TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Giới thiệu về cây Diếp cá
1.1.1 Khái quát chung về cây Diếp cá
Cây Diếp cá còn có tên là cây Giấp cá, lá Giấp, Ngƣ tinh thảo
Tên khoa học là Houttuynia cordata Thunb
1.1.2 Nguồn gốc và đặc điểm thực vật
Diếp cá là cây thảo lâu năm, cao từ 20 đến 40cm, với thân ngầm bò ngang trong đất, có màu trắng và hơi lông Thân đứng của cây nhẵn, có màu lục hoặc tím đỏ Lá Diếp cá mọc so le, hình tim với đầu nhọn, mặt trên màu lục sẫm và mặt dưới màu tím, có lông dọc theo gân lá Cụm hoa của cây có hình bông dài từ 2 đến 2,5cm, mọc ở ngọn thân, với nhiều hoa nhỏ màu vàng nhạt, kích thước dài 4-6cm và rộng 3-4cm, có 5-7 gân gốc.
Hình 1.1 Hoa và lá của cây Diếp cá
Hoa Diếp cá nở từ tháng 5 đến tháng 8, với cụm hoa dài 2,5cm được bao quanh bởi 4 lá bắc màu trắng, bên trong chứa nhiều hoa nhỏ màu vàng nhạt Cây Diếp cá có hình dáng cụm hoa và lá bắc giống như một bông hoa đơn, kèm theo quả nang mở ở đỉnh và hạt hình trái xoan, nhẵn.
Diếp cá, một loại rau phổ biến ở Việt Nam, phân bố rộng rãi từ Nhật Bản, Trung Quốc đến Nepal, Ấn Độ, các nước Đông Dương và Indonesia Cây thường mọc hoang ở những nơi ẩm ướt như bãi ven suối và bờ sông Diếp cá không chỉ được sử dụng như một món rau ăn sống mà còn là gia vị kết hợp với các loại rau khác trong bữa ăn hàng ngày của các gia đình Việt.
Thành phần hóa học của Diếp cá gồm có : flavonoid, tinh dầu, alkaloid và một số thành phần khác [2, 6]
Bảng 1.1 Thành phần hóa học của cây Diếp cá
STT Thành phần hóa học Hàm lƣợng
Diếp cá là nguồn chứa flavonoid phong phú, bao gồm các hợp chất quan trọng như quercetin, quercetrin và isoquercetrin, cùng với nhiều flavonoid khác cũng có giá trị không kém.
Hình 1.2 Thành phần flavonoid trong Diếp cá Tinh dầu
The primary components of fish mint essential oil include aldehydes and ketone derivatives such as methyl n-nonyl ketone, L-decanal, and L-dodecanal, which contribute to its distinctive odor when crushed The terpenes present include α-pinene, camphene, myrcene, limonene, linalool, bornyl acetate, geraniol, and caryophyllene Additionally, the oil contains capric acid, lauryl aldehyde, benzamide, hexadecanoic acid, decanoic acid, palmitic acid, linoleic acid, oleic acid, stearic acid, capric aldehyde, chlorogenic acid, lipids, and vitamin K Recent studies indicate that the composition and concentration of fish mint essential oil vary depending on the source and drying process.
Tinh dầu Diếp cá khô từ miền Bắc Việt Nam chứa 31 hợp chất, trong đó 4 hợp chất chính bao gồm β-pinen (3,15%), 2-undecanon (15,15%), propen 1-methoxy-2 methyl (12,12%) và 1R-α-pinen (11,03%) Trong khi đó, tinh dầu Diếp cá tươi có tới 34 thành phần và hàm lượng tinh dầu trong Diếp cá tươi cao gấp 4,3 lần so với Diếp cá khô.
- Tinh dầu Diếp cá mọc tại miền Nam có 19 hợp chất trong đó thành phần chủ yếu là 2(10) – pinen, (1S, 5S)-(-) (82,84%); ocimen (6,15%); keton methyl nonyl (6,44%) [5]
Fresh fish mint (Diếp cá) from China contains 38 components, while the essential oil extracted from dried fish mint has only 22 compounds Key constituents of the dried essential oil include β-myrcene (3.47%), L-nonanol (6.21%), α-terpineol (13.24%), methyl nonyl ketone (35.2%), bornyl acetate (5.52%), n-decanoic acid (10.58%), caryophyllene (3.41%), and docosanoic acid ethyl ester (5.34%).
Một số alkaloid có hoạt tính sinh học đƣợc tìm thấy trong cây Diếp cá là: aristolactam A, aristolactam B, piperolactam A, norcepharadion B, cepharadion
A, cepharadion B, splendidin [15] aristolactam A aristolactam B piperolactam
Hình 1.3 Thành phần alkaloid trong Diếp cá
Tổng quan về flavonoid
Flavonoid là nhóm hợp chất tự nhiên thường gặp trong thực vật, tạo màu cho rất nhiều loại rau, hoa và quả
Flavonoid là hợp chất phenol với cấu trúc cơ bản là 1,3-diphenylpropan, bao gồm hai vòng benzen (vòng A và B) kết nối qua một mạch ba carbon (vòng pyron - vòng C) Đa số flavonoid có màu vàng nhạt, trong khi một số khác có màu đỏ, xanh tía và cũng có dạng không màu.
Hình 1.4 Cấu trúc của flavonoid
1.2.2 Cấu trúc chung và phân loại
Dựa trên mức độ oxy hóa của mạch 3 C và vị trí của gốc aryl (vòng B) liên kết với vòng benzopyrano chia flavonoid thành các loại khác nhau nhƣ:
Flavonoids (2- phenylbenzopyrans): gồm có các nhóm phụ flavan, flavan 3ol (catechin), flavan 4-ol, flavan 3,4-diol, anthocyanidin, flavanone, flavone, flavonol, 3-hydroxy flavanon, chalcon, dihidrochalcon, aurone
Isoflavonoid (3-benzopyrans) gồm các nhóm phụ: iso flavan, iso flavan-4- ol, isoflavon, isoflavanon, rotenoid…Thường gặp nhất là isoflavon trong cây họ đậu
Neoflavonoid (4- benzopyrans) gồm các nhóm phụ 4-aryl-chroman, 4- arylcoumarin, dalbergion
Các nhà khoa học phân loại flavonoid thành nhiều nhóm khác nhau, bao gồm flavonoid đơn, biflavonoid (flavonoid dimer), triflavonoid (gồm 3 monomer flavonoid) và flavonlignan (flavonoid có cấu trúc lignan trong phân tử).
Anthocyanidin: hay 2 phenylbenzopyrilium đây cũng là sắc tố phổ biến trong thực vật.Trong cây các sắc tố này đều ở dạng glycoside
Anthocyanin, hay còn gọi là anthocyanosid, tồn tại trong dịch tế bào Khi được đun trong dung dịch HCl 20%, phần đường trong phân tử bị cắt, tạo ra aglycon gọi là anthocyanidin Trong môi trường acid (pH 1-4), anthocyanidin tạo ra muối màu đỏ, trong khi ở môi trường kiềm (pH > 6), nó tạo thành anion và muối màu xanh với các chất kiềm Tuy nhiên, dung dịch anthocyanidin dễ mất màu khi tiếp xúc với bisulfit kiềm và dễ bị oxi hóa, vì vậy ít được sử dụng làm phẩm màu.
Hình 1.5 Cấu trúc của Anthocyanidin
Flavan 3-ol: tùy theo các nhóm thế đính vào 2 vòng A và B mà có những dẫn chất flavan 3-ol khác nhau Catechin, gallocatechin và những đồng phân của chúng là những dẫn chất của flavan 3-ol nhiều trong thực vật nhƣ cây diếp cá
Hình 1.6 Cấu trúc của Flavan 3-ol
Các nhà khoa học đã phát hiện ra các dẫn xuất flavan 3-ol ở dạng dimer, trimer, tetramer và pentamer, được gọi là tannin, thường xuất hiện trong trà Camellia sinensis CV viridis.
Flavan 3,4-diol: các dẫn chất flavan 3,4-diol đều không màu, có tính quang hoạt, khi đun sôi với acid thì dễ chuyển thành anthocyanidin có màu đỏ
Việc phân lập chất tinh khiết gặp khó khăn do chúng dễ bị oxi hóa và trùng hợp, thường tồn tại ở dạng dimmer Các đơn phân có thể được xác định thông qua việc chuyển đổi thành các dẫn chất anthocyanidin tương ứng.
Hình 1.7 Cấu trúc của Flavan 3,4-diol
Flavanon là các hợp chất không màu, nhưng khi phản ứng với cyanidin, chúng tạo ra màu sắc rõ hơn so với flavon và có điểm chảy thấp hơn Nhóm flavanon thường xuất hiện nhiều trong cây cam thảo với các hợp chất như liquiritin và isoliquiritin Hesperidin và naringin là những flavanon phổ biến trong vỏ cây Citrus, trong đó naringin có vị đắng tương đương 1/5 quinin, nhưng aglycon lại không có vị đắng Nếu thay thế đường neohesperidose bằng đường rutinose, naringin sẽ mất vị đắng Khi mở vòng C của naringin để tạo thành chalcon và sau đó hydrogen hóa thành dihydro chalcon, dẫn chất này có vị ngọt tương đương với saccharin.
Hình 1.8 Cấu trúc của Flavanon
3- Hydroxyflavanon (dihydroflavanol = flavanonol): có 2 carbon bất đối ở C2 và C3 Phần lớn dihyroflavonol ở dạng aglycon, cũng có một số ở dạng glycoside Dihydroflavonol khó phân lập vì kém bền, dễ bị oxi hóa Trong đó có dẫn chất của taxifolin hay gặp nhất [3-5]
Hình 1.9 Cấu trúc của 3- Hydroxyflavanon
Flavon có cấu trúc gồm hai vòng benzen A và B, với vòng B liên kết với vòng C (pyran) tại vị trí C2 và có nối đôi ở vị trí 2-3 Các dẫn chất flavon rất phổ biến trong thực vật, thường xuất hiện dưới dạng tinh thể không màu hoặc vàng nhạt Đặc biệt, chỉ riêng các flavon có nhóm thế OH và/hoặc OCH3 đã có hơn 300 loại khác nhau Flavon đơn giản nhất không có nhóm thế đã được tìm thấy trong cây anh thảo (Primula), trong khi hai flavon phổ biến nhất trong thực vật là apigenin và lutelin.
Hình 1.10 Cấu trúc của flavon
Flavonol (flavon 3-ol) khác với flavon nhờ có thêm nhóm OH ở vị trí C3, dẫn đến việc flavonol có màu vàng nhạt đến vàng Các dẫn chất flavonol rất phổ biến trong thực vật, đặc biệt là trong hành, hoa hòe, lúa mạch, rau nghễ và diếp cá Đến năm 1992, đã có tới 380 chất flavonol với nhóm thế hydroxyl và/hoặc methoxyl được phát hiện Những flavonol thường gặp trong thực vật bao gồm kaempferol, quercetin và myricetin.
Hình 1.11 Cấu trúc của flavonol
Chalcon là một hợp chất có cấu trúc gồm hai vòng A và B được nối với nhau bởi một mạch hở 3C, không có dị vòng C như các flavonoid khác, và có màu vàng đến vàng cam Hợp chất này chủ yếu được tìm thấy trong một số loài hoa thuộc họ Cúc–Asteraceae Để nhận biết chalcon, có thể sử dụng hơi ammoniac hoặc khói kiềm từ thuốc lá, khi đó màu sắc sẽ chuyển sang đỏ cam hoặc cam đỏ Chalcon cũng tồn tại trong các bộ phận khác của cây như vỏ, lá, rễ và quả, ví dụ như isoliquiritigenin có trong rễ cam thảo.
Hình 1.12 Cấu trúc của chalcon
Dihydrochalcon là các hợp chất ít gặp trong tự nhiên, trong đó phloridin, có nguồn gốc từ loài Malus, có độc tính ngăn cản sự hấp thu glucose ở ruột non và sự tái hấp thu glucose ở tiểu quản thận Một số dihydrochalcon, như neohesperidosid, có vị ngọt vượt trội, ngọt gấp 2000 lần so với đường mía.
Hình 1.13 Cấu trúc của Dihydrochalcon
Auron: là nhóm flavonoid có màu vàng sáng Khung của auron cũng có
Auresidin, một flavonoid dị vòng có 5 cạnh, thường gặp trong hoa của các họ thực vật như Asteraceae, Scrophulariaceae, Plumbaginaceae và Oxalidaceae Sự phân bố và số lượng của flavonoid này trong cây bị hạn chế, thường tồn tại dưới dạng 4-glucosid hoặc 6-glucosid.
Hình 1.14 Cấu trúc của Auron
Flavonoids with an aryl group at the C-3 position include various types such as isoflavan, isoflavan-3-ene, isoflavan-4-ol, isoflavanone, isoflavone, rotenoid, pterocarpan, coumestan, 3-arylcoumarin, coumaronochromen, and coumaronochromon These compounds are commonly found in plants belonging to the Fabaceae family.
+ Isoflavan: glabridin là một thành phần flavonoid gặp trong rễ cam thảo + Isoflavan-3-ene: flabren có trong cam thảo
Isoflavon là nhóm lớn nhất trong isoflavonoid, với hơn 364 chất đã được xác định Chúng có nhiều tác dụng trong y học và thường gặp trong các họ thực vật như Rosaceae, Amaranthaceae và Iridaceae Ví dụ, daizein có trong sắn dây và forrmonometin có trong cam thảo.
Tình hình nghiên cứu, ứng dụng và sản xuất các chất flavonoid
1.3.1 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng và sản xuất trên thế giới
Flavonoid là một chất chống oxy hóa mạnh, giúp cơ thể bảo vệ khỏi tổn thương do oxy hóa và gốc tự do Chúng có tác dụng bảo vệ hệ tim mạch, giảm nguy cơ tử vong do các bệnh lý như thiếu máu cơ tim, đau thắt ngực và xơ vữa động mạch Ngược lại, khi lượng flavonoid hàng ngày giảm, nguy cơ mắc các bệnh lý này tăng lên rõ rệt Khả năng chống oxy hóa của flavonoid còn vượt trội hơn so với các chất khác như vitamin C, vitamin E, selenium và kẽm.
1.3.2 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng và sản xuất ở trong nước Ở Việt nam trong thời gian gần đây đã có rất nhiều các nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của flavonoid có trong một số loài thực vật nhƣ flavonoid trong hoa Actiso Cynara scolymus L., hoa Hòe, cây Đơn Kim, chè dây Cao Bằng, cây Cỏ lào, cây Diếp cá, lá Chùm ngây, [5, 6, 10]
Nghiên cứu về tác dụng của flavonoid trong Diếp cá còn hạn chế, và việc tinh chế các hợp chất hữu ích từ loại cây này gặp nhiều khó khăn Quá trình này đòi hỏi công nghệ hiện đại và chi phí cao, điều mà hiện nay chưa được đáp ứng đầy đủ ở Việt Nam.
Việc sản xuất các hợp chất flavonoid hiện vẫn còn hạn chế, với nhiều sản phẩm chưa được khai thác hoặc chỉ đang ở mức độ thăm dò Quy trình chiết tách hiện tại còn đơn giản và không đồng bộ, dẫn đến việc chỉ tạo ra sản phẩm ở dạng cao chiết mà chưa đạt được độ tinh khiết cao Hầu hết các nguyên liệu flavonoid dùng trong dược phẩm và thực phẩm chức năng đều phải nhập khẩu từ nước ngoài Đặc biệt, nghiên cứu về Diếp cá vẫn còn rất hạn chế.
NỘI DUNG MỤC TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu khảo sát một só yếu tố công nghệ trong quá trình tách chiết hợp chất flavonoid của lá cây Diếp cá ( Houttuynia cordata Thunb )
Nội dung nghiên cứu
Xác định độ ẩm của lá và tạo nguyên liệu bột lá cây Diếp Cá
Xác định loại dung môi thích hợp để tách chiết
Xác định nồng độ dung môi tách chiết
Nghiên cứu tách chiết hợp chất flavonoid trong bột lá Diếp Cá theo phương pháp và tối ưu một số yếu tố trong quá trình tách chiết
Xác định sự có mặt của flavonoid trong cao thô lá Diếp cá bằng các phản ứng màu đặc trƣng và chạy sắc ký lớp mỏng
Xác định hoạt tính kháng một số vi sinh vật kiểm định của flavonoid tách chiết từ lá cây Diếp cá
Vật liệu nghiên cứu
Lá cây Diếp cá Houttuynia cordata Thunb
Lá cây Diếp cá sau khi thu hoạch sẽ được loại bỏ tạp chất, rửa sạch và để ráo nước, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 50°C Sau khi sấy khô, lá sẽ được nghiền mịn thành bột khô, được sử dụng để trích ly Flavonoid.
2.3.2 Vật liệu vi sinh vật
Các loại vi sinh vật kiểm định gồm :
2.3.3.Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Môi trường LB nuôi cấy vi khuẩn E.coli, Salmonella Bacillus cereus Shigella (g/l) Pepton
Chiết suất nấm men (yeast extrart)
10g 5g 5g 16g Hòa tan và dẫn nước đến 1000ml và điều chỉnh pH= 7,0
Thiết bị, dụng cụ, hóa chất nghiên cứu
Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu gồm:
- Các dụng cụ tủy tinh nhƣ bình trụ, đũa thủy tinh, đĩa peptri, bình tam giác
- Kẹp gỗ, pipetman, đầu côn các loại, ống cuvet, ống eppenandorf, ống fancol, ống nghiệm, giấy lọc, phễu lọc
- Giấy sắc ký silica gel 60G
Cloroform (CH3Cl) Pepton Agar
Sodium chloride (NaCl) Natri acetate(C2H3NaO2) Indigocarmine (C16H8N2Na2O8S2) H2O2
Hệ dung môi chạy dạng sắc ký lớp mỏng TLC (ethyaxetat:toluen:axit fomic:nước = 7: 3: 1, 5: 1)
Phương pháp nghiên cứu
2.5.1 Xác định độ ẩm của lá và tạo nguyên liệu bột lá cây Diếp Cá
- Độ ẩm là lượng nước tự do có trong mẫu, có thể được xác định bằng phương pháp sấy khô
Nguyên lý của phương pháp này là sử dụng nhiệt để loại bỏ hoàn toàn hơi nước trong mẫu Bằng cách cân trọng lượng mẫu trước và sau khi sấy khô, chúng ta có thể tính toán phần trăm nước có trong mẫu một cách chính xác.
Để tiến hành sấy lá Diếp cá, trước tiên cần cân khối lượng của lá đã ngắt bỏ cành và đặt vào các khay đĩa đã được sấy khô đến khối lượng không đổi Sau đó, xác định khối lượng chính xác và cho khay đĩa chứa mẫu vào tủ sấy, điều chỉnh nhiệt độ ở 80 độ C trong 3 giờ Cuối cùng, lấy khay ra và cân lại để tính khối lượng trên cân phân tích.
Để đảm bảo độ chính xác trong quá trình sấy, hãy cho mẫu vào tủ sấy và lặp lại quy trình này cho đến khi khối lượng giữa ba lần cân liên tiếp không thay đổi, hoặc sai số không vượt quá 0,5mg cho mỗi gam mẫu ban đầu Khi đạt được điều kiện này, bạn có thể dừng quá trình sấy Độ ẩm của mẫu sẽ được tính toán theo công thức đã định sẵn.
H : là độ ẩm (%) mo : khối lượng mẫu trước khi sấy (g) m1 : khối lƣợng mẫu sau khi sấy (g)
2.5.2 Xác định phương pháp tách chiết
Cân chính xác 5g bột lá Diếp cá vào bình nón, thêm 25 ml chloroform và giữ ở 60°C trong 24 giờ để loại bỏ nhựa, chất béo, caroten và chlorophyl Sau đó, sử dụng máy siêu âm Power Sonic 410 ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để chiết xuất Lấy phần bột nguyên liệu ra, loại bỏ dịch chloroform, rồi sấy khô để loại hết chloroform Tiếp theo, chiết xuất bằng ethanol với tỷ lệ nguyên liệu: dung môi là 1:10 ở nồng độ ethanol 60% trong 12 giờ Cuối cùng, thu dịch chiết ethanol và cô cạn bằng phương pháp đun cách thủy để thu được cao Diếp cá.
Cao Diếp cá được chiết xuất bằng 30ml nước cất nóng, sau đó dịch chiết được lọc và cho vào phễu chiết với 20ml ethyl axetat Dịch chiết ethyl axetat được dồn lại và cô cạn bằng phương pháp đun cách thủy để xác định lượng flavonoid.
Cân 5g bột diếp cá vào bình nón và thêm 50 ml ethanol 60% Ngâm hỗn hợp trong 12 giờ ở 60 độ C, sau đó tách dịch chiết bằng giấy lọc Dịch chiết được cô cạn ở nhiệt độ thấp cho đến khi thu được cao Tiếp tục chiết cao diếp cá với 30ml nước cất nóng, thu dịch thủy phân và bổ sung 2ml chloroform (3 lần) để loại bỏ phần màu xanh lắng xuống Dịch chiết sau khi lọc được cho vào phễu chiết với 10ml ethyl axetat, sau đó dồn dịch chiết ethyl axetat lại và cô cạn bằng phương pháp đun cách thủy Cuối cùng, cân để xác định trọng lượng flavonoid đã chiết.
2.5.3 Xác định loại alcohol thích hợp cho quá trình tách chiết
Cân chính xác 5g bột lá Diếp cá vào bình nón và thêm 25 ml chloroform Để hỗn hợp ở 60°C trong 24 giờ nhằm loại bỏ nhựa, chất béo, caroten và chlorophyll Sau đó, tiếp tục sấy dịch chiết để bay hơi chloroform Tiến hành chiết bằng ethanol, methanol, butanol, và propanol với tỷ lệ dung môi 1:10, ngâm ở 60°C trong 12 giờ, lọc lấy dịch chiết và đo OD490nm.
2.5.4 Xác định nồng độ dung môi
Cân 5g bột lá Diếp cá vào bình nón và thêm 25 ml chloroform Để hỗn hợp ở 60°C trong 24 giờ để loại bỏ nhựa, chất béo, caroten và chlorophyll, sau đó tiếp tục sấy để bay hơi chloroform Tiến hành chiết xuất bằng ethanol với các nồng độ khác nhau, ngâm ở 60°C trong 12 giờ, lọc lấy dịch chiết và đo OD tại 600nm.
2.5.5 Tách chiết hợp chất flavonoid theo phương pháp trích ly
Sơ đồ tách chiết hợp chất flavonoid theo phương pháp trích ly
Cô cạn ở nhiệt độ thấp
Bổ sung 30 ml nước nóng
Bổ sung 2ml Chloroform (3 lần)
Loại bỏ phần màu xanh lắng xuống
Bổ sung 10ml Ethyl Acetate Loại bỏ phần lắng ở dưới
Cô cạn ở nhiệt độ thấp
Dịch hòa tan lá Diếp cá
Dịch chiết lá diếp cá
2.5.5.1 Xác định ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng trích ly
Cân 5g bột diếp cá vào bình nón, sử dụng dung môi với tỷ lệ 1:10 ở các nồng độ ethanol 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, và 100% Ngâm trong 12 giờ và tách dịch chiết bằng giấy lọc, sau đó ngâm thêm 3 lần ở 60 độ C Dịch chiết được cô cạn ở nhiệt độ thấp cho đến khi thành cao, sau đó chiết lại với 30ml nước cất nóng và bổ sung 2ml chloroform (3 lần), loại bỏ phần màu xanh lắng xuống Dịch chiết đã lọc được cho vào phễu chiết với 10ml etyl axetat, sau đó dồn lại và cô cạn bằng đun cách thủy Cuối cùng, cân xác định trọng lượng flavonoid chiết được ở các nồng độ cồn khác nhau để tìm ra công thức với nồng độ ethanol tối ưu cho hiệu suất chiết xuất flavonoid cao nhất.
2.5.5.2 Xác định ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu / dung môi đến khả năng trích ly
Nghiên cứu này khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu bột lá Diếp cá so với dung môi ethanol trong quá trình trích ly flavonoid, với các tỷ lệ 1/5, 1/10, 1/12 và 1/20 Mục tiêu là xác định tỷ lệ nguyên liệu/dung môi tối ưu để đạt hiệu suất trích ly flavonoid cao nhất Hàm lượng flavonoid trích ly sẽ được đo lường tương ứng với từng công thức thí nghiệm.
2.5.5.3 Xác định ảnh hưởng của thời gian chiết bằng ethanol đến khả năng trích ly
Nồng độ cồn và tỷ lệ nguyên liệu là yếu tố quan trọng trong việc tối ưu hóa hiệu suất trích ly flavonoid Nghiên cứu được thực hiện với thời gian chiết bằng ethanol là 8h, 12h và 24h nhằm đánh giá ảnh hưởng của thời gian đến khả năng trích ly flavonoid Hàm lượng flavonoid thu được sẽ là cơ sở để xác định thời gian chiết xuất tốt nhất.
2.5.6 Xác định sự có mặt của flavonoid trong dịch chiết
2.5.6.1 Định tính flavonoid bằng các phản ứng màu đặc trưng
+) Phản ứng với FeCl3 5%: hỳt 50àl dịch chiết flavonoid + 2-3 giọt FeCl 5% Phản ứng dương tính sẽ cho màu lục, xanh đen, xanh lam và nâu tùy
+) Phản ứng với NaOH 10%: hỳt 50àl dịch chiết flavonoid + 2-3 giọt NaOH 10% Phản ứng dương tính sẽ cho màu đỏ, da cam
Phản ứng tạo muối phenolat cho màu sắc khác nhau tùy thuộc vào nồng độ flavonoid và nhóm flavonoid Cụ thể, nhóm flavon và flavonol tạo ra màu vàng sáng, trong khi anthocyanidin mang lại màu xanh dương, và auron có thể cho màu đỏ hoặc da cam.
2.5.7 Định tính flavonoid bằng phương pháp chạy sắc ký
Nguyên tắc hoạt động dựa trên sự tương tác khác nhau giữa các thành phần trong hỗn hợp với dung môi và pha tĩnh, vì mỗi thành phần có độ phân cực khác nhau.
Dung môi chạy sắc ký: ethyaxetat: toluen: axit fomic: nước =7:3:1,5:1
Chuẩn bị: Hoạt hóa bản màng silicagel gel bằng cách sấy 2 giờ ở 80°, để ở nhiệt độ phòng 30 phút
Chấm mẫu flavonoid lên bản mỏng
- Hòa tan mẫu flavonoid tách chiết theo quy trình bằng ethyacetat
Sử dụng pipet để hút một lượng mẫu hòa tan, sau đó chấm lên bản mỏng với khoảng cách giữa các vết chấm được quy định cụ thể: cách bờ dưới 1cm, hai bờ bên 0,5cm và khoảng cách giữa các vết chấm là 0,6cm Kích thước các vết chấm cần được điều chỉnh sao cho hợp lý.
- Chuẩn bị bình triển khai: rửa sạch, sấy khô
- Pha hệ dung môi triển khai vào bình lần lƣợt theo các tỷ lệ xác định: ethyaxetat: toluen: axitfomic: nước= 7:3:1,5:1
- Đặt một tấm giấy lọc vào bình triền khai
- Bão hòa dung môi trong bình triển khai từ 15-20 phút
- Dùng kẹp cho bản mỏng đã chấm mẫu vào bình triển khai, đậy nắp bình lại
- Theo dõi vạch dung môi di chuyển đến cạnh mép trên của tấm bản mỏng khoảng 0,5 cm thì lấy bản mỏng ra khỏi bình triển khai
- Sấy nhẹ bản mỏng để đuổi hết dung môi
- Phát hiện vết qua màu sắc tự nhiên
2.5.8 Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật của flavonoidchiết xuất từ lá
Mục đích của nghiên cứu này là xác định khả năng kháng khuẩn của dịch chiết flavonoid từ lá diếp cá đối với bốn loại vi khuẩn: Escherichia coli, Salmonella typhi, Bacillus subtilis và Shigella Phương pháp được sử dụng là dung dịch khuếch tán để xác định vòng kháng khuẩn.
B1:Khử trùng bàn tay bằng cồn 70 % trước khi cho tay vào box cấy
B2:Đổ môi trường thích hợp đã chuẩn bị vào đĩa petri đã khử trùng để khoảng 30 phút cho mặt thạch thật khô ráo
B3:Dùng pipet man vô trùng nhỏ dịch các chủng vi sinh vật đã đƣợc nuôi lên sinh khối trong môi trường lên trên đĩa môi trường LB
B4 :Dùng que trang trải đều lên khắp mặt thạch
B5 :Sau đó tiến hành đục lỗ bằng đầu lớn của pipet