑎 = 38010,97 (𝐿) Thể tích sau ly tâm:

Lượng sản phẩm sau quá trình sấy: Msau sấy = 1516 kg/mẻ

 Độ ẩm vật liệu trước quá trình sấy là: x 1 = 70% (Nguyễn Phú Thọ và ctv, 2011)

 Độ ẩm vật liệu sau khi sấy: x 2 = 5% (Nguyễn Phú Thọ và ctv, 2011)

 Lượng ẩm tách ra trong quá trình sấy là W

Theo tác giả Nguyễn Bin và cộng sự biên soạn trong “Sổ tay quá trình và thiết bị công nghệ hóa chất tập 2”

100 − 5 (1516 + 𝑊) → 𝑊 = 3284,67 𝑘𝑔/𝑚ẻ Hiệu suất quá trình sấy 98% (Murray Moo-Young, et al.,1986)

Do 𝜌dịch trước sấy ≈ 𝜌 enzyme nên lượng sản phẩm trước khi sấy là lượng sản phẩm sau khi ly tâm

98 = 4898,643 𝑘𝑔/𝑚ẻ Thể tích enzyme trước khi sấy là:

Tổng kết

Bảng 3.3 Tổng kết thể tích và hoạt lực enzyme qua các công đoạn của quy trình sản xuất

STT Công đoạn Hiệu suất (%) Thể tích của các quá trình (L)

TÍNH TOÁN THIẾT BỊ

Thiết bị nhân giống

Thể tích nhân giống bằng 4% thể tích lên men:

𝑉 𝑛ℎâ𝑛 𝑔𝑖ố𝑛𝑔 = 4% × 48043,48 = 1921,74 (𝐿) Giả sử hệ số lấp đầy của tank nhân giống cấp 1 là 80%

Do đó thể tích thiết bị nhân giống là

Vậy chọn thiết bị nhân giống SSG-3 (xuất xứ Trung Quốc) có hệ thống cánh khuấy và được làm bằng thép không rỉ với thể tích là 3 m 3

Thiết bị lên men

Thể tích lên men là: 𝑉 𝑙ê𝑛 𝑚𝑒𝑛 = 48043,48 (𝐿) = 48,04 (m 3 )

Chọn bể làm việc có hệ số chứa đầy 𝜑 = 0,8 (Nguyễn Bin và cs)

Vậy thể tích bể là:

0,8 Theo “Kỹ thuật các quá trình sinh học”

Chiều cao bể bằng 2 lần đường kính bể: H = 2D

Chọn đường kính cánh khuấy bằng 0,35 vì tỉ lệ đường kình cánh khuấy bằng 0,3 – 0,4 đường kính bể (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006)

Chiều rộng của vách ngăn bằng 1/10 đường kính bể (Nguyễn Hoàng Lộc,2006):

Chọn tỉ lệ đường kính vách ngăn và đường kính bể là 0,05

Khi lựa chọn trục khuấy với 3 bộ cánh khuấy, khoảng cách giữa cánh khuấy thứ nhất và thứ hai, cũng như đáy bể, cần phải bằng đường kính của cánh khuấy, cụ thể là 2,22m (Nguyễn Hoàng Lộc, 2006).

Với tổng thể tích lên men 48,04 m³, chúng ta chọn thiết bị lên men hình trụ có cánh khuấy, được làm bằng vật liệu thép không gỉ Các thông số tương ứng cho tổng thiết bị lên men sẽ được trình bày trong bảng sau.

Hình 4.5 Mô hình thiết bị lên men thu protease

Chọn công suất cánh khuấy P = 3,5 kW vì công suất cánh khuấy trung bình tương đương 1÷5 kW cho 1m 3 môi trường (Lê Văn Hoàng, 2007)

Vì chọn 3 cánh khuấy nên 𝑃 𝑆 = 3,5 × 3 = 10,5 𝑘𝑊

 Tốc độ cung cấp oxygen (OTR)

𝐶 𝑂𝐿 ∗ phụ thuộc vào nhiệt độ, áp suất và thành phần môi trường Ta có thể xác định 𝐶 𝑂𝐿 ∗ từ định luật Henrry:

Chiều cao bể 13 m Đường kính bể 6,5 m Đường kính cánh khuấy 2,3 m

Chiều rộng vách ngăn 0,62 m Đường kính vách ngăn 0,33 m

P0: áp suất riêng phần của oxy trong bọt khí Mà thành phần thể tích của oxy trong không khí là 21% ⟹ 𝑃 0 = 0,21 𝑎𝑡𝑚

H0: độ tan của oxy trong phần lỏng của dịch lên men Vì lên men ở 30ºC nên ta có

H0= 37,1 mg/L.atm -1 (Công nghệ tế bào, Nguyễn Hoàng Lộc)

Chọn 𝐶 𝑂𝐿 = 20% 𝐶 𝑂𝐿 ∗ (Abdul Hameed, et al., 1999)

 Tốc độ sử dụng oxygen (OUR)

Khối lượng sinh khối sau lên men:

𝑚ẻ) = 0,205 𝑔/𝐿 Tốc độ sử dụng oxy riêng của Bacillus Subtilis là 2691 mg/g.h -1 (Maria Delia Pastor, et al., 2001)

Hệ thống thiết kế OTR > OUR đảm bảo cung cấp đủ oxy trong suốt quá trình lên men trong bể phản ứng, hỗ trợ sự sinh trưởng của vi sinh vật và tối ưu hóa lượng enzyme được tiết ra.

Chọn thiết bị lọc khung bản với công suất 14 m 3 /h

Với tổng thể tích lọc là 51306,49(L) = 51,31 (m 3 )

 Thời gian lọc cho một mẻ là l = 3,67 (h)

Sau 2h tiến hành tháo bã 1 lần Thời gian cho một lần tháo bã và chuẩn bị thiết bị là 60 phút

 Thời gian tháo bã và chuẩn bị thiết bị là: 𝜏 2 = 3,67

2 × 60 = 110,1 (𝑝ℎú𝑡) ≈ 1,84 (ℎ) Tổng thời gian cần cho quá trình lọc là:

𝑇 = 𝜏 1 + 𝜏 2 = 3,67 + 1,84 ≈ 5,51 (ℎ) Theo sách quá trình và thiết bị trường ĐH công nghiệp thực phẩm:

Ta có tốc độ lọc: 𝑊 = 𝑉 đ −𝑉 𝑠

V đ , V s : lần lượt là thể tích lúc đầu và sau quá trình lọc (m 3 )

S: diện tích bề mặt lọc (m 2 )

 diện tích bề mặt lọc S = 𝑉 đ −𝑉 𝑠

14×5,51 = 162,99 (m 2 ) Với diện tích bề mặt lọc khá lớn nên sẽ sử dụng 41 tấm lọc với diện tích mỗi tấm lọc là 4 (m 2 )

Chọn thiết bị lọc khung bản đa lớp thép không gỉ lọc ép, thích hợp nồng độ thấp hơn 50% hoặc độ nhớt ít

Hình 4.6 Thiết bị lọc khung bản Bảng 4.5 Thông số thiết bị lọc khung bản

Theo tác giả Nguyễn Bin và cộng sự biên soạn trong “Sổ tay quá trình và thiết bị công nghệ hóa chất tập 2”:

V thiết bị : thể tích của thiết bị (m 3 )

V thân : thể tích thân thiết bị (m 3 )

V nắp : thể tích phần nắp hình chóp cầu (m 3 )

H: chiều cao thân thiết bị, với H = 2D

Thông tin thiết bị Thông số

Kích thước tấm lọc 400mm

Diện tích lọc 4 m 2 Áp lực làm việc 0,3 MPa

Công suất động cơ 2,2 kw

Chọn hệ số chứa đầy 0,8

Với tổng thể tích kết tủa là 40839,34 (L) = 40,84 (m 3 ) nên:

V thiết bị = V thân + V nắp Thể tích của thân thiết bị kết tủa: (Thân thiết bị hình trụ)

4 = 0,5πD 3 Thể tích nắp thiết bị kết tủa: ( Nắp thiết bị hình chóp cầu)

1500× 𝜋𝐷 3 ( với h= 0,1D) Vậy, thể tích tổng của thiết bị kết tủa là:

1500 = 0,51πD 3 Suy ra, đường kính của thiết bị:

Chiều cao thân thiết bị:

Chiều cao nắp thiết bị:

 H 0 = H + h = 6,34 + 0,37 = 6,71 (m) Để quá trình lên men diễn ra tốt hơn thì thiết bị kết tủa nên sử dụng thêm cánh khuấy:

Chọn tỷ lệ đường kính cánh khuấy bằng 1

Tỷ lệ chiều cao cánh khuấy so với đường kính cánh khuấy là 0,8 nên chiều cao cánh khuấy:

Vậy chọn thiết bị kết tủa có dạng hình trụ đứng bằng thiết bị thép không rỉ với các thông số được trình bày như bảng sau:

Bảng 4.6 Thông số thiết bị kết tủa (Lý thuyết) Đặc điểm Thông số (m) Đường kính thiết bị 3,17 Chiều cao thiết bị 6,71 Đường kính cánh khuấy 0,79 Chiều cao cánh khuấy 0,63

Thực hiện ly tâm lạnh ở nhiệt độ từ 4-6 o C để đảm bảo enzyme thu được không bị biến tính

Thể tích cần ly tâm là 38010,97 (L) ≈ 38,01 (m 3 )

Chọn thiết bị ly tâm liên tục dạng đĩa DHC-730, nhãn hiệu Zonelink.

- Năng suất ly tâm của máy là 35 m 3 /h

- Số vòng trên phút (rpm) được thực hiện để thu tủa là 4 500 vòng/phút

- Bán kính trong (r 1 ) và bán kính ngoài (r 0 ) của máy ly tâm lần lượt là 0,225m và 0,5m

- Tổng số đĩa (n) của máy ly tâm là 85

- Góc nghiêng giữa trục và đĩa (𝜃), chọn 𝜃 = 45 o

 Chọn năng suất ly tâm của máy ly tâm là 35 m 3 /h nên thời gian ly tâm 1 mẻ là:

 Lực ly tâm RCF: RCF = r x ω 2 g

60 = 150𝜋 r: bán kính ống ly tâm (m) g: gia tốc trọng trường (m/s 2 )

Trong đó: n số đĩa; 𝜃: góc giữa đĩa và trục ly tâm; r o , r i lần lượt là bán kính ngoài và trong của đĩa (m)

 Vận tốc dịch đi vào máy ly tâm:

457830,758 ≈ 0,083 (L/p) Với 𝑄 là thể tích canh trường cần ly tâm (L)

Trong đó: 𝜌 r = 1770 kg/m 3 và 𝜌 l = 1150 kg/ m 3 lần lượt là tỷ trọng pha rắn (muối) và môi trường (enzyme và nước)

Tế bào Bacillus subtilis cú đường kớnh từ 0,25 – 1 àm Chọn đường kớnh d = 0,5 àm

Vậy thực hiện quá trình ly tâm tách tủa bằng thiết bị ly tâm dạng đĩa DHC-

730 vật liệu trục (bowl) và các bộ phận khác tiếp xúc với chất lỏng được làm bằng thép không rỉ với các thông số thiết bị như sau:

Hình 4.7 Thiết bị ly tâm dạng đĩa DHC-730 Bảng 4.7 Thông số thiết bị ly tâm đĩa DHC-730

W: lượng ẩm được tách ra khỏi vật liệu sấy (kg/h) x 1 , x 2 : độ ẩm vật liệu trước và sau khi sấy (%) t 1 ,t 2 : nhiệt độ dòng kk đầu vào và ra ( o C)

Y 0 : hàm ẩm của không khí trước khi được đốt nóng

Y 1 , Y 2 : hàm ẩm của không khí trước và sau khi sấy ( kg ẩm/ kg kkk)

H 1 , H 2 : hàm nhiệt của vật liệu trước và sau khi sấy ( kJ/kg kkk)

Quá trình sấy enzyme được thực hiện với việc bổ sung 12,5% maltodextrin, giúp tăng khả năng chịu nhiệt cho enzyme Kết quả cho thấy, sau khi sấy, 85,2% hoạt tính enzyme vẫn được giữ lại (T A Costa-Silva & ctv, 2014).

- Lượng enzyme thu được sau quá trình sấy trong 1 mẻ là L 2 = 1516 (kg/mẻ)

Thể tích enzyme trước khi sấy là 4634,48 (L) = 4,634 (m 3 )

Ta có: Lượng ẩm tách ra khỏi vật liệu trong quá trình sấy:W = 3284,67 (kg/mẻ)

 Tính toán các thống số cho quá trình sấy

Chọn thiết bị sấy dạng phun LPG150 với lượng bốc hơi tối đa là 𝑤 ′ 0 (kg/h) có nhiệt độ đầu vào và ra thiết bị lần lượt là t 1 = 170 0 C, t 2 = 80 0 C

 Thời gian sấy cho một mẻ là: 𝑡 𝑠ấ𝑦 = 𝑊

Ta có: x 1 = 70%, x 2 = 5% (Nguyễn Phú Thọ và ctv, 2011)

*Giả sử: Nhiệt độ và độ ẩm tương đối của không khí trước khi được đốt nóng lần lượt là: t 0 = 30 o C, 𝜑 0 = 70 o C

Tra giản đồ Ramzin, ta có: Y 0 = 0,019 kg ẩm/ kg kkk, H 0 = 78,5 KJ/kg kkk

Ta có: Y 0 =Y 1 =0.019 (Kg ẩm/Kg.KKK)

- Nhiệt độ dòng không khí đi vào caloriphe: t 1 0C

Theo cân bằng hàm nhiệt trong quá trình bốc ẩm:

Ta có: H 1 =H 2 "9 (KJ/Kg.KKK)

Tra giản đồ Ramzim với t 2 C ( theo T A Costa-Silva & ctv, 2014) và H 2 "9

(KJ/Kg.KKK) Y2=0.053 (Kg ẩm/Kg.KKK)

- Nhiệt lượng riêng tiêu tốn cho quá trình sấy:

- Công suất tiêu thụ cho quá trình sấy:

- Giả sử thời gian lưu nguyên liệu: 𝜉 = 25(𝑠) = 0.007 (h)

H= 2D = 2,66 (m): chiều cao thân thiết bị (hình trụ) h= 1,5D = 2(m): chiều cao đáy thiết bị (hình chóp nón)

Bảng 4.8 Thông số thiết bị sấy dạng phun (lý thuyết) Đặc điểm Thông số Đơn vị

Nhiệt lượng riêng tiêu tốn cho quá trình sấy 4426,47 KJ/kg ẩm

Công suất tiêu thụ cho quá trình sấy 1844,36 kW

Thể tích thiết bị 4,65 m 3 Đường kính thiết bị 1,33 m

Chiều cao thân thiết bị 2,66

Chiều cao đáy thiết bị 2

Chọn thiết bị LPG-150 với kích thước dài x rộng x cao thiết bị lần lượt là: 7 x 5,5 x 7,2 (m)

Hình 4.8 Thiết bị sấy dạng phun LPG-150

Bảng 1.1: Tính toán chi phí thiết bị

STT Tên thiết bị Giá (VNĐ) Số lượng

1 Tủ mát bảo quản giống Sanaky inverter VH-358W3

2 Nồi hấp tiệt trùng tự động

3 Tủ cấy vi sinh SW - CJ-2FD (Tủ đôi)

6 Thiết bị lọc khung bản 25 000 000 2 50 000 000

7 Thiết bị kết tủa (AC-B-04) có cánh khuấy

8 Thiết bị ly tâm dĩa DHC400 414 000 000 2 828 000 000

10 Thiết bị đóng gói HST-30B 354 200 000 1 354 200 000

Chi phí lắp đặt thiết bị = 1% tổng chi phí thiết bị

STT Tên thiết bị Giá (VNĐ) Số lượng Thành tiền (VNĐ)

1.3 Chi phí nhà đất xây dựng:

Nhóm đã chọn khu vực Bình Dương, thành phố Hồ Chí Minh để thuê đất xây dựng Diện tích thuê là 1500 m² với mức giá 50.000 VNĐ/m² trong thời gian 10 năm.

 Tiền thuê đất là: 9 000 000 000 (VNĐ/năm)

Bảng 1.3: Chi phí nhà đất xây dựng

STT Tên công trình Diện tích

1 Khu vực sản xuất chính 200 1 750 000 350 000 000

5 Khu xử lý nước thải 100 1 500 000 150 000 000

T CĐ = Chi phí xây dựng + thiết bị vận chuyển + thiết bị + lắp đặt + thuê đất

 Chi phí nguyên liệu sản xuất: Ta có thể tích canh trường là 38814,52 (L) và một năm có 132 mẻ

Bảng 2.1: Chi phí nguyên liệu lên men trong một năm

Thành phần Khối lượng dùng trong

Giá thành (VNĐ)/kg Thành tiền (VNĐ)

(NH4)2SO4*: khối lượng muối bổ sung vào một mẻ là: m muối = V muối x 1,77 = 1536,32 x 1,77 = 358,9458048 (Kg)

Thành phần Khối lượng dùng trong 1 năm (kg)

Tổng chi phí nguyên liệu sản xuất một năm:

Chi phí nhiên liệu sản xuất:

Bảng 6: Chi phí nhiên liệu sử dụng trong 1 năm

STT Danh mục Đơn vị tính Số lượng Đơn giá

Bảng 7: Cơ cấu nhân sự của nhà máy

STT Chức vụ Số lượng Mức lương Tổng lương 1 tháng (VNĐ)

3 Phòng tổ chức – hành chính 4 8 000 000 32 000 000

6 Phòng kế toán – tài chính 3 8 000 000 24 000 000

Tổng lương nhân sự trong 1 năm: (14 tháng bao gồm lương thưởng lễ, tết)

Tổng chi phí sản xuất trực tiếp:

T SXTT = T nhân sự + Tnguyên liệu + T điện nước

2.2 Chi phí sản xuất gián tiếp:

- Chi phí bảo dưỡng máy móc thiết bị = 10% × vốn thiết bị

Tổng chi phí bảo trì: 689 612 204 + 329 100 000 = 1 018 712 204 (VNĐ)

Theo luật bảo hiểm y tế của Bộ y tế, doang nghiệp phải đóng bảo hiểm cho người sử dụng lao động là 21,5% tổng tiền lương:

2.2.3 Chi phí bên ngoài nhà máy:

- Chi phí quảng cáo marketing chương trình đặc biệt: 7% chi phí sản xuất trực tiếp:

- Chi phí vận chuyển: 5% x chi phí sản xuất trực tiếp

- Chi phí hoa hồng cho các đại lý: 10% chi phí sản xuất trực tiếp:

Tổng chi phí bên ngoài nhà máy:

= 593 034 762 + 423 596 258 + 847 192 516 = 1 863 823 536 (VNĐ) Tổng chi phí gián tiếp:

Tổng vốn lưu động 1 năm chưa tính lãi ngân hàng

= Chí phí trực tiếp + Chi phí gián tiếp

Tổng vốn đầu tư = vốn cố định + vốn lưu động

- Giả sử tiền đầu tư là 100% vay vốn ngân hàng

- Theo lãi suất vay vốn ngân hàng Agribank trung bình hiện nay 7%/ năm

- Lãi vốn vay đầu tư:

Khấu hao = 10% x Vốn cố định

Tổng chi phí hàng năm = vốn lưu động + khấu hao hàng năm + lãi suất hàng năm

Giá sản phẩm = chi phí 1 năm/ năng suất

*Giả sử công ty lấy lợi nhuận 50%

Giá bán sản phẩm = 114 219 + (114 219 x 0,5) = 171 329 (VNĐ)

Tham khảo giá enzyme protease trên thị trường, công ty Alibaba bán enzyme protease với giá 10$/ kg tương đương với 230 000 VNĐ/kg enzyme có hoạt lực 150 000 u/g

Nhóm sẽ chọn giá sản phẩm là 299 000 VNĐ/kg enzyme có hoạt lực enzyme là 200 000 u/g

Giả sử công ty bán được 95% sản phẩm/ năm

*Lợi nhuận trước thuế: (LNTT)

LNTT = (doanh thu- chi phí sản xuất- khấu hao)

Thuế doanh thu (TDT): 20% lợi nhuận trước thuế (2018)

Lợi nhuận sau thuế (lợi nhuận ròng) = Lợi nhuận trước thuế – thuế doanh nghiệp

= 23 175 990 090 – 4 635 198 017 = 18 540 792 070 (VNĐ) Dòng tiền (CF) = lợi nhuận sau thuế + khấu hao

Thời gian hoàn vốn = 𝑉ố𝑛 𝑐ố đị𝑛ℎ

18 540 792 070 + 2 298 712 204 = 1,1 Vậy thời gian hoàn vốn của dự án này là: 1 năm 1 tháng

Bảng thống kê chi phí đầu tư:

Tổng chi phí đầu tư 35 346 922 940

Thuế thu nhập doanh nghiệp 20%

Giá trị hiện tại thuần :

CF 0 là tiền đầu tư ban đầu (vốn cố định)

𝑛 𝑖=1 là tổng giá trị hiện tại của dòng tiền trong dự án n là tuổi thọ dự án r là hệ số chiết khấu

Giả sử vòng đời 10 năm

Năm Dòng tiền Hệ số chiết khấu Gía trị hiện tại

Sử dụng phần mềm excel ta được:

Tỉ lệ hoàn vốn nội bộ: IRR= 48% lớn hơn tỉ lệ chiết khấu ban đầu r=7%

Vậy: Dự án có thể thực hiện sau 10 năm

CHƯƠNG 6: ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG MÔI TRƯỜNG

Nước vệ sinh thiết bị và nhà xưởng, cùng với nước sinh hoạt, chiếm tỷ lệ lớn nhưng có độ sạch tương đối cao, với tải trọng ô nhiễm thấp Thành phần chính của nước thải bao gồm các hợp chất hữu cơ còn sót lại trong thiết bị, một lượng chất rắn lơ lửng và tạp chất vô cơ khác, cho phép thải ra môi trường mà không cần xử lý.

Nước thải từ quá trình nhân giống và nuôi cấy còn chứa tế bào sinh khối và dinh dưỡng, tạo điều kiện cho vi khuẩn gây mùi và ô nhiễm Để xử lý nước thải này trước khi thải ra môi trường, cần sử dụng hệ thống bùn hoạt tính.

Rác thải từ nhà máy chủ yếu bao gồm rác thải rắn phát sinh trong quá trình sản xuất, như vỏ bao bì hỏng và rác thải sinh hoạt của nhân viên Việc thu gom và phân loại rác tại nguồn là rất cần thiết trước khi chuyển đến nơi xử lý.

1 Tài liệu tiếng việt: Đỗ Thị Thu Nga, (2012), Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của một số chủng

Bacillus, NXB Trường ĐH Sư phạm Tp HCM Trang 7-9

GS.TS Đặng Thị Thu (Chủ biên), (2018) Giáo trình công nghệ enzyme, NXB

Trường Đại Học Bách Khoa, Hà Nội

Nguyễn Phú Thọ, Dương Thị Hương Giang, (2011) Nghiên cứu quy trình điều chế bột enzyme papain từ nhựa đu đủ Tạp chí Khoa học Trường đại học Cần Thơ 17b 158-166

Nguyễn Hoàng Lộc (2006) Công nghệ tế bào, NXB Đại học Huế

Công nghệ enzyme là một lĩnh vực quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng khoa học, được trình bày trong cuốn sách của Lượng (2004) và giáo trình của TS Bùi Xuân Đông Những tài liệu này cung cấp kiến thức chuyên sâu về công nghệ enzyme, phục vụ cho việc phát triển các ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp.

Morikawa, M (2006) "Hình thành màng sinh học có lợi bởi vi khuẩn Bacillus subtilis công nghiệp và các loài liên quan" Tạp chí Bioscience và Bioengineering, Vol.101,

Ngạch, T X (2007), Công nghệ enzyme, NXB Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng

Nghiên cứu của Perez, Abanes-De Mello và Pogliano (2000) tập trung vào vai trò của SpoIIB trong việc định vị các vị trí hoạt động của sinh vật đáy và ảnh hưởng của nó đến sự mỏng manh của phân rã trong quá trình chuyển hóa ở Bacillus subtilis Kết quả nghiên cứu được công bố trong Tạp chí Vi khuẩn học, cung cấp cái nhìn sâu sắc về cơ chế sinh học của vi khuẩn này.

Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn (2006) Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme protease từ ruột cá basa, Trường Đại Học Bách Khoa TPHCM

Trần Ngọc Hùng và Lê Phi Nga (2013) đã thực hiện nghiên cứu về việc tạo chế phẩm protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis, được đăng tải trong Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số 4 (11) Nghiên cứu này tập trung vào ứng dụng chế phẩm protease trong chế biến thức ăn cho gia cầm, với mục tiêu cải thiện chất lượng dinh dưỡng và hiệu quả tiêu hóa.

Tú, L N., Chử, L V., & Châu, P T (1982), Enzyme vi sinh vật NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội, tập 1

Abdelnasser S S Ibrahim, et al.,(2015) MA Khan, N Ahmad, AU Zafar, IA Nasir,

MA Qadir (2011) Isolation and screening of alkaline protease producing bacteria and physio-chemical characterization of the enzyme

A study by Abdul Hameed et al (1999) investigated the influence of dissolved oxygen tension and pH levels on the production of extracellular protease by a novel isolate of Bacillus subtilis K2 This research, published in the Journal of Chemical Technology and Biotechnology, highlights the potential applications of this enzyme in leather processing, emphasizing its significance in enhancing industrial processes.

Antao, CM, & Malcata,(2005), Plant serine proteases: biochemical, physiological and molecular features 638-639

Abdelnasser S S Ibrahim, et al.,, (2015) Detergent‑, solvent‑ and salt‑compatible thermoactive alkaline serine protease from halotolerant alkaliphilic Bacillus sp

NPST‑AK15: purification and characterization

John R Bourne, et al., (1992) Bioreactor Scale-upfor the Oxygen-SensitiveCulture

Bacillus subtilis The Influence of Stirrer Shaft Geometry Biotechnol Bog 8, 580-

Maria Delia Pastor, et al., (2001) Protease obtention using Bacillus subtilis 3411 and amranth seed meal medium at different aeration rates Brazilian Journal of Microbiology 32:6-9

Moitinho Mda L (1992) The evaluation of the specific gravity of Giardia duodenalis and Entamoeba coli cysts

Muhammad Irfan, et al., (2010) “Relationship of Process Parameters for the

Production of Alkaline Protease by Bacillus sp.” IJAVMS, Vol 4, Issue 4, 2010:114-

Murray Moo-Young, Kenneth F Gregory, 1986, “Microbial Biomass Proteins”, Elsevier Applied Science, USA Page 49

Rajiv Datar “Centrifugal separation in the recovery of intracellular protein from E coli” Industrial Biotechnology, Alfa-Laval AB, Box 500, S-147 00 Tumba Sweden

Trang | 53 downstream processing and properties of microbial alkaline proteases” Appl Microbiol Biotechnol, 60:381–395 389

R Gupta ã Q.K Beg ã P Lorenz, (2002) “Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications” Appl Microbiol Biotechnol, 59:15–32 21-22

Serpil Takac, et al., “Separation of the protease enzymes of Bacillus licheniformis from the fermentation medium by crossflow ultrafiltration” Journal of Chemical Technology and Biotechnology J Chem Technol Biotechnol,75:491- 499 (2000)

T A Costa-Silva & ctv, 2014 Characterization and spray drying of lipase produced by the endophytic fungus Cercospora kikuchii

T.P.King “Separation of protein by Ammonium Sulfate Gradient Solubilization” From the Rockefeller University, New York, New York 10021, Receiced September

Valeria F.Soares, et al., (2005) “High-Yield Bacillus subtilis Protease Production by Solid-State Fermentation”, Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol 121–124

Yu Y, Kim J, Hwang S, (2006) “Use of real‑time PCR for group‑specific quantification of aceticlastic methanogens in anaerobic processes: population dynamics and community structures”, Biotechnol bioeng, 93(3):424-433

Yuguo Z, et al., 2001 Production of Extracellular Protease from Crude Substrates with Dregs in an External-Loop Airlift Bioreactor with Lower Ratio of Height to Diameter

Trang | 54 Hình 1: Giản đồ Ranzim

Hình 2: Sơ đồ tổng quát nhà máy

Thiết bị kết tủa

Theo tác giả Nguyễn Bin và cộng sự biên soạn trong “Sổ tay quá trình và thiết bị công nghệ hóa chất tập 2”:

V thiết bị : thể tích của thiết bị (m 3 )

V thân : thể tích thân thiết bị (m 3 )

V nắp : thể tích phần nắp hình chóp cầu (m 3 )

H: chiều cao thân thiết bị, với H = 2D

Thông tin thiết bị Thông số

Kích thước tấm lọc 400mm

Diện tích lọc 4 m 2 Áp lực làm việc 0,3 MPa

Công suất động cơ 2,2 kw

Chọn hệ số chứa đầy 0,8

Với tổng thể tích kết tủa là 40839,34 (L) = 40,84 (m 3 ) nên:

V thiết bị = V thân + V nắp Thể tích của thân thiết bị kết tủa: (Thân thiết bị hình trụ)

4 = 0,5πD 3 Thể tích nắp thiết bị kết tủa: ( Nắp thiết bị hình chóp cầu)

1500× 𝜋𝐷 3 ( với h= 0,1D) Vậy, thể tích tổng của thiết bị kết tủa là:

1500 = 0,51πD 3 Suy ra, đường kính của thiết bị:

Chiều cao thân thiết bị:

Chiều cao nắp thiết bị:

 H 0 = H + h = 6,34 + 0,37 = 6,71 (m) Để quá trình lên men diễn ra tốt hơn thì thiết bị kết tủa nên sử dụng thêm cánh khuấy:

Chọn tỷ lệ đường kính cánh khuấy bằng 1

Tỷ lệ chiều cao cánh khuấy so với đường kính cánh khuấy là 0,8 nên chiều cao cánh khuấy:

Vậy chọn thiết bị kết tủa có dạng hình trụ đứng bằng thiết bị thép không rỉ với các thông số được trình bày như bảng sau:

Bảng 4.6 Thông số thiết bị kết tủa (Lý thuyết) Đặc điểm Thông số (m) Đường kính thiết bị 3,17 Chiều cao thiết bị 6,71 Đường kính cánh khuấy 0,79 Chiều cao cánh khuấy 0,63

Ly tâm lạnh

Thực hiện ly tâm lạnh ở nhiệt độ từ 4-6 o C để đảm bảo enzyme thu được không bị biến tính

Thể tích cần ly tâm là 38010,97 (L) ≈ 38,01 (m 3 )

Chọn thiết bị ly tâm liên tục dạng đĩa DHC-730, nhãn hiệu Zonelink.

- Năng suất ly tâm của máy là 35 m 3 /h

- Số vòng trên phút (rpm) được thực hiện để thu tủa là 4 500 vòng/phút

- Bán kính trong (r 1 ) và bán kính ngoài (r 0 ) của máy ly tâm lần lượt là 0,225m và 0,5m

- Tổng số đĩa (n) của máy ly tâm là 85

- Góc nghiêng giữa trục và đĩa (𝜃), chọn 𝜃 = 45 o

 Chọn năng suất ly tâm của máy ly tâm là 35 m 3 /h nên thời gian ly tâm 1 mẻ là:

 Lực ly tâm RCF: RCF = r x ω 2 g

60 = 150𝜋 r: bán kính ống ly tâm (m) g: gia tốc trọng trường (m/s 2 )

Trong đó: n số đĩa; 𝜃: góc giữa đĩa và trục ly tâm; r o , r i lần lượt là bán kính ngoài và trong của đĩa (m)

 Vận tốc dịch đi vào máy ly tâm:

457830,758 ≈ 0,083 (L/p) Với 𝑄 là thể tích canh trường cần ly tâm (L)

Trong đó: 𝜌 r = 1770 kg/m 3 và 𝜌 l = 1150 kg/ m 3 lần lượt là tỷ trọng pha rắn (muối) và môi trường (enzyme và nước)

Tế bào Bacillus subtilis cú đường kớnh từ 0,25 – 1 àm Chọn đường kớnh d = 0,5 àm

Vậy thực hiện quá trình ly tâm tách tủa bằng thiết bị ly tâm dạng đĩa DHC-

730 vật liệu trục (bowl) và các bộ phận khác tiếp xúc với chất lỏng được làm bằng thép không rỉ với các thông số thiết bị như sau:

Hình 4.7 Thiết bị ly tâm dạng đĩa DHC-730 Bảng 4.7 Thông số thiết bị ly tâm đĩa DHC-730

W: lượng ẩm được tách ra khỏi vật liệu sấy (kg/h) x 1 , x 2 : độ ẩm vật liệu trước và sau khi sấy (%) t 1 ,t 2 : nhiệt độ dòng kk đầu vào và ra ( o C)

Y 0 : hàm ẩm của không khí trước khi được đốt nóng

Y 1 , Y 2 : hàm ẩm của không khí trước và sau khi sấy ( kg ẩm/ kg kkk)

H 1 , H 2 : hàm nhiệt của vật liệu trước và sau khi sấy ( kJ/kg kkk)

Quá trình sấy enzyme được thực hiện với 12,5% maltodextrin nhằm tăng cường khả năng chịu nhiệt Kết quả cho thấy sau khi sấy, enzyme giữ lại được 85,2% hoạt tính (T A Costa-Silva & ctv, 2014).

- Lượng enzyme thu được sau quá trình sấy trong 1 mẻ là L 2 = 1516 (kg/mẻ)

Thể tích enzyme trước khi sấy là 4634,48 (L) = 4,634 (m 3 )

Ta có: Lượng ẩm tách ra khỏi vật liệu trong quá trình sấy:W = 3284,67 (kg/mẻ)

 Tính toán các thống số cho quá trình sấy

Chọn thiết bị sấy dạng phun LPG150 với lượng bốc hơi tối đa là 𝑤 ′ 0 (kg/h) có nhiệt độ đầu vào và ra thiết bị lần lượt là t 1 = 170 0 C, t 2 = 80 0 C

 Thời gian sấy cho một mẻ là: 𝑡 𝑠ấ𝑦 = 𝑊

Ta có: x 1 = 70%, x 2 = 5% (Nguyễn Phú Thọ và ctv, 2011)

*Giả sử: Nhiệt độ và độ ẩm tương đối của không khí trước khi được đốt nóng lần lượt là: t 0 = 30 o C, 𝜑 0 = 70 o C

Tra giản đồ Ramzin, ta có: Y 0 = 0,019 kg ẩm/ kg kkk, H 0 = 78,5 KJ/kg kkk

Ta có: Y 0 =Y 1 =0.019 (Kg ẩm/Kg.KKK)

- Nhiệt độ dòng không khí đi vào caloriphe: t 1 0C

Theo cân bằng hàm nhiệt trong quá trình bốc ẩm:

Ta có: H 1 =H 2 "9 (KJ/Kg.KKK)

Tra giản đồ Ramzim với t 2 C ( theo T A Costa-Silva & ctv, 2014) và H 2 "9

(KJ/Kg.KKK) Y2=0.053 (Kg ẩm/Kg.KKK)

- Nhiệt lượng riêng tiêu tốn cho quá trình sấy:

- Công suất tiêu thụ cho quá trình sấy:

- Giả sử thời gian lưu nguyên liệu: 𝜉 = 25(𝑠) = 0.007 (h)

H= 2D = 2,66 (m): chiều cao thân thiết bị (hình trụ) h= 1,5D = 2(m): chiều cao đáy thiết bị (hình chóp nón)

Bảng 4.8 Thông số thiết bị sấy dạng phun (lý thuyết) Đặc điểm Thông số Đơn vị

Nhiệt lượng riêng tiêu tốn cho quá trình sấy 4426,47 KJ/kg ẩm

Công suất tiêu thụ cho quá trình sấy 1844,36 kW

Thể tích thiết bị 4,65 m 3 Đường kính thiết bị 1,33 m

Chiều cao thân thiết bị 2,66

Chiều cao đáy thiết bị 2

Chọn thiết bị LPG-150 với kích thước dài x rộng x cao thiết bị lần lượt là: 7 x 5,5 x 7,2 (m)

Hình 4.8 Thiết bị sấy dạng phun LPG-150

Bảng 1.1: Tính toán chi phí thiết bị

STT Tên thiết bị Giá (VNĐ) Số lượng

1 Tủ mát bảo quản giống Sanaky inverter VH-358W3

2 Nồi hấp tiệt trùng tự động

3 Tủ cấy vi sinh SW - CJ-2FD (Tủ đôi)

6 Thiết bị lọc khung bản 25 000 000 2 50 000 000

7 Thiết bị kết tủa (AC-B-04) có cánh khuấy

8 Thiết bị ly tâm dĩa DHC400 414 000 000 2 828 000 000

10 Thiết bị đóng gói HST-30B 354 200 000 1 354 200 000

Chi phí lắp đặt thiết bị = 1% tổng chi phí thiết bị

STT Tên thiết bị Giá (VNĐ) Số lượng Thành tiền (VNĐ)

1.3 Chi phí nhà đất xây dựng:

Nhóm đã chọn khu vực Bình Dương, thành phố Hồ Chí Minh để thuê đất xây dựng với diện tích 1500 m² Giá thuê được xác định là 50.000 VNĐ/m² trong thời gian 10 năm.

 Tiền thuê đất là: 9 000 000 000 (VNĐ/năm)

Bảng 1.3: Chi phí nhà đất xây dựng

STT Tên công trình Diện tích

1 Khu vực sản xuất chính 200 1 750 000 350 000 000

5 Khu xử lý nước thải 100 1 500 000 150 000 000

T CĐ = Chi phí xây dựng + thiết bị vận chuyển + thiết bị + lắp đặt + thuê đất

 Chi phí nguyên liệu sản xuất: Ta có thể tích canh trường là 38814,52 (L) và một năm có 132 mẻ

Bảng 2.1: Chi phí nguyên liệu lên men trong một năm

Thành phần Khối lượng dùng trong

(NH4)2SO4*: khối lượng muối bổ sung vào một mẻ là: m muối = V muối x 1,77 = 1536,32 x 1,77 = 358,9458048 (Kg)

Thành phần Khối lượng dùng trong 1 năm (kg)

Tổng chi phí nguyên liệu sản xuất một năm:

Chi phí nhiên liệu sản xuất:

Bảng 6: Chi phí nhiên liệu sử dụng trong 1 năm

STT Danh mục Đơn vị tính Số lượng Đơn giá

Bảng 7: Cơ cấu nhân sự của nhà máy

STT Chức vụ Số lượng Mức lương Tổng lương 1 tháng (VNĐ)

3 Phòng tổ chức – hành chính 4 8 000 000 32 000 000

6 Phòng kế toán – tài chính 3 8 000 000 24 000 000

Tổng lương nhân sự trong 1 năm: (14 tháng bao gồm lương thưởng lễ, tết)

Tổng chi phí sản xuất trực tiếp:

T SXTT = T nhân sự + Tnguyên liệu + T điện nước

2.2 Chi phí sản xuất gián tiếp:

- Chi phí bảo dưỡng máy móc thiết bị = 10% × vốn thiết bị

Tổng chi phí bảo trì: 689 612 204 + 329 100 000 = 1 018 712 204 (VNĐ)

Theo luật bảo hiểm y tế của Bộ y tế, doang nghiệp phải đóng bảo hiểm cho người sử dụng lao động là 21,5% tổng tiền lương:

2.2.3 Chi phí bên ngoài nhà máy:

- Chi phí quảng cáo marketing chương trình đặc biệt: 7% chi phí sản xuất trực tiếp:

- Chi phí vận chuyển: 5% x chi phí sản xuất trực tiếp

- Chi phí hoa hồng cho các đại lý: 10% chi phí sản xuất trực tiếp:

Tổng chi phí bên ngoài nhà máy:

= 593 034 762 + 423 596 258 + 847 192 516 = 1 863 823 536 (VNĐ) Tổng chi phí gián tiếp:

Tổng vốn lưu động 1 năm chưa tính lãi ngân hàng

= Chí phí trực tiếp + Chi phí gián tiếp

Tổng vốn đầu tư = vốn cố định + vốn lưu động

- Giả sử tiền đầu tư là 100% vay vốn ngân hàng

- Theo lãi suất vay vốn ngân hàng Agribank trung bình hiện nay 7%/ năm

- Lãi vốn vay đầu tư:

Khấu hao = 10% x Vốn cố định

Tổng chi phí hàng năm = vốn lưu động + khấu hao hàng năm + lãi suất hàng năm

Giá sản phẩm = chi phí 1 năm/ năng suất

*Giả sử công ty lấy lợi nhuận 50%

Giá bán sản phẩm = 114 219 + (114 219 x 0,5) = 171 329 (VNĐ)

Tham khảo giá enzyme protease trên thị trường, công ty Alibaba bán enzyme protease với giá 10$/ kg tương đương với 230 000 VNĐ/kg enzyme có hoạt lực 150 000 u/g

Nhóm sẽ chọn giá sản phẩm là 299 000 VNĐ/kg enzyme có hoạt lực enzyme là 200 000 u/g

Giả sử công ty bán được 95% sản phẩm/ năm

*Lợi nhuận trước thuế: (LNTT)

LNTT = (doanh thu- chi phí sản xuất- khấu hao)

Thuế doanh thu (TDT): 20% lợi nhuận trước thuế (2018)

Lợi nhuận sau thuế (lợi nhuận ròng) = Lợi nhuận trước thuế – thuế doanh nghiệp

= 23 175 990 090 – 4 635 198 017 = 18 540 792 070 (VNĐ) Dòng tiền (CF) = lợi nhuận sau thuế + khấu hao

Thời gian hoàn vốn = 𝑉ố𝑛 𝑐ố đị𝑛ℎ

18 540 792 070 + 2 298 712 204 = 1,1 Vậy thời gian hoàn vốn của dự án này là: 1 năm 1 tháng

Bảng thống kê chi phí đầu tư:

Tổng chi phí đầu tư 35 346 922 940

Thuế thu nhập doanh nghiệp 20%

Giá trị hiện tại thuần :

CF 0 là tiền đầu tư ban đầu (vốn cố định)

𝑛 𝑖=1 là tổng giá trị hiện tại của dòng tiền trong dự án n là tuổi thọ dự án r là hệ số chiết khấu

Giả sử vòng đời 10 năm

Năm Dòng tiền Hệ số chiết khấu Gía trị hiện tại

Sử dụng phần mềm excel ta được:

Tỉ lệ hoàn vốn nội bộ: IRR= 48% lớn hơn tỉ lệ chiết khấu ban đầu r=7%

Vậy: Dự án có thể thực hiện sau 10 năm

CHƯƠNG 6: ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG MÔI TRƯỜNG

Nước vệ sinh thiết bị và nhà xưởng, cũng như nước sinh hoạt, thường chiếm một lượng lớn nhưng vẫn giữ được độ sạch tương đối, với tải trọng chất ô nhiễm không cao Thành phần chính của nước thải này bao gồm các hợp chất hữu cơ còn sót lại trong thiết bị, cùng với một lượng chất rắn lơ lửng và tạp chất vô cơ khác, cho phép thải ra môi trường mà không cần qua xử lý.

Nước thải từ quá trình nhân giống, nuôi cấy và ly tâm thu sinh khối vẫn chứa một lượng tế bào và dinh dưỡng, tạo điều kiện cho vi khuẩn gây mùi và ô nhiễm Để xử lý nước thải này trước khi thải ra môi trường, cần sử dụng hệ thống bùn hoạt tính.

Rác thải từ nhà máy chủ yếu bao gồm rác thải rắn phát sinh trong quá trình sản xuất, như vỏ bao bì hỏng và rác thải sinh hoạt của nhân viên Việc thu gom và phân loại rác tại nguồn là rất cần thiết, sau đó rác cần được chuyển đến nơi xử lý thích hợp.

1 Tài liệu tiếng việt: Đỗ Thị Thu Nga, (2012), Khảo sát khả năng sinh tổng hợp protease của một số chủng

Bacillus, NXB Trường ĐH Sư phạm Tp HCM Trang 7-9

GS.TS Đặng Thị Thu (Chủ biên), (2018) Giáo trình công nghệ enzyme, NXB

Trường Đại Học Bách Khoa, Hà Nội

Nguyễn Phú Thọ, Dương Thị Hương Giang, (2011) Nghiên cứu quy trình điều chế bột enzyme papain từ nhựa đu đủ Tạp chí Khoa học Trường đại học Cần Thơ 17b 158-166

Nguyễn Hoàng Lộc (2006) Công nghệ tế bào, NXB Đại học Huế

Công nghệ enzyme đang trở thành một lĩnh vực quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng khoa học Theo Lượng (2004), sách "Công nghệ enzyme" do NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh xuất bản, cung cấp những kiến thức cơ bản về enzyme và ứng dụng của chúng Bên cạnh đó, TS Bùi Xuân Đông cũng đã biên soạn giáo trình "Công nghệ enzyme" tại NXB Trường Đại Học Bách Khoa, Đà Nẵng, nhằm nâng cao hiểu biết và ứng dụng công nghệ enzyme trong các ngành công nghiệp khác nhau.

Morikawa, M (2006) "Hình thành màng sinh học có lợi bởi vi khuẩn Bacillus subtilis công nghiệp và các loài liên quan" Tạp chí Bioscience và Bioengineering, Vol.101,

Ngạch, T X (2007), Công nghệ enzyme, NXB Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng

Nghiên cứu của Perez, Abanes-De Mello và Pogliano (2000) đã chỉ ra rằng SpoIIB được định vị tại các vị trí hoạt động của sinh vật đáy sinh học, đồng thời xác định không gian quy định sự mỏng manh của quá trình phân rã trong chuyển hóa ở Bacillus subtilis Kết quả này được công bố trong Tạp chí Vi khuẩn học, tập 182.

Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn (2006) Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme protease từ ruột cá basa, Trường Đại Học Bách Khoa TPHCM

Trần Ngọc Hùng và Lê Phi Nga (2013) đã nghiên cứu việc tạo chế phẩm protease từ Bacillus subtilis, được công bố trong Tạp chí Đại học Thủ Dầu Một, số 4 (11), trang 31-32 Nghiên cứu này tập trung vào ứng dụng của protease trong chế biến thức ăn cho gia cầm, góp phần nâng cao hiệu quả dinh dưỡng và sức khỏe cho vật nuôi.

Tú, L N., Chử, L V., & Châu, P T (1982), Enzyme vi sinh vật NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội, tập 1

Abdelnasser S S Ibrahim, et al.,(2015) MA Khan, N Ahmad, AU Zafar, IA Nasir,

MA Qadir (2011) Isolation and screening of alkaline protease producing bacteria and physio-chemical characterization of the enzyme

Abdul Hameed et al (1999) investigated how dissolved oxygen tension and pH levels influence the production of extracellular protease from a novel Bacillus subtilis K2 isolate, highlighting its potential application in leather processing Their findings, published in the Journal of Chemical Technology and Biotechnology, demonstrate the significance of optimizing environmental conditions for enhancing enzyme production in biotechnological applications.