2.3.3 .Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.5.6. Xác định sự có mặt của flavonoid trong dịch chiết
2.5.6.1 Định tính flavonoid bằng các phản ứng màu đặc trưng
+) Phản ứng với FeCl3 5%: hút 50µl dịch chiết flavonoid + 2-3 giọt FeCl3 5%. Phản ứng dƣơng tính sẽ cho màu lục, xanh đen, xanh lam và nâu tùy
+) Phản ứng với NaOH 10%: hút 50µl dịch chiết flavonoid + 2-3 giọt NaOH 10%. Phản ứng dƣơng tính sẽ cho màu đỏ, da cam
Phản ứng tạo ra muối phenolat có màu khác nhau tùy thuộc vào nồng độ flavonoid và tùy theo nhóm flavonoid. Nhóm flavon và flavonol cho màu vàng sáng, anthocyanidin cho màu xanh dƣơng, auron có thể cho màu đỏ, da cam [6].
2.5.7. Định tính flavonoid bằng phương pháp chạy sắc ký
Nguyên tắc: Dựa trên sự tƣơng tác khác nhau giữa các thành phần trong hỗn hợp với dung mơi và pha tĩnh, do mỗi thành phần có độ phân cực khác nhau
Dung môi chạy sắc ký:
ethyaxetat: toluen: axit fomic: nƣớc =7:3:1,5:1 Tiến hành:
Chuẩn bị: Hoạt hóa bản màng silicagel gel bằng cách sấy 2 giờ ở 80°, để ở nhiệt độ phòng 30 phút
Chấm mẫu flavonoid lên bản mỏng
- Hịa tan mẫu flavonoid tách chiết theo quy trình bằng ethyacetat
- Dùng pipet hút một ít mẫu đã hịa tan chấm lên bản mỏng, khoảng cách vết chấm cách bờ dƣới 1cm, hai bờ bên 0,5cm và khoảng cách giữa các vết chấm cách nhau 0,6cm. Kích thƣớc các vết chấm cách vừa phải.
Triển khai bản mỏng:
- Chuẩn bị bình triển khai: rửa sạch, sấy khô.
- Pha hệ dung môi triển khai vào bình lần lƣợt theo các tỷ lệ xác định: ethyaxetat: toluen: axitfomic: nƣớc= 7:3:1,5:1
- Đặt một tấm giấy lọc vào bình triền khai.
- Bão hịa dung mơi trong bình triển khai từ 15-20 phút.
- Dùng kẹp cho bản mỏng đã chấm mẫu vào bình triển khai, đậy nắp bình lại.
- Theo dõi vạch dung môi di chuyển đến cạnh mép trên của tấm bản mỏng khoảng 0,5 cm thì lấy bản mỏng ra khỏi bình triển khai.
- Sấy nhẹ bản mỏng để đuổi hết dung môi. - Phát hiện vết qua màu sắc tự nhiên.
2.5.8. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật của flavonoidchiết xuất từ lá Diếp cá Diếp cá
Mục đích : xác định khả năng kháng khuẩn của dịch chiết flavonoid từ lá diếp cá đối với 4 loại vi khuẩn là Escherichica coli, Salmonella typhi, Bacillus
subtillis, sigella theo phƣơng pháp dung dịch khuếch tán, xác định vòng kháng
khuẩn.
Các bƣớc tiến hành:
B1:Khử trùng bàn tay bằng cồn 70%
trƣớc khi cho tay vào box cấy.
B2:Đổ mơi trƣờng thích hợp đã chuẩn bị vào đĩa petri đã khử trùng để khoảng 30 phút cho mặt thạch thật khô ráo.
B3:Dùng pipet man vô trùng nhỏ dịch các chủng vi sinh vật đã đƣợc nuôi lên sinh khối trong môi trƣờng lên trên đĩa môi trƣờng LB
B4 :Dùng que trang trải đều lên khắp mặt thạch. B5 :Sau đó tiến hành đục lỗ bằng đầu lớn của pipet
-Dùng pipet vơ trùng nhỏ 0,1ml dịch flavonoid (pha lỗng với cồn với tỷ lệ 100mg/1ml) vào các lỗ thạch và để trong tủ lạnh 2 h sau đó ấy ra và để trong tủ ấm ở nhiệt độ 50°C. Sau 24-48 giờ quan sát vòng kháng vi sinh vật tạo thành và đo đƣờng kính kháng vi sinh vật
PHẦN 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định độ ẩm của lá và tạo nguyên liệu bột lá Diếp cá
Nƣớc có vai trị rất quan trọng đối với cơ thể sống, nƣớc cịn là mơi trƣờng cho vi sinh vật trong thực phẩm phát triển. Nhƣ vậy muốn bảo quản để sử dụng lâu dài cần quản lý tốt nồng độ nƣớc có trong nguyên liệu. Xác định đƣợc lƣợng nƣớc có trong nguyên liệu từ đó để có phƣơng pháp bảo quản tốt nguồn nguyên liệu, tiến hành đánh giá chất lƣợng nguyên liệu Diếp cá bằng phƣơng pháp xác định độ ẩm của lá diếp cá và nguyên liệu bột lá Diếp cá cho quá trình tách chiết. Độ ẩm của lá Diếp cá đƣợc xác định và tổng hợp ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm của lá Diếp cá
STT Khối lƣợng mẫu trƣớc khi sấy(g)
Khối lƣợng mẫu sau khi sấy(g) Độ ẩm %
Khối lƣợng mẫu sau khi cân lần 1 (g)
Khối lƣợng mẫu sau khi cân lần 2
(g)
Khối lƣợng mẫu sau khi cân lần 3
(g)
1 50,0012 6,7252 6,6835 6,5784 86,67 ± 2
2 50,1111 6,9174 6,9368 6,8126 86,25 ± 2
3 50,002 6,6715 6,6253 6,5145 86,79 ± 2
Hình 3.1. Lá Diếp cá và bột lá Diếp cá
Nhận xét: Độ ẩm trung bình có trong lá Diếp cá là 86,57%.
3.2. Xác định phƣơng pháp tách chiết
Kết quả xác định phƣơng pháp tách chiết flavonoid đƣợc thể hiện ở Bảng 3.2
Bảng 3.2 Kết quá xác định phƣơng pháp tách chiết
Phƣơng pháp Khối lƣợng bột diếp cá (g) Hàm lƣợng flavonoid thu đƣợc (g) Hiệu suất trích ly theo TLKTD (%) Siêu âm 5 0.1528 3,056 ± 0,81 Trích ly 5 0.1821 3,642 ± 0,62
Từ kết quả Bảng 3.2 cho thấy đƣợc hiệu suất trích ly của phƣơng pháp trích ly cao hơn phƣơng pháp siêu âm nên ta áp dụng phƣơng pháp trích ly
3.3 Xác định loại Alcohol thích hợp cho quá trình tách chiết
Loại alcohol dùng tách chiết là yếu quan trọng trong quá trình tách chiết để đạt hiệu quả cao nhất và đƣợc thể hiện ở Bảng 3.3
Bảng 3.3 Kết quả đo OD của các loại Alcohol
Dung môi Trị số OD490nm
Ethanol 2,906 Methanol 2,900 Butanol 1,364 Propanol 1,138
Hình 3.2 Dịch chiết các loại Alcohol
A. Dịch chiết methanol B. Dịch chiết propanol C. Dịch chiết butanol D. Dịch chiết ethanol
Từ Bảng 3.3 cho thấy chỉ số đo OD490nm của dịch chiết ethanol là 2,906 còn propanol là 1,138 còn dịch chiết methanol cũng có chỉ số đo OD khá cao gần băng ethanol nhƣng do methanol có tích chất hóa học độc hơn ethanol nên khóa luận này chọn dung mơi ethanol là dung mơi tách chiết chính.
3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố cơng nghệ đến khả năng trích ly theo phƣơng pháp ngâm chiết.
3.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ ethanol
Dung môi chiết là một trong những yếu tố quan trọng có ảnh hƣởng đến quá trình chiết xuất các hợp chất tự nhiên có trong thực vật. Cả hiệu quả chiết xuất và hoạt tính của các chất chiết xuất phụ thuộc rất lớn vào dung môi và nồng độ dung môi. Việc lựa chọn nồng độ dung môi ảnh hƣởng trực tiếp đến việc hiệu suất tách chất ra khỏi ngun liệu. Flavonoid là hợp chất có tính phân cực mạnh do đó thơng thƣờng sử dụng các chất có độ phân cực mạnh nhƣ methanol, ethanol hay nƣớc làm dung mơi trích ly. Flavonoid có khả năng hịa tan tốt trong cả methanol và ethanol nhƣng do methanol là chất có độc tính cao nên đề tài tiến hành lựa chọn ethanol ở các nồng độ khác nhau để trích ly. Kết quả nghiên cứu đƣợc thể hiện trong Bảng 3.4. và Hình 3.3 và Hình 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid Nồng độ ethanol (%) Khối lƣợng bột Diếp cá(g) Trị số OD600nm Hàm lƣợng flavonoid thu đƣợc (g) Hiệu suất trích ly theo TLKTĐ(%) 50% 5 0,05 0,1174 2,348 ± 0,052 60% 5 0,16 0,1602 3,204 ± 0,066 70% 5 0,25 0,1685 3,370 ± 0,075 80% 5 0,46 0,1708 3,404 ± 0,084 90% 5 0,83 0,1726 3,452 ± 0,091 100% 5 0,90 1,757 3,514 ± 0,11 .
Hình 3.4. Biểu đồ ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 50% 60% 70% 80% 90% 100% Nồng độ ethanol Nồng độ ethanol H iệu s uất trí ch ly th eo T L K T Đ (% )
Kết quả ở Bảng 3.4 và Hình 3.4. cho thấy khi trích ly ở các nồng độ ethanol khác nhau cho hiệu suất trích ly flavonoid khác nhau dao động trong khoảng 2,348% - 3,514%. Hiệu suất trích ly flavonoid tăng lên khi chiết ở nồng độ ethanol từ 50% -100%, trong đó ethanol 100% cho hiệu suất trích ly cao nhất là 3,514 %. Vì vậy nồng độ ethanol thích hợp để thực hiện q trình trích ly flavonoid trong lá diếp cá là 100%.
3.4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu / dung môi ethanol
Q trình trích ly đƣợc thực hiện dựa vào tính hịa tan tốt của hoạt chất sinh học trong dung mơi hữu cơ, đây là q trình chuyển khối do có sự chênh lệch nồng độ nguyên liệu và dịng chảy bên ngồi (dung mơi). Vì vậy để nghiên cứu hiệu suất trích ly flavonoid cần nghiên cứu ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu / dung môi, em tiến hành khảo sát các tỷ lệ: nguyên liệu / dung môi : 1/5, 1/10, 1/15, 1/20. Các kết quả thí nghiệm đƣợc thể hiện ở Bảng 3.5 và Hình 3.5
Bảng 3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu / dung môi ethanol đến hiệu suất trích ly
Tỷ lệ ngun liệu: dung mơi
ethanol (g/ml) Khối lƣợng bột diếp cá (g) Hàm lƣợng flavonoid thu đƣợc (g) Hiệu suất trích ly theo TLKTĐ(%) 1/5 5 0,1295 2,590 ± 0,06 1/10 5 0,1757 3,514 ± 0,07 1/15 5 0,1801 3,602 ± 0,08 1/20 5 0,1851 3,702 ± 0,10
Hình 3.5. Biểu đồ ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung mơi ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid
Qua Bảng 3.5. và Hình 3.5. cho thấy hiệu suất trích ly flavonoid tăng lên khi tỷ lệ: nguyên liệu / dung môi tăng. Từ tỷ lệ 1/5 đến 1/10 hiệu suất trích ly tăng nhanh từ 2,590% lên 3,702% nhƣng từ tỷ lệ 1/10 lên 1/15 và 1/15 lên 1/20 thì hiệu suất trích ly tăng nhƣng khơng đáng kể. Theo báo cáo tổng hơp kết quả đề tài cấp bộ nghiên cứu quy trình cơng nghệ chiết tách các flavonoid từ phế thải diếp cá, rau quả nhằm ứng dụng trong thực phẩm chức năng của Lý Ngọc Trâm cũng đã chỉ ra tỷ lệ nguyên nguyên liệu / dung mơi ethanol thích hợp nhất để trích ly flavonoid từ phế thải Diếp cá bằng phƣơng pháp trích ly động ở nhiệt độ 60oC là 1/10 đạt hiệu suất trích ly cao nhất ở tỷ lệ nguyên liệu / dung môi là 1/20, nhƣng để tiết kiệm dung môi hay để tăng hiệu quả kinh tế cho q trình trích ly thì chọn tỷ lệ nguyên liệu / dung môi là 1/10 sẽ phù hợp vì khi tỷ lệ nguyên liệu / dung mơi tăng lên 1/20 thì hiệu suất trích ly flavonoid tăng lên khơng nhiều so với chi phí sản xuất
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 1:05 1:10 1:15 1:20
Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi
Tỷ lệ nguyên liệu : dung mơi
H iệu s uất trí ch ly th eo T L K T Đ (% )
3.4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết bằng ethanol.
Theo lý thuyết khi thời gian trích ly càng dài thì hiệu suất thu nhận sản phẩm càng tăng nhƣng đến một ngƣỡng thời gian nhất định thì lƣợng sản phẩm thu đƣợc tăng lên không đáng kể, đồng thời có thể ảnh hƣởng xấu đến chất lƣợng sản phẩm. Do vậy cần xác định thời gian trích ly thích hợp cho nguyên liệu. Tiến hành nghiên cứu thời gian chiết bằng ethanol trong 8 giờ, 12 giờ và 24 giờ.
Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian chiết bằng ethanol đƣợc thể hiện trong Bảng 3.6. và Hình 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian chiết bằng ethanol đến hiệu suất trích ly
Thời gian (h) Khối lƣợng bột lá Diếp cá (g) Hàm lƣợng Flavonoid thu đƣợc (g) Hiệu suất trích ly theo TLKTĐ (%) 8 5 0,1343 2,686 ± 0,08 12 5 0,1757 3,514 ± 0,09 24 5 0,1943 3,886 ± 0,12
Hình 3.6. Biểu đồ ảnh hƣởng của thời gian chiết bằng ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid
Từ kết quả ở Bảng 3.4.3 và Hình 3.4.3 cho thấy hàm lƣợng flavonoid tăng theo thời gian chiết. Thời gian chiết từ 8h đến 12h, hiệu suất trích ly flavonoid tăng cao từ 2,686% lên 3,886%, tiếp tục tăng thời gian từ 12h đến 24h thì hiệu suất trích ly flavonoid chỉ tăng 0,172%.
Chiết trong 24h cho hiệu suất trích ly cao hơn khi chiết trong 12h. Tuy nhiên, chiết trong 24 h lại tốn nhiều thời gian hơn mà hiệu suất trích ly lại khơng tăng nhiều hơn so với 12h nếu áp dụng trên quy mơ cơng nghiệp thì khơng khả quan, để tiết kiệm thời gian, chi phí cho q trình chiết nên chọn thời gian là 24 h cho quá trình chiết bằng ethanol. Vì vậy lựa chọn thời gian chiết bằng ethanol là 24 h.
3.5. Định tính các chất Flavonoid có trong ngun liệu bằng các phản ứng hóa học.
Tiến hành trích ly theo quy trình ngâm chiết thu đƣợc cao flavonoid tồn phần, hịa tan cao flavonoid thu đƣợc chế phẩm hòa tan trong ethanol. Tiến hành các phản ứng đặc trƣng phát hiện nhóm chất flavonoid. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 8 h 12 h 24 h
Thời gian chiết bằng ethanol
Thời gian chiết bằng ethanol
H iệu s uất trí ch ly th eo T L K T Đ (% )
Bảng 3.7. Kết quả định tính nhóm chất flavonoid chiết xuất từ lá Diếp cá
Thuốc thử FeCl3 NaOH
Màu phản ứng Xanh đen Vàng nâu
A. Flavonoid tác dụng với Fecl3 B. Flavonoid tác dụng với NaOH
Hình 3.7. Kết quả định tính flavonoid trích ly từ lá Diếp Cá
Dựa vào màu sắc phản ứng của Flavonoid qua Bảng 3.7. và Hình 3.7. cho thấy phản ứng flavonoid với FeCl3 và NaOH phản ứng tạo màu xanh đen và phản ứng tạo màu vàng sáng đều là phản ứng dƣơng tính với nhóm Flavonol
3.6. Định tính flavonoid bằng sắc ký lớp mỏng
Việc phân tích thành phần flavonoid bằng sắc ký lớp mỏng đƣợc tiến hành trên mẫu flavonoid trích ly đƣợc từ lá Diếp cá. Để phân tích thành phần flavonoid trên bản mỏng, sử dụng phƣơng pháp sắc ký mỏng một chiều: đƣợc tiến hành trên bản mỏng Silicagel, chạy sắc ký một chiều từ dƣới lên với hệ dung môi (etyl axetat: toluene: formic acid : nƣớc = 7: 3: 1,5: 1). Sau khi chạy sắc ký xong, bản mỏng đƣợc làm khô trong tủ ấm ở nhiệt độ 32⁰ C- 37⁰ C sau đó quan sát dƣới ánh sáng thƣờng và ánh sáng tử ngoại
A B
Hình 3.8. Kết quả chạy sắc ký bản mỏng của flavonoid quan sát dƣới ánh sáng thƣờng (A) và ánh sáng tử ngoại (B)
Quan sát Hình 3.8. nhận thấy q trình trích ly flavonoid từ lá Diếp cá đã thành công, dung môi để chạy sắc ký bản mỏng cho flavonoid tách chiết từ lá Diếp cá là phù hợp. Khi quan sát dƣới ánh thƣờng trên ảnh sắc ký các vết tách ra có màu nâu nhạt mờ và hơi khó quan sát, nhƣng khi quan sát ở ánh sáng tử ngoại các vết tách ra phát quang rất dễ quan sát. Nhƣ đã biết thành phần flavonoid trong lá Diếp cá gồm các flavanol nhƣ (-)-epicatechin gallate (ECG), (-)- epigallocatechin (EGC), (-)- epigallocatechin gallate (EGCG), (-)- epicatechin (EC), (+)- gallocatechin (GC), (+)- catechin (C) và các dẫn xuất; flavonol nhƣ quercetin, kaempferol, và các dẫn xuất glycoside; flavone. Qua hình ảnh chạy sắc ký, thấy có vết tách ra từ flavonoid tách chiết từ lá Diếp cá thu đƣợc có querecetin với một hàm lƣợng nhỏ và bên cạnh đó flavonoid tách chiết từ lá Diếp cá cịn chứa các nhóm flavanol, flavone thể hiện ở các vết tách ra trên ảnh chạy sắc ký.
3.7. Khả năng kháng khuẩn của cao flavonoid chiết xuất từ lá Diếp cá
Trong dân gian, lá Diếp cá thƣờng đƣợc sử dụng để chữa một số bệnh viêm nhiễm nhƣ ghẻ lở,mụn nhọt,…đây là những bệnh liên quan tới các chủng vi khuẩn có khả năng gây viêm nhiễm bên trong và bên ngoài cơ thể. Tiến hành kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của cao Diếp cá chiết xuất từ lá diếp cá ở nồng độ 100mg/ml 4 chủng vi sinh vật kiểm định: Bacilus creaus, Sigella. Escherichia coli, Salmonella enterica.
A B
C D
Hình 3.9. Hoạt tính kháng một số chủng vi sinh vật kiểm định của flavonoid
A:Đƣờng kính vịng kháng nấm nem Bacilus creaus B: Đƣờng kính vịng kháng vi khuẩn E.coli
C:Đƣờng kính vịng kháng vi khuẩn Sigella. D:Đƣờng kính vịng kháng vi khuẩn Salmonella
Bảng 3.8. Hoạt tính kháng của một số chủng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết lá Diếp cá
Chủng vi sinh vật kiểm định Đƣờng kính vịng kháng (cm)
Vi khuẩn Bacillus cereus 2,5 ± 0,037
Vi khuẩn E.coli 1,2 ± 0,012
Vi khuẩn Salmonella 1,1 ± 0,034
Vi khuẩn Shigella 2,2 ± 0,044
Kết quả Bảng 3.8 cho thấy dịch chiết lá Diếp cá có hoạt tính kháng vi sinh