2.3.3 .Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.5.1. Xác định độ ẩm của lá và tạo nguyên liệu bột lá cây Diếp Cá
- Độ ẩm là lƣợng nƣớc tự do có trong mẫu, có thể đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sấy khô .
- Nguyên lý: dùng nhiệt làm bay hết hơi nƣớc trong mẫu. Cân trọng lƣợng mẫu trƣớc và sau khi sấy khơ, từ đó tính đƣợc phần trăm nƣớc trong mẫu.
- Tiến hành: cân khối lƣợng lá Diếp cá đã đƣợc ngắt bỏ cành vào các khay đĩa đã đƣợc sấy khô đến khối lƣợng không đổi và biết khối lƣợng chính xác. Cho khay đĩa chứa mẫu vào tủ sấy và sấy ở 80oC trong 3 giờ. Sau đó lấy khay ra thì tiến hành cân tính khối lƣợng trên cân phân tích.
Cho lại mẫu vào tủ sấy và tiến hành lặp lại quá trình trên lần thứ hai và những lần tiếp theo nữa cho đến khi khối lƣợng giữa ba lần cân liên tiếp là khơng đổi, hoặc có sai số khơng cách nhau quá 0,5mg cho mỗi gam mẫu ban đầu thì dừng quá trình sấy.
H= x 100
Trong đó:
H : là độ ẩm (%)
mo : khối lƣợng mẫu trƣớc khi sấy (g) m1 : khối lƣợng mẫu sau khi sấy (g)
2.5.2. Xác định phương pháp tách chiết
Phƣơng pháp siêu âm
Nội dung tiến hành
Cân chính xác 5g bột lá Diếp cá cho vào bình nón. Thêm 25 ml chloroform, để ở 600C trong 24h để loại hết nhựa, chất béo, caroten và chlorophyl. Sau đó chiết trên máy siêu âm Power Sonic 410 ở điều kiện nhiệt độ phòng, thời gian 30 phút. Lấy phần bột nguyên liệu ra, loại dịch chloroform, tiếp tục sấy cho bay hết chloroform rồi chiết bằng ethanol với tỷ lệ nguyên liệu: dung môi là 1:10 ở nồng độ ethanol 60% trong vòng 12h. Sau 12h thu dịch chiết ethanol và cô cạn bằng đun cách thủy đƣợc cao Diếp cá.
Cao Diếp cá đƣợc chiết lại với 30ml nƣớc cất nóng. Dịch chiết sau khi đã đƣợc lọc cho vào phễu chiết với 20ml eth yl axetat. Dồn dịch chiết ethyl axetat lại và cô cạn bằng đun cách thủy. Xác định lƣợng flavonoid
Phƣơng pháp trích ly
Nội dung tiến hành
Cân chính xác 5g bột diếp cá cho vào bình nón. Bổ sung 50 ml ethanol 60%. Ngâm trong 12 h ở 60 độ C và tách lấy dịch chiết (bằng giấy lọc). Dịch chiết đƣợc cô cạn ở nhiệt độ thấp cho đến khi đƣợc cao. Cao Diếp cá đƣợc chiết lại với 30ml nƣớc cất nóng. Thu đƣợc dịch thủy phân và bổ sung 2ml chloroform (3 lần) Loại bỏ phần màu xanh lắng xuống. Dịch chiết sau khi đã đƣợc lọc cho vào phễu chiết với 10ml ethyl axetat. Dồn dịch chiết ethyl axetat lại và cô cạn bằng đun cách thủy. Cân xác định trọng lƣợng flavonoid đã chiết
2.5.3. Xác định loại alcohol thích hợp cho q trình tách chiết
Cân chính xác 5g bột lá Diếp cá cho vào bình nón. Thêm 25 ml chloroform, để ở 600C trong 24h để loại hết nhựa, chất béo, caroten và chlorophyll loại dịch chiết tiếp tục sấy cho bay hết chloroform. Tiếp tục chiết bằng ethanol, methanol, butanol, propanol với tỷ lệ dung môi 1:10 và đem ngâm trong 600C trong 12 h lọc lấy dịch chiết và đem đi đo OD490nm
2.5.4. Xác định nồng độ dung mơi
Cân chính xác 5g bột lá Diếp cá cho vào bình nón. Thêm 25 ml chloroform, để ở 600C trong 24h để loại hết nhựa, chất béo, caroten và chlorophyll tiếp tục sấy cho bay hết chloroform.Tiếp tục chiết bằng ethanol ở các nồng độ khác nhau và đem ngâm trong 600C trong 12 h lọc lấy dịch chiết và đem đi đo OD600nm
2.5.5. Tách chiết hợp chất flavonoid theo phương pháp trích ly
Sơ đồ tách chiết hợp chất flavonoid theo phƣơng pháp trích ly
Sấy khô Xay bột Chiết bằng Alcohol Cô cạn ở nhiệt độ thấp Bổ sung 30 ml nƣớc nóng Bổ sung 2ml Chloroform (3 lần) Loại bỏ phần màu xanh lắng xuống
Bổ sung 10ml Ethyl Acetate Loại bỏ phần lắng ở dƣới Cô cạn ở nhiệt độ thấp Diếp Cá Dịch chiết 5g bột lá Cao diếp cá
Dịch hòa tan lá Diếp cá
Dịch chiết lá diếp cá
Dịch chiết
2.5.5.1. Xác định ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng trích ly.
Tiến hành: Cân chính xác 5g bột diếp cá cho vào bình nón. dung mơi là 1:10 ở các nồng độ ethanol 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%.Ngâm trong 12 tiếng tách lấy dịch chiết (bằng giấy lọc) và ngâm 3 lần trong 60 độ C. Dịch chiết đƣợc cô cạn ở nhiệt độ thấp cho đến khi đƣợc cao. Cao ethanod đƣợc chiết lại với 30ml nƣớc cất nóng. Thu đƣợc dịch thủy phân và bổ sung 2ml chloroform (3 lần) Loại bỏ phần màu xanh lắn xuống. Dịch chiết sau khi đã đƣợc lọc cho vào phễu chiết với 10ml etyl axetat. Dồn dịch chiết ethyl axetat lại và cô cạn bằng đun cách thủy. Cân xác định trọng lƣợng flavonoid đã chiết đƣợc ở các nồng độ cồn khác nhau để xác định công thức với nồng độ ethanol thích hợp cho chiết suất flavonoid đạt hiệu suất cao nhất.
2.5.5.2. Xác định ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu / dung mơi đến khả năng trích ly
Sử dụng nồng độ ethanol cho hiệu suất trích ly flavonoid cao nhất ở thí nghiệm trên để thực hiện khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu: dung môi. Khảo sát ở các tỷ lệ nguyên liệu bột lá Diếp cá : dung môi ethanol là 1/5; 1/10; 1/12; 1/20. Hàm lƣợng Flavonoid trích ly đƣợc tƣơng ứng với mỗi cơng thức thí nghiệm đƣợc sử dụng xác định tỷ lệ nguyên liệu / dung môi tối ƣu nhất.
2.5.5.3. Xác định ảnh hưởng của thời gian chiết bằng ethanol đến khả năng trích ly
Sử dụng nồng độ cồn và tỷ lệ ngun liệu: dung mơi cho hiệu suất trích ly flavonoid cao nhất ở trên để khảo sát ảnh hƣởng của thời gian chiết bằng ethanol đến khả năng trích ly flavonoid. Khảo sát ở 8h, 12h, 24h. Hàm lƣợng flavonoid chiết suất đƣợc là cơ sở cho lựa chọn thời gian trích ly tốt nhất.
2.5.6. Xác định sự có mặt của flavonoid trong dịch chiết
2.5.6.1 Định tính flavonoid bằng các phản ứng màu đặc trưng
+) Phản ứng với FeCl3 5%: hút 50µl dịch chiết flavonoid + 2-3 giọt FeCl3 5%. Phản ứng dƣơng tính sẽ cho màu lục, xanh đen, xanh lam và nâu tùy
+) Phản ứng với NaOH 10%: hút 50µl dịch chiết flavonoid + 2-3 giọt NaOH 10%. Phản ứng dƣơng tính sẽ cho màu đỏ, da cam
Phản ứng tạo ra muối phenolat có màu khác nhau tùy thuộc vào nồng độ flavonoid và tùy theo nhóm flavonoid. Nhóm flavon và flavonol cho màu vàng sáng, anthocyanidin cho màu xanh dƣơng, auron có thể cho màu đỏ, da cam [6].
2.5.7. Định tính flavonoid bằng phương pháp chạy sắc ký
Nguyên tắc: Dựa trên sự tƣơng tác khác nhau giữa các thành phần trong hỗn hợp với dung môi và pha tĩnh, do mỗi thành phần có độ phân cực khác nhau
Dung môi chạy sắc ký:
ethyaxetat: toluen: axit fomic: nƣớc =7:3:1,5:1 Tiến hành:
Chuẩn bị: Hoạt hóa bản màng silicagel gel bằng cách sấy 2 giờ ở 80°, để ở nhiệt độ phòng 30 phút
Chấm mẫu flavonoid lên bản mỏng
- Hịa tan mẫu flavonoid tách chiết theo quy trình bằng ethyacetat
- Dùng pipet hút một ít mẫu đã hịa tan chấm lên bản mỏng, khoảng cách vết chấm cách bờ dƣới 1cm, hai bờ bên 0,5cm và khoảng cách giữa các vết chấm cách nhau 0,6cm. Kích thƣớc các vết chấm cách vừa phải.
Triển khai bản mỏng:
- Chuẩn bị bình triển khai: rửa sạch, sấy khơ.
- Pha hệ dung môi triển khai vào bình lần lƣợt theo các tỷ lệ xác định: ethyaxetat: toluen: axitfomic: nƣớc= 7:3:1,5:1
- Đặt một tấm giấy lọc vào bình triền khai.
- Bão hịa dung mơi trong bình triển khai từ 15-20 phút.
- Dùng kẹp cho bản mỏng đã chấm mẫu vào bình triển khai, đậy nắp bình lại.
- Theo dõi vạch dung môi di chuyển đến cạnh mép trên của tấm bản mỏng khoảng 0,5 cm thì lấy bản mỏng ra khỏi bình triển khai.
- Sấy nhẹ bản mỏng để đuổi hết dung môi. - Phát hiện vết qua màu sắc tự nhiên.
2.5.8. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật của flavonoidchiết xuất từ lá Diếp cá Diếp cá
Mục đích : xác định khả năng kháng khuẩn của dịch chiết flavonoid từ lá diếp cá đối với 4 loại vi khuẩn là Escherichica coli, Salmonella typhi, Bacillus
subtillis, sigella theo phƣơng pháp dung dịch khuếch tán, xác định vòng kháng
khuẩn.
Các bƣớc tiến hành:
B1:Khử trùng bàn tay bằng cồn 70%
trƣớc khi cho tay vào box cấy.
B2:Đổ mơi trƣờng thích hợp đã chuẩn bị vào đĩa petri đã khử trùng để khoảng 30 phút cho mặt thạch thật khô ráo.
B3:Dùng pipet man vô trùng nhỏ dịch các chủng vi sinh vật đã đƣợc nuôi lên sinh khối trong môi trƣờng lên trên đĩa môi trƣờng LB
B4 :Dùng que trang trải đều lên khắp mặt thạch. B5 :Sau đó tiến hành đục lỗ bằng đầu lớn của pipet
-Dùng pipet vơ trùng nhỏ 0,1ml dịch flavonoid (pha lỗng với cồn với tỷ lệ 100mg/1ml) vào các lỗ thạch và để trong tủ lạnh 2 h sau đó ấy ra và để trong tủ ấm ở nhiệt độ 50°C. Sau 24-48 giờ quan sát vòng kháng vi sinh vật tạo thành và đo đƣờng kính kháng vi sinh vật
PHẦN 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định độ ẩm của lá và tạo nguyên liệu bột lá Diếp cá
Nƣớc có vai trị rất quan trọng đối với cơ thể sống, nƣớc cịn là mơi trƣờng cho vi sinh vật trong thực phẩm phát triển. Nhƣ vậy muốn bảo quản để sử dụng lâu dài cần quản lý tốt nồng độ nƣớc có trong nguyên liệu. Xác định đƣợc lƣợng nƣớc có trong nguyên liệu từ đó để có phƣơng pháp bảo quản tốt nguồn nguyên liệu, tiến hành đánh giá chất lƣợng nguyên liệu Diếp cá bằng phƣơng pháp xác định độ ẩm của lá diếp cá và nguyên liệu bột lá Diếp cá cho quá trình tách chiết. Độ ẩm của lá Diếp cá đƣợc xác định và tổng hợp ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả xác định độ ẩm của lá Diếp cá
STT Khối lƣợng mẫu trƣớc khi sấy(g)
Khối lƣợng mẫu sau khi sấy(g) Độ ẩm %
Khối lƣợng mẫu sau khi cân lần 1 (g)
Khối lƣợng mẫu sau khi cân lần 2
(g)
Khối lƣợng mẫu sau khi cân lần 3
(g)
1 50,0012 6,7252 6,6835 6,5784 86,67 ± 2
2 50,1111 6,9174 6,9368 6,8126 86,25 ± 2
3 50,002 6,6715 6,6253 6,5145 86,79 ± 2
Hình 3.1. Lá Diếp cá và bột lá Diếp cá
Nhận xét: Độ ẩm trung bình có trong lá Diếp cá là 86,57%.
3.2. Xác định phƣơng pháp tách chiết
Kết quả xác định phƣơng pháp tách chiết flavonoid đƣợc thể hiện ở Bảng 3.2
Bảng 3.2 Kết quá xác định phƣơng pháp tách chiết
Phƣơng pháp Khối lƣợng bột diếp cá (g) Hàm lƣợng flavonoid thu đƣợc (g) Hiệu suất trích ly theo TLKTD (%) Siêu âm 5 0.1528 3,056 ± 0,81 Trích ly 5 0.1821 3,642 ± 0,62
Từ kết quả Bảng 3.2 cho thấy đƣợc hiệu suất trích ly của phƣơng pháp trích ly cao hơn phƣơng pháp siêu âm nên ta áp dụng phƣơng pháp trích ly
3.3 Xác định loại Alcohol thích hợp cho q trình tách chiết
Loại alcohol dùng tách chiết là yếu quan trọng trong quá trình tách chiết để đạt hiệu quả cao nhất và đƣợc thể hiện ở Bảng 3.3
Bảng 3.3 Kết quả đo OD của các loại Alcohol
Dung môi Trị số OD490nm
Ethanol 2,906 Methanol 2,900 Butanol 1,364 Propanol 1,138
Hình 3.2 Dịch chiết các loại Alcohol
A. Dịch chiết methanol B. Dịch chiết propanol C. Dịch chiết butanol D. Dịch chiết ethanol
Từ Bảng 3.3 cho thấy chỉ số đo OD490nm của dịch chiết ethanol là 2,906 còn propanol là 1,138 còn dịch chiết methanol cũng có chỉ số đo OD khá cao gần băng ethanol nhƣng do methanol có tích chất hóa học độc hơn ethanol nên khóa luận này chọn dung mơi ethanol là dung mơi tách chiết chính.
3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố công nghệ đến khả năng trích ly theo phƣơng pháp ngâm chiết.
3.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ ethanol
Dung môi chiết là một trong những yếu tố quan trọng có ảnh hƣởng đến q trình chiết xuất các hợp chất tự nhiên có trong thực vật. Cả hiệu quả chiết xuất và hoạt tính của các chất chiết xuất phụ thuộc rất lớn vào dung môi và nồng độ dung môi. Việc lựa chọn nồng độ dung môi ảnh hƣởng trực tiếp đến việc hiệu suất tách chất ra khỏi ngun liệu. Flavonoid là hợp chất có tính phân cực mạnh do đó thơng thƣờng sử dụng các chất có độ phân cực mạnh nhƣ methanol, ethanol hay nƣớc làm dung mơi trích ly. Flavonoid có khả năng hịa tan tốt trong cả methanol và ethanol nhƣng do methanol là chất có độc tính cao nên đề tài tiến hành lựa chọn ethanol ở các nồng độ khác nhau để trích ly. Kết quả nghiên cứu đƣợc thể hiện trong Bảng 3.4. và Hình 3.3 và Hình 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid Nồng độ ethanol (%) Khối lƣợng bột Diếp cá(g) Trị số OD600nm Hàm lƣợng flavonoid thu đƣợc (g) Hiệu suất trích ly theo TLKTĐ(%) 50% 5 0,05 0,1174 2,348 ± 0,052 60% 5 0,16 0,1602 3,204 ± 0,066 70% 5 0,25 0,1685 3,370 ± 0,075 80% 5 0,46 0,1708 3,404 ± 0,084 90% 5 0,83 0,1726 3,452 ± 0,091 100% 5 0,90 1,757 3,514 ± 0,11 .
Hình 3.4. Biểu đồ ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 50% 60% 70% 80% 90% 100% Nồng độ ethanol Nồng độ ethanol H iệu s uất trí ch ly th eo T L K T Đ (% )
Kết quả ở Bảng 3.4 và Hình 3.4. cho thấy khi trích ly ở các nồng độ ethanol khác nhau cho hiệu suất trích ly flavonoid khác nhau dao động trong khoảng 2,348% - 3,514%. Hiệu suất trích ly flavonoid tăng lên khi chiết ở nồng độ ethanol từ 50% -100%, trong đó ethanol 100% cho hiệu suất trích ly cao nhất là 3,514 %. Vì vậy nồng độ ethanol thích hợp để thực hiện quá trình trích ly flavonoid trong lá diếp cá là 100%.
3.4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ ngun liệu / dung mơi ethanol
Q trình trích ly đƣợc thực hiện dựa vào tính hịa tan tốt của hoạt chất sinh học trong dung môi hữu cơ, đây là q trình chuyển khối do có sự chênh lệch nồng độ nguyên liệu và dòng chảy bên ngồi (dung mơi). Vì vậy để nghiên cứu hiệu suất trích ly flavonoid cần nghiên cứu ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu / dung môi, em tiến hành khảo sát các tỷ lệ: nguyên liệu / dung môi : 1/5, 1/10, 1/15, 1/20. Các kết quả thí nghiệm đƣợc thể hiện ở Bảng 3.5 và Hình 3.5
Bảng 3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu / dung mơi ethanol đến hiệu suất trích ly
Tỷ lệ nguyên liệu: dung môi
ethanol (g/ml) Khối lƣợng bột diếp cá (g) Hàm lƣợng flavonoid thu đƣợc (g) Hiệu suất trích ly theo TLKTĐ(%) 1/5 5 0,1295 2,590 ± 0,06 1/10 5 0,1757 3,514 ± 0,07 1/15 5 0,1801 3,602 ± 0,08 1/20 5 0,1851 3,702 ± 0,10
Hình 3.5. Biểu đồ ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi ethanol đến hiệu suất trích ly flavonoid
Qua Bảng 3.5. và Hình 3.5. cho thấy hiệu suất trích ly flavonoid tăng lên khi tỷ lệ: nguyên liệu / dung môi tăng. Từ tỷ lệ 1/5 đến 1/10 hiệu suất trích ly tăng nhanh từ 2,590% lên 3,702% nhƣng từ tỷ lệ 1/10 lên 1/15 và 1/15 lên 1/20 thì hiệu suất trích ly tăng nhƣng không đáng kể. Theo báo cáo tổng hơp kết quả đề tài cấp bộ nghiên cứu quy trình cơng nghệ chiết tách các flavonoid từ phế thải diếp cá, rau quả nhằm ứng dụng trong thực phẩm chức năng của Lý Ngọc Trâm cũng đã chỉ ra tỷ lệ nguyên nguyên liệu / dung mơi ethanol thích hợp nhất để trích ly flavonoid từ phế thải Diếp cá bằng phƣơng pháp trích ly động ở nhiệt độ 60oC là 1/10 đạt hiệu suất trích ly cao nhất ở tỷ lệ nguyên liệu / dung môi là 1/20, nhƣng để tiết kiệm dung môi hay để tăng hiệu quả kinh tế cho q trình trích ly thì chọn tỷ lệ nguyên liệu / dung môi là 1/10 sẽ phù hợp vì khi tỷ lệ