KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP đề tài: “Nghiên cứu tách chiết flavonoid Diếp cá Houttuynia cordata Thunb)”

LỜI CẢM ƠN Kết thúc bốn năm học tập nghiên cứu Viện Công nghệ Sinh học, trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam, đƣợc cho phép nhà trƣờng em tiến hành làm khóa luận với đề tài: “Nghiên cứu tách chiết flavonoid Diếp cá Houttuynia cordata Thunb)” Để hồn thành tốt luận không kể đến giúp sức quý Thầy Cô công tác giảng dạy Viện Công nghệ Sinh học, trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam, gia đình nhƣ bạn bè bên, đồng hành ủng hộ em suốt quãng thời gian dài Lời đầu tiên, cho phép em đƣợc gửi lời biết ơn sâu sắc chân thành đến cô giáo trực tiếp hƣớng dẫn khóa luận - Thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Hằng ngƣời Thầy khoa học định hƣớng tận tình bảo, truyền đạt cho em kiến thức kinh nghiệm quý báu cách nghĩ, tiếp cận cách giải vấn đề, tác phong làm việc, giúp đỡ em suốt thời gian thực tập tốt nghiệp hồn thành khố luận Em xin phép đƣợc gửi lời cảm ơn đến Thầy Cô giáo chị Nguyễn Thị Hồng Nhung Bộ môn Cơng nghệ Vi sinh Hóa sinh hỗ trợ tạo điều kiện trang thiết bị, điều kiện thực nghiệm cách tốt để em hồn thành khóa luận này.Đƣợc bảo tận tình ThS Nguyễn Thị Thu Hằng Thầy Cô Viện với sợ nỗ lực thân cố gắng để hoàn thiện luận văn này, song kiến thức,kinh nghiệm em hạn chế ,vậy nên báo cáo khoa học không tránh đƣợc sai sót, nhƣng mong thầy đóng góp ý kiến đánh giá, để báo cáo em đƣợc hoàn thiện Một lần em xin chân thành cảm ơn! i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu Diếp cá 1.1.1 Khái quát chung Diếp cá 1.1.2 Nguồn gốc đặc điểm thực vật 1.1.3 Thành phần hóa học 1.2 Tổng quan flavonoid 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Cấu trúc chung phân loại 1.2.3 Tính chất lý hóa 14 1.2.4 Tính chất sinh học flavonoid 14 1.3 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng sản xuất chất flavonoid 17 1.3.1 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng sản xuất giới 17 1.3.2 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng sản xuất nƣớc 17 PHẦN NỘI DUNG MỤC TIÊU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Vật liệu nghiên cứu 18 2.3.1 Vật liệu thực vật 18 2.3.2 Vật liệu vi sinh vật 19 2.3.3.Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật 19 2.4 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu 19 2.4.1 Thiết bị 19 ii 2.4.2 Dụng cụ 19 2.4.3 Hóa chất 20 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.5.1 Xác định độ ẩm tạo nguyên liệu bột Diếp Cá 20 2.5.2 Xác định phƣơng pháp tách chiết 21 2.5.3 Xác định loại alcohol thích hợp cho trình tách chiết 22 2.5.4 Xác định nồng độ dung môi 22 2.5.5 Tách chiết hợp chất flavonoid theo phƣơng pháp trích ly 23 2.5.6 Xác định có mặt flavonoid dịch chiết 24 2.5.7 Định tính flavonoid phƣơng pháp chạy sắc ký 25 2.5.8 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật flavonoidchiết xuất từ 26 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Xác định độ ẩm tạo nguyên liệu bột Diếp cá 27 3.2 Xác định phƣơng pháp tách chiết 28 3.3 Xác định loại Alcohol thích hợp cho q trình tách chiết 29 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng yếu tố công nghệ đến khả trích ly theo phƣơng pháp ngâm chiết 30 3.4.1 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ ethanol 30 3.4.2 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu / dung môi ethanol 32 3.4.3 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian chiết ethanol 34 3.5 Định tính chất Flavonoid có ngun liệu phản ứng hóa học 35 3.6 Định tính flavonoid sắc ký lớp mỏng 36 3.7 Khả kháng khuẩn cao flavonoid chiết xuất từ Diếp cá 38 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 4.1 Kết luận 40 4.2 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học Diếp cá Bảng 3.1 Kết xác định độ ẩm Diếp cá 27 Bảng 3.2 Kết xác định phƣơng pháp tách chiết 28 Bảng 3.3 Kết đo OD loại Alcohol 29 Bảng 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid 31 Bảng 3.5 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu / dung mơi ethanol đến hiệu suất trích ly 32 Bảng 3.6 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian chiết ethanol đến hiệu suất trích ly 34 Bảng 3.7 Kết định tính nhóm chất flavonoid chiết xuất từ Diếp cá 36 Bảng 3.8 Hoạt tính kháng số chủng vi sinh vật kiểm định dịch chiết Diếp cá 39 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hoa Diếp cá Hình 1.3 Thành phần alkaloid Diếp cá Hình 1.4 Cấu trúc flavonoid Hình 1.5 Cấu trúc Anthocyanidin Hình 1.6 Cấu trúc Flavan 3-ol Hình 1.7 Cấu trúc Flavan 3,4-diol 10 Hình 1.8 Cấu trúc Flavanon 10 Hình 1.9 Cấu trúc 3- Hydroxyflavanon 11 Hình 1.10 Cấu trúc flavon 11 Hình 1.11 Cấu trúc flavonol 12 Hình 1.12 Cấu trúc chalcon 12 Hình 1.13 Cấu trúc Dihydrochalcon 12 Hình 1.14 Cấu trúc Auron 13 Hình 2.1 Hình ảnh bột Diếp Cá 18 Hình 3.1 Lá Diếp cá bột Diếp cá 28 Hình 3.2 Dịch chiết loại Alcohol 29 Hình 3.3 Flavonoid thô thu đƣợc sau tách chiết 30 Hình 3.4 Biểu đồ ảnh hƣởng nồng độ ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid 31 Hình 3.5 Biểu đồ ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid 33 Hình 3.6 Biểu đồ ảnh hƣởng thời gian chiết ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid 35 Hình 3.7 Kết định tính flavonoid trích ly từ Diếp Cá 36 Hình 3.8 Kết chạy sắc ký mỏng flavonoid quan sát dƣới ánh sáng thƣờng (A) ánh sáng tử ngoại (B) 37 Hình 3.9 Hoạt tính kháng số chủng vi sinh vật kiểm định flavonoid 38 v ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới với nguồn dƣợc liệu phong phú đa dạng Hệ thực vật Việt Nam có 10000 lồi có khoảng 3200 loài thuốc Thuốc chữa bệnh thành phần thiếu đƣợc sống Từ xa xƣa nay,con ngƣời biết sử dụng cỏ vào điều trị bệnh Mặc dù loại thuốc tây y chiếm phần lớn phƣơng pháp điều trị nhƣng thuốc có nguồn gốc thảo dƣợc đứng vị trí quan trọng Trên giới, nguồn thực vật vô phong phú đối tƣợng nghiên cứu nhiều tác giả mục đích tìm kiếm chất có hoạt tính sinh học nhƣ tìm ngun liệu chữa bệnh Việc nghiên cứu thuốc nƣớc ta năm gần có nhiều bƣớc phát triển Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học loài thực vật giúp nhà khoa học tìm hiểu sâu sử dụng hiệu nguồn dƣợc liệu sẵn có đồng thời góp phần thúc đẩy ngành cơng nghiệp hóa dƣợc nƣớc phát triển, khoa học hóa Y học Cổ truyền Diếp cá loại thực vật đƣợc trồng phổ biến Việt Nam số nƣớc châu Á Trong đông y, Diếp cá đƣợc sử dụng thuốc để trị bệnh trĩ, mụn nhọt, lên sởi, đau mắt [12] Diếp cá đối tƣợng nghiên cứu nhiều tác giả khác đƣợc báo cáo có khả kháng khuẩn, kháng viêm, tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch chứa nhiều thành phần có hoạt tính sinh học cao, đặc biệt hợp chất thuộc nhóm flavonoid nhƣ rutin, quercetine [6] Các hợp chất có hoạt tính sinh học đƣợc nghiên cứu nhiều, đặc biệt hƣớng tách chiết chúng từ loại cỏ, thảo dƣợc ứng dụng vào y học Từ thực tế khóa luận tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu tách chiết hợp chất flavonoid Diếp cá Houttuynia cordata Thunb” hƣớng nghiên cứu cần thiết PHẦN TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu Diếp cá 1.1.1 Khái quát chung Diếp cá Cây Diếp cá cịn có tên Giấp cá, Giấp, Ngƣ tinh thảo Tên khoa học Houttuynia cordata Thunb Giới: Plantae Bộ: Piperales Họ: Saururacea Chi: Houttuynia Loài: Houttuynia Cordata 1.1.2 Nguồn gốc đặc điểm thực vật Diếp cá loại thảo, sống lâu năm, cao 20 – 40cm, thân ngầm, mọc bị ngang đất, màu trắng, có lơng, bén rễ mấu Thân đứng, nhẵn, màu lục tím đỏ Lá Diếp cá mọc so le hình tim, đầu nhọn, mặt màu lục sẫm, mặt dƣới màu tím, có lơng dọc theo gân hai mặt, gân 7; cuống dài, có bẹ, kèm có lơng mép Cụm hoa hình bơng dài – 2,5cm, mọc thân, mang nhiều hoa nhỏ màu vàng nhạt; dài 4-6cm, rộng 3-4cm, có 5-7 gân gốc [3] Hình 1.1 Hoa Diếp cá Hoa Diếp cá nở vào tháng – 8, cụm hoa hình bơng dài 2,5cm bao bắc màu trắng, chứa nhiều hoa nhỏ màu vàng nhạt Cây Diếp cá có tồn bề cụm hoa bắc giống nhƣ hoa đơn độ nang mở đỉnh, hạt hình trái xoan, nhẵn Diếp cá phân bố từ Nhật Bản, Trung Quốc tới Nêpan, Ấn Độ, nƣớc Đông Dƣơng Indonesia Ở Việt Nam mọc phổ biến, thƣờng gặp mọc hoang nơi ẩm ƣớt bãi ven suối, bờ sông Diếp cá loại rau quen thuộc bữa ăn hàng ngày gia đình Việt Nam, thƣờng dùng làm rau ăn sống, làm gia vị loại rau khác [3] 1.1.3 Thành phần hóa học Thành phần hóa học Diếp cá gồm có : flavonoid, tinh dầu, alkaloid số thành phần khác [2, 6] Bảng 1.1 Thành phần hóa học Diếp cá STT Thành phần hóa học Hàm lƣợng (trong 100g) Nƣớc 91,5g Protid 2,9g Glucid 2,7g Lipit 0,5g cellulose 1,8g Dẫn suất không protein 2,2g Kháng toàn phần 1,1g Vitamin C 68mg Carotene 1,26mg 10 Kali 0,1mg 11 Calcium 0,3mg Flavonoid Diếp cá có chứa thành phần flavonoid phong phú Các flavonoid ý Diếp cá kể đến nhƣ quercetin, quercetrin, isoquercetrin ngồi cịn số flavonoid không phần quan trọng -quercetin-3-O-β-D-galactosid-7-O-β-D-glucosid - quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranosid - kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1-6)-β-D-glucopyranosid - phloretin-2’-O-β-D-glucopyranosid (phloridzin) - quercetin-3-O-α-L-arabinofuranosid (avicularin) - quercetin-3-O- β-D-galactopyranosid (hyperin) Hình 1.2 Thành phần flavonoid Diếp cá Tinh dầu Thành phần chủ yếu tinh dầu Diếp cá nhóm aldehyd dẫn xuất ceton nhƣ methyl n-nonyl ceton (đây chất làm cho Diếp cá vị có mùi tanh), L-decanal, L-dodecanal Nhóm terpen bao gồm chất: α-pinen, camphen, myrcen, limonen, linalol, bornyl acetat, geraniol and caryophylen Ngoài ra, tinh dầu chứa acid caprinic, lauryl aldehyd, benzamid, acid hexadecanoic, acid decanoic, acid palmitic, acid linoleic, acid oleic, acid stearic, aldehyd capric, acid clorogenic, lipid vitamin K [10] Một số công bố gần cho thấy thành phần hàm lƣợng tinh dầu Diếp cá khác tuỳ theo nguồn gốc q trình phơi sấy khơ: 3.3 Xác định loại Alcohol thích hợp cho q trình tách chiết Loại alcohol dùng tách chiết yếu quan trọng trình tách chiết để đạt hiệu cao đƣợc thể Bảng 3.3 Bảng 3.3 Kết đo OD loại Alcohol Dung môi Trị số OD490nm Ethanol 2,906 Methanol 2,900 Butanol 1,364 Propanol 1,138 Hình 3.2 Dịch chiết loại Alcohol A Dịch chiết methanol B Dịch chiết propanol C Dịch chiết butanol D Dịch chiết ethanol Từ Bảng 3.3 cho thấy số đo OD490nm dịch chiết ethanol 2,906 propanol 1,138 cịn dịch chiết methanol có số đo OD cao gần băng ethanol nhƣng methanol có tích chất hóa học độc ethanol nên khóa luận chọn dung mơi ethanol dung mơi tách chiết 29 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng yếu tố công nghệ đến khả trích ly theo phƣơng pháp ngâm chiết 3.4.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ ethanol Dung môi chiết yếu tố quan trọng có ảnh hƣởng đến trình chiết xuất hợp chất tự nhiên có thực vật Cả hiệu chiết xuất hoạt tính chất chiết xuất phụ thuộc lớn vào dung môi nồng độ dung môi Việc lựa chọn nồng độ dung môi ảnh hƣởng trực tiếp đến việc hiệu suất tách chất khỏi ngun liệu Flavonoid hợp chất có tính phân cực mạnh thơng thƣờng sử dụng chất có độ phân cực mạnh nhƣ methanol, ethanol hay nƣớc làm dung mơi trích ly Flavonoid có khả hịa tan tốt methanol ethanol nhƣng methanol chất có độc tính cao nên đề tài tiến hành lựa chọn ethanol nồng độ khác để trích ly Kết nghiên cứu đƣợc thể Bảng 3.4 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.3 Flavonoid thô thu đƣợc sau tách chiết 30 Bảng 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid Nồng độ Khối lƣợng Trị số OD600nm Hàm lƣợng Hiệu suất trích flavonoid thu ly theo đƣợc (g) TLKTĐ(%) ethanol (%) bột Diếp cá(g) 50% 0,05 0,1174 2,348 ± 0,052 60% 0,16 0,1602 3,204 ± 0,066 70% 0,25 0,1685 3,370 ± 0,075 80% 0,46 0,1708 3,404 ± 0,084 90% 0,83 0,1726 3,452 ± 0,091 100% 0,90 1,757 3,514 ± 0,11 Hiệu suất trích ly theo TLKTĐ(%) Nồng độ ethanol 3.5 2.5 1.5 0.5 50% 60% 70% 80% 90% 100% Nồng độ ethanol Hình 3.4 Biểu đồ ảnh hƣởng nồng độ ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid 31 Kết Bảng 3.4 Hình 3.4 cho thấy trích ly nồng độ ethanol khác cho hiệu suất trích ly flavonoid khác dao động khoảng 2,348% - 3,514% Hiệu suất trích ly flavonoid tăng lên chiết nồng độ ethanol từ 50% -100%, ethanol 100% cho hiệu suất trích ly cao 3,514 % Vì nồng độ ethanol thích hợp để thực q trình trích ly flavonoid diếp cá 100% 3.4.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu / dung môi ethanol Q trình trích ly đƣợc thực dựa vào tính hòa tan tốt hoạt chất sinh học dung mơi hữu cơ, q trình chuyển khối có chênh lệch nồng độ ngun liệu dịng chảy bên ngồi (dung mơi) Vì để nghiên cứu hiệu suất trích ly flavonoid cần nghiên cứu ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu / dung môi, em tiến hành khảo sát tỷ lệ: nguyên liệu / dung mơi : 1/5, 1/10, 1/15, 1/20 Các kết thí nghiệm đƣợc thể Bảng 3.5 Hình 3.5 Bảng 3.5 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu / dung môi ethanol đến hiệu suất trích ly Tỷ lệ nguyên Hiệu suất trích Khối lƣợng bột Hàm lƣợng flavonoid diếp cá (g) thu đƣợc (g) 1/5 0,1295 2,590 ± 0,06 1/10 0,1757 3,514 ± 0,07 1/15 0,1801 3,602 ± 0,08 1/20 0,1851 3,702 ± 0,10 liệu: dung môi ethanol (g/ml) 32 ly theo TLKTĐ(%) Hiệu suất trích ly theo TLKTĐ(%) Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi 3.5 2.5 1.5 0.5 1:05 1:10 1:15 1:20 Tỷ lệ ngun liệu : dung mơi Hình 3.5 Biểu đồ ảnh hƣởng tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid Qua Bảng 3.5 Hình 3.5 cho thấy hiệu suất trích ly flavonoid tăng lên tỷ lệ: nguyên liệu / dung môi tăng Từ tỷ lệ 1/5 đến 1/10 hiệu suất trích ly tăng nhanh từ 2,590% lên 3,702% nhƣng từ tỷ lệ 1/10 lên 1/15 1/15 lên 1/20 hiệu suất trích ly tăng nhƣng khơng đáng kể Theo báo cáo tổng hơp kết đề tài cấp nghiên cứu quy trình cơng nghệ chiết tách flavonoid từ phế thải diếp cá, rau nhằm ứng dụng thực phẩm chức Lý Ngọc Trâm tỷ lệ nguyên nguyên liệu / dung môi ethanol thích hợp để trích ly flavonoid từ phế thải Diếp cá phƣơng pháp trích ly động nhiệt độ 60oC 1/10 đạt hiệu suất trích ly cao tỷ lệ nguyên liệu / dung môi 1/20, nhƣng để tiết kiệm dung môi hay để tăng hiệu kinh tế cho q trình trích ly chọn tỷ lệ nguyên liệu / dung môi 1/10 phù hợp tỷ lệ nguyên liệu / dung mơi tăng lên 1/20 hiệu suất trích ly flavonoid tăng lên khơng nhiều so với chi phí sản xuất 33 3.4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian chiết ethanol Theo lý thuyết thời gian trích ly dài hiệu suất thu nhận sản phẩm tăng nhƣng đến ngƣỡng thời gian định lƣợng sản phẩm thu đƣợc tăng lên khơng đáng kể, đồng thời ảnh hƣởng xấu đến chất lƣợng sản phẩm Do cần xác định thời gian trích ly thích hợp cho nguyên liệu Tiến hành nghiên cứu thời gian chiết ethanol giờ, 12 24 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian chiết ethanol đƣợc thể Bảng 3.6 Hình 3.6 Bảng 3.6 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian chiết ethanol đến hiệu suất trích ly Hiệu suất trích ly Khối lƣợng bột Hàm lƣợng Diếp cá (g) Flavonoid thu đƣợc (g) 0,1343 2,686 ± 0,08 12 0,1757 3,514 ± 0,09 24 0,1943 3,886 ± 0,12 Thời gian (h) 34 theo TLKTĐ (%) Hiệu suất trích ly theo TLKTĐ(%) Thời gian chiết ethanol 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 8h 12 h 24 h Thời gian chiết ethanol Hình 3.6 Biểu đồ ảnh hƣởng thời gian chiết ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid Từ kết Bảng 3.4.3 Hình 3.4.3 cho thấy hàm lƣợng flavonoid tăng theo thời gian chiết Thời gian chiết từ 8h đến 12h, hiệu suất trích ly flavonoid tăng cao từ 2,686% lên 3,886%, tiếp tục tăng thời gian từ 12h đến 24h hiệu suất trích ly flavonoid tăng 0,172% Chiết 24h cho hiệu suất trích ly cao chiết 12h Tuy nhiên, chiết 24 h lại tốn nhiều thời gian mà hiệu suất trích ly lại khơng tăng nhiều so với 12h áp dụng quy mơ cơng nghiệp khơng khả quan, để tiết kiệm thời gian, chi phí cho trình chiết nên chọn thời gian 24 h cho trình chiết ethanol Vì lựa chọn thời gian chiết ethanol 24 h 3.5 Định tính chất Flavonoid có ngun liệu phản ứng hóa học Tiến hành trích ly theo quy trình ngâm chiết thu đƣợc cao flavonoid tồn phần, hòa tan cao flavonoid thu đƣợc chế phẩm hòa tan ethanol Tiến hành phản ứng đặc trƣng phát nhóm chất flavonoid 35 Bảng 3.7 Kết định tính nhóm chất flavonoid chiết xuất từ Diếp cá Thuốc thử FeCl3 NaOH Màu phản ứng Xanh đen Vàng nâu A Flavonoid tác dụng với Fecl3 B Flavonoid tác dụng với NaOH Hình 3.7 Kết định tính flavonoid trích ly từ Diếp Cá Dựa vào màu sắc phản ứng Flavonoid qua Bảng 3.7 Hình 3.7 cho thấy phản ứng flavonoid với FeCl3 NaOH phản ứng tạo màu xanh đen phản ứng tạo màu vàng sáng phản ứng dƣơng tính với nhóm Flavonol 3.6 Định tính flavonoid sắc ký lớp mỏng Việc phân tích thành phần flavonoid sắc ký lớp mỏng đƣợc tiến hành mẫu flavonoid trích ly đƣợc từ Diếp cá Để phân tích thành phần flavonoid mỏng, sử dụng phƣơng pháp sắc ký mỏng chiều: đƣợc tiến hành mỏng Silicagel, chạy sắc ký chiều từ dƣới lên với hệ dung môi (etyl axetat: toluene: formic acid : nƣớc = 7: 3: 1,5: 1) Sau chạy sắc ký xong, mỏng đƣợc làm khô tủ ấm nhiệt độ 32⁰ C- 37⁰ C sau quan sát dƣới ánh sáng thƣờng ánh sáng tử ngoại 36 A B Hình 3.8 Kết chạy sắc ký mỏng flavonoid quan sát dƣới ánh sáng thƣờng (A) ánh sáng tử ngoại (B) Quan sát Hình 3.8 nhận thấy q trình trích ly flavonoid từ Diếp cá thành công, dung môi để chạy sắc ký mỏng cho flavonoid tách chiết từ Diếp cá phù hợp Khi quan sát dƣới ánh thƣờng ảnh sắc ký vết tách có màu nâu nhạt mờ khó quan sát, nhƣng quan sát ánh sáng tử ngoại vết tách phát quang dễ quan sát Nhƣ biết thành phần flavonoid Diếp cá gồm flavanol nhƣ (-)-epicatechin gallate (ECG), (-)- epigallocatechin (EGC), (-)- epigallocatechin gallate (EGCG), (-)epicatechin (EC), (+)- gallocatechin (GC), (+)- catechin (C) dẫn xuất; flavonol nhƣ quercetin, kaempferol, dẫn xuất glycoside; flavone Qua hình ảnh chạy sắc ký, thấy có vết tách từ flavonoid tách chiết từ Diếp cá thu đƣợc có querecetin với hàm lƣợng nhỏ bên cạnh flavonoid tách chiết từ Diếp cá cịn chứa nhóm flavanol, flavone thể vết tách ảnh chạy sắc ký 37 3.7 Khả kháng khuẩn cao flavonoid chiết xuất từ Diếp cá Trong dân gian, Diếp cá thƣờng đƣợc sử dụng để chữa số bệnh viêm nhiễm nhƣ ghẻ lở,mụn nhọt,…đây bệnh liên quan tới chủng vi khuẩn có khả gây viêm nhiễm bên bên thể Tiến hành kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn cao Diếp cá chiết xuất từ diếp cá nồng độ 100mg/ml chủng vi sinh vật kiểm định: Bacilus creaus, Sigella Escherichia coli, Salmonella enterica A B C D Hình 3.9 Hoạt tính kháng số chủng vi sinh vật kiểm định flavonoid A:Đƣờng kính vịng kháng nấm nem Bacilus creaus B: Đƣờng kính vịng kháng vi khuẩn E.coli C:Đƣờng kính vịng kháng vi khuẩn Sigella D:Đƣờng kính vịng kháng vi khuẩn Salmonella 38 Bảng 3.8 Hoạt tính kháng số chủng vi sinh vật kiểm định dịch chiết Diếp cá Chủng vi sinh vật kiểm định Đƣờng kính vòng kháng (cm) Vi khuẩn Bacillus cereus 2,5 ± 0,037 Vi khuẩn E.coli 1,2 ± 0,012 Vi khuẩn Salmonella 1,1 ± 0,034 Vi khuẩn Shigella 2,2 ± 0,044 Kết Bảng 3.8 cho thấy dịch chiết Diếp cá có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cao Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Diếp cá hiệu với vi khuẩn Hoạt tính kháng thấp với vi khuẩn E.coli Salmonella Hoạt tính kháng cao vi khuẩn Bacillus cereus Shigella 39 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua trình nghiên cứu, đề tài rút số kết luận sau: - Xác định đƣợc độ ẩm Diếp cá 86,57% - Xác định đƣợc loại dung môi dùng để tách chiết đạt hiệu cao ethanol - Trong dịch chiết Ethanol Diếp cá có chứa hợp chất Flavonoid - Khảo sát ảnh hƣởng yếu tố công nghệ đến q trình trích ly flavonoid theo phƣơng pháp ngâm chiết Kết xác định đƣợc nồng độ ethanol 100o, tỷ lệ NL/DM =1/10, thời gian 24h điều kiện tối ƣu để trích ly Flavonoid từ Diếp cá theo phƣơng pháp ngâm chiết tách chiết hàm lƣợng flavonoid thu đƣợc cao 3,886 ± 0,12 % 5g bột Diếp cá khô Về hoạt tính kháng khuẩn, cao chiết từ Diếp cá có khả ức chế nhóm trực khuẩn Gram dƣơng Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Diếp cá hiệu với vi khuẩn Hoạt tính kháng thấp với vi khuẩn E.coli Salmonella Hoạt tính kháng cao vi khuẩn Bacillus cereus Shigella 4.2 Kiến nghị Tiếp tục khảo sát thêm yếu tố cơng nghệ ảnh hƣởng đến q trình trích ly Flavonoid theo phƣơng pháp ngâm chiết nhƣ số lần trích ly, khuấy trộn 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO I TIẾNG VIỆT Phan Văn Cƣ , Nguyễn Thị Thu Hƣờng (2010), “Nguyên cứu tách chiết định lƣợng sterols từ Diếp cá (houttynia cordata thunb) tỉnh thừa thiên huế phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao ” Tạp Chí Khoa Học, Đại học Huế, Số 63, 2010, 17-24 Đỗ Trung Đàm (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc từ thảo dược, Nhà xuất KH &KT, Hà nội Lại Thị Ngọc Hà, Vũ Thị Thƣ (2013) ,Stress oxi hóa chất chống oxi hóa tự nhiên tạp chí Khoa học Phát triển 2013 Lê Tất Khƣơng (1999), Giáo trình chè NXB nơng nghiệp Trần Văn Ơn (2006), Bài Giảng Thực vật học tập 2, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội 2006 Nguyễn Kim Phi Phụng ( 2007 ), Phương pháp cô lập hợp chất hữu NXB ĐH quốc gia Tp.HCM Đỗ ngọc Quý, Nguyễn Kim Phong (1997) ,Cây Diếp cá Việt Nam, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội Đồn Hùng Tiến, Đỗ Văn Ngọc (1998), Tuyển tập cơng trình nghiên cứu diếp cá, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Duy Thịnh (2004), Giáo trình Cơng Nghệ Diếp cá, Trƣờng Đại Học Bách Khoa Hà Nội 10 Ngô Văn Thu Trần Hùng (2011), Dược liệu học Nhà xuất Y học Bộ Y tế 11 Nguyễn Anh Thủy, Dƣơng Anh Tuấn, Vũ Nguyên Thành (2011), Tinh chế peroxide từ củ cải trắng Raphanus sativus Var hortensis ứng dụng xét nghiệm ethanol, Tạp chí công nghệ sinh học, 113-118 12 Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Vũ Thị Ngọc Thanh, Trần Hùng, Đào Văn Phan (2011) Nghiên cứu sàng lọc tác dụng trơn đông cầm máu flavonoid chiết xuất từ diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.) Việt Nam 13 Đỗ Thị Hoa Viên, Nghiên cứu khảo sát hoạt chất flavonoid mơ Prunus armeniaca (họ Rosaceae) Tạp chí Khoa học công nghệ 2007 45(2): p 49 II TIẾNG ANH 14 Boonyadist Vongsa et a (2013), “Maximizing total phenolics, total flavonoidscontents and antioxidant activity of Moringa oleifera leaf extract by the appropriate extraction method”, Mahidol University, Bangkok, pp 566-571 15 Caceres A et a (1992), “Pharmacologic properties of Moringa oleifera: 2: Screening for antispasmodic, anti-inflammatory and diuretic activity” J.Ethnopharmacol 36: 233-237 16 Gressman, The chemistry of flavonoid compounds, Academic press, Lon don,1975 17 Tan M.C., Tan C.P and Ho C.W., Effects of extraction solvent system, time and temperature on total phenolic content of henna (Lawsonia inermis) stems,International Food Research Journal 20 (2013) 3117-3123 18 Wang J., Sun B.G., Cao Y., Tian Y and Li X H., Optimization of ultrasoundassisted extraction of phenolic compounds from wheat bran, Food Chemistry 106 (2008) 804-810 19 Ei ert U, Wo ters B, Nadrtedt A (1981), “The antibiotic princip e of seeds of Moringa o eifera and Moringa stenopeta a”, P antaMed 42: 55-61 20 J E Brown, H Khodr, R C Hider, and C Rice-Evans (1998), “Structural dependence of flavonoid interactions with Cu2+ ions: implications for their antioxidant properties”, Biochemica Journa , vo 330, no 3, pp 11731178 21 Makkar HPS, Becker K (1996), Nutritional value and antinutritional components of whole and ethanol extracted Moringa oleifera leaves 22 Mehta LK., Balaraman R., Amin AH, Bafna PA, Gulati OD (2003), Effect of fruits of Moringa oleifera on the lipid profile of normal andhypercholesterolaemic rabbits 23 Suphachai Charoensin (2012), “Antioxidant and anticancer activities of Moringa oleifera leaves”, Journa of Medicina P ant Research, pp 318-325 24 Wang Xiaomei, Cao Wengen (2007), “Advances in Research of Pharmacological Effects of Flavonoid Compounds”, Department of Pharmacy, Journal of Suzhou College 25 Sandra et a (2003), “Ultrasound-assisted extraction of Ca, K and Mg from invitro citrus culture”, Journal of the Brazilian Chemical Society ... Camellia sinensis CV.viridis [3–5, 15] Flavan 3,4-diol: dẫn chất flavan 3,4-diol khơng màu, có tính quang hoạt, đun sơi với acid dễ chuyển thành anthocyanidin có màu đỏ Vì dễ bị oxi hóa trùng hợp... Thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu 2.4.1 Thiết bị Các thiết bị sử dụng nghiên cứu gồm: - Máy đo quang phổ - Bếp đun - Cân điện tử - Tủ hút - Tủ lạnh - Tủ sấy 2.4.2 Dụng cụ - Các dụng cụ tủy tinh... sắc ký vết tách có màu nâu nhạt mờ khó quan sát, nhƣng quan sát ánh sáng tử ngoại vết tách phát quang dễ quan sát Nhƣ biết thành phần flavonoid Diếp cá gồm flavanol nhƣ (-)-epicatechin gallate