(TIỂU LUẬN) báo cáo KHOÁ LUẬN tốt NGHIỆP đề tài NGHIÊN cứu THIẾT lập DÒNG cá NGỰA vằn KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC vụ NGHIÊN cứu OXY hóa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VĂN HIẾN KHOA KỸ THUẬT – CƠNG NGHỆ BÁO CÁO KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HĨA TP HỒ CHÍ MINH – 2022 Chương – Tổng quan BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VĂN HIẾN KHOA KỸ THUẬT – CÔNG NGHỆ BÁO CÁO KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HĨA TP HỒ CHÍ MINH – 2022 Chương – Tổng quan i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin trân trọng cảm ơn hai Thầy Cô hướng dẫn em TS Nguyễn, thầy tận tình hướng dẫn em q trình học tập việc hoàn thành thực tập tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô thuộc khoa Kỹ Thuật – Công Nghệ trường Đại Học Văn Hiến tận tình giảng dạy cho em thời gian học tập Xin cảm ơn Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện giúp em hồn thành học phần khố luận tốt nghiệp thật tốt Tuy vậy, thời gian có hạn, nhiều hạn chế kiến thức kinh nghiệm nên không tránh khỏi sai sót q trình hồn thành báo cáo Vì vậy, em mong nhận đóng góp ý kiến TS Nguyễn để em khắc phục thiếu sót hồn thiện báo cáo khố luận Em xin chân thành cảm ơn! Tp Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng năm 2022 Sinh viên thực Nguyễn Văn A ii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, tự thưc hiên, không chép, vay mượn từ cơng trình nghiên cứu khoa học khác Đảm bảo tài liệu tham khảo trích dẫn, ghi đầy đủ Tp.Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng 04 năm 2022 Sinh viên thực Nguyễn Văn A iii NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN Tp.Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng 04 năm 2022 Giảng viên hướng dẫn TS Nguyễn MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Đối tượng nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Các kết đạt đề tài Kết cấu khoá luận tốt nghiệp CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1Giới thiệu kỹ thuật knockout gene 1.2Tổng quan hệ thống CRISPER-Cas9 1.3 Định nghĩa hệ thống keap1-nrf2 1.3.1 Lịch sử tiền khám phá Nrf2 1.3.2 Khám phá Nrf2: phân t 1.3.3 Lịch sử khám phá KEAP1: B 1.3.4 Tổng quan chức hệ thống phân tử KEAP1-NRF2 1.3.5 Cơ chế bảo tồn hệ thống KEAP1-NRF2 loài động vật có xương sống 1.3.6 Cơ chế điều hoà hoạt động hệ thống KEAP1-NRF2 1.3.7 Chức hệ thống KEAP1-NRF2 cân oxy hoá khử bảo vệ tế bào 1.4Ứng dụng trị liệu hệ thống KEAP1-NRF2 1.5Hệ thống KEAP1-NRF2 cá ngựa vằn 1.6Khả thành cơng 1.7Tính mới, tính thời 1.8Ý nghĩa khoa học cần thiết vấn đề cần nghiên cứu 1.9Giới thiệu chung cá ngựa vằn 1.9.1 Giới thiệu chung 1.9.2 Lịch sử phân bố tự nhiên 1.9.3 Đặc tính sinh học 1.9.4 Bộ gen cá ngựa vằn CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1Thời gian địa điểm nghiên cứu v 2.2 Vật liệu hoá chất nghiên cứu 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Phương pháp chuẩn bị chuỗi RNA hướng dẫn đơn -single guilde RNA (sgRNA) Cas9 mRNA 27 Vị trí sgRNA Nrf2 27 2.3.2 Loại bỏ gen CRISPR-Cas Phương pháp vi tiêm 32 Cá ngựa vằn hoang dại AB sử dụng cho sinh sản để tiến hành loại bỏ gen 32 Đầu tiên chuẩn hóa 10 nmol 100 bases Alt-R CRISR-Cas9 sgRNA Nrf2 cách thêm 100 µL nuclease free duplex buffer (IDT) để có nồng độ cuối 100 µM 32 Tiếp theo pha loãng Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg (10 µg/µL) (10 µg/µL Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3 0.5 µL; Cas9 working protein buffer (20 mM HEPES; 150 mM KCl 7.5 pH) 9.5 µL, để đạt nồng độ cuối 0.5 µg/µL Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3) 32 2.4 Xác định kiểu gen 33 2.4.1 Cắt đuôi cá, tách DNA 34 2.4.2 Chạy PCR mẫu cá F1 Nrf2 36 2.5 GIẢI TRÌNH TỰ 41 2.5.1 Tinh mẫu 41 CHƯƠNG 3KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 Vi tiêm tạo cá knockout gen 47 3.2 Giải trình tự cá knockout gen keap1b 49 3.3 Kết luận 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 vi DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, LƯU ĐỒ, HÌNH Danh mục hình Hình 1.1 Spacer, protospacer PAM Protospacer DNA đích; PAM tiếp giáp với DNA sợi đôi nhắm mục tiêu Phần đệm (Spacer) phần RNA dẫn đường gắn kết với protospacer 15 Hình 1.2 Chỉnh sửa gen CRISPR-Cas9 Hình thành RNP (bước 1) xảy bên tế bào phịng thí nghiệm Đầu tiên, CRISPR RNA (crRNA) CRISPR RNA chuyển hóa (tracrRNA) kết hợp với nhau, tạo thành RNA dẫn đường (gRNA) hoàn chỉnh Tiếp theo, gRNA liên kết với enzyme Cas, tạo thành ribonucleoprotein (RNP) Nếu q trình hình thành RNP thực phịng thí nghiệm, RNP sau phải chuyển đến tế bào Trong bước 2, gRNA hướng RNP đến mục tiêu bên tế bào Sau mục tiêu phân tách (bước 3) 16 Hình 1.3 Các kết xảy sau phân tách DNA gen Các đường sửa chữa DNA tế bào chẳng hạn nối kết cuối không tương đồng (NHEJ) dẫn đến xóa (deletion), thay đổi trình tự (changed sequences) chèn nhỏ (small insertion) 17 Hình 1.4 Sửa chữa theo hướng tương đồng (HDR) kết hợp trình tự vào DNA gen Các trình tự nhỏ thay đổi cho mục đích chỉnh sửa sửa đổi gen (trái), trình tự lớn tồn gen thêm vào cách ngẫu nhiên (phải) 18 Hình 1.5 Các dạng gRNA khác sử dụng để loại bỏ gen Trong nghiên cứu này, lựa chọn dạng sgRNA (bao gồm crRNA tracrRNA) sgRNA có tính bền khơng cần ủ nhiệt trước chuyển vào phôi cá ngựa vằn 20 Hình 1.6 Vị trí PAM gRNA Cas9 Vị trí PAM nằm chuỗi DNA khơng nằm mục tiêu trình tự loại bỏ gen RNA dẫn đường liên kết với sợi mục tiêu RNA dẫn đường hình RNA dẫn đường hai phần, bao gồm crRNA tracrRNA 21 Hình 1.7 So sánh hai phần gRNA (A) sgRNA (B) Cả hai loại gRNA thêm vào Cas9 để tạo thành Ribonucleoprotein (RNP), sau phân phối đến tế bào 22 Hình 1.8 Cơ chế phân tử hệ thống KEAP1-NRF2 kích hoạt gen mục tiêu NRF2 điều kiện căng thẳng 25 vii Hình 1.9 Một tóm tắt dư lượng cystein Keap1 Việc bảo tồn cystein định sau: O: bảo tồn; ∆: Không bảo tồn cysteine tồn ba axit amin; X: không bảo tồn Các cystein cảm biến tô màu đỏ, xanh xanh dương Mm: chuột; Hs: người; Ol: cá medaka; Dr: cá ngựa vằn 26 Hình 1.10 Mã Cysteine phản ứng dựa KEAP1 rối loạn oxy hóa khử khác Ba gốc cystein chính, Cys151, Cys273 Cys288, KEAP1 chịu trách nhiệm cho phản ứng nhiều loại electrophile OA-NO2, axit béo nitro; 4HNE, 4-hydroxynonel 27 Hình 1.11 Các điểm mạnh sử dụng mơ hình cá ngựa vằn nghiên cứu sinh học phân tử 31 Hình 1.12 Cá ngựa vằn đực 34 Hình 1.13 Sự tương quan gen người, gà, chuột cá ngựa vằn Hình 2.1 Hệ thống ni cá bàn làm việc, thí nghiệm phịng Cơng nghệ Sinh học Thủy sản, Trung tâm Công nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh 36 Hình 2.2 Vị trí kế vị trí Neh2 domain (exon 2) gen cá ngựa vằn Biểu đồ tạo phần mềm Snapgen 2.3.2 39 Hình 2.3 Trang web (http://chopchop.cbu.uib.no) hỗ trợ thiết kế vị trí chuỗi RNA hướng dẫn đơn (sgRNA) gen Nrf2 cá ngựa vằn Cụ thể, nhập tên gen (trong nghiên cứu gen nfe2l2a) vào mục “Target”, bấm chọn Danio rerio (danRer11/GEC11) mục “In” Tiếp theo chọn CRISPR/Cas9 mục “Using” knockout mục “For” Cuối bấm vào nút cuối “Find Target Sites” 40 Hình 2.4 Vị trí sgRNA nfe2l2a (Nrf2) cá ngựa vằn thiết kế từ http://chopchop.cbu.uib.no/ Rank: với trình tự mục tiêu: TGGATCTGATCGATATCCTGTGG lựa chọn (trình tự PAM gạch chân) 41 Hình 2.5 Lựa chọn cặp mồi để phát indel sau knockout gen Nrf2 CRISPR-Cas9 cá ngựa vằn Cặp mồi thiết kế sẵn có từ trang web http://chopchop.cbu.uib.no sau thiết kế sgRNA keap1b viii Cụ thể cặp mồi Nrf2.hma.f1: 5’- ctaGTGTGTGATGCCTGACCTC Nrf2.hma.r1: 5’- CAGTGTcttctcctgctcctg lựa chọn 41 Hình 2.6 sgRNA Nrf2 cá ngựa vằn tổng hợp từ công ty IDT 42 Hình 2.7 Thiết lập bể cho đẻ cá ngựa vằn dịng cá AB A: Bể tích 1.5 lít nước Bể đẻ bố trí cá cá đực B: Trứng cá ngựa vằn dòng AB sau đẻ thu để đĩa petri sẵn sàng phục vụ vi tiêm Trứng màu trắng đục trứng không thụ tinh Trứng màu suốt trứng phát triển tốt 43 Hình 2.8 Đĩa petri bên trái chứa 50 µL Ben zocaine (chất gây mê) với 50 mL nước Đĩa petri bên phải chứa nước 45 Hình 2.9 Các dụng cụ cần chuẩn bị để tiến hành cắt đuôi cá 46 Hình 2.10 Thao tác bỏ đuôi cá cắt vào ống eppendorf chứa TNEST 47 Hình 2.11 Tiến hành bỏ mẫu vào để chạy PCR 49 Hình 2.12 Bơm mẫu vào giếng gel 51 Hình 2.13 Quá trình chạy điện di 52 Hình 2.14 Kết sau chạy điện di 53 Hình 2.15 Cách pha Exo SAPit để tinh sản phẩm PCR 53 Hình 2.16 Hoá chất EXP SAPit 54 Hình 2.17 Spindown mẫu 55 Hình 2.18 Quá trình ly tâm mẫu 56 Hình 2.19 Bỏ mẫu vào máy để chuẩn bị sấy khô 57 Hình 2.20 Bỏ vào máy tác dụng nhiệt 57 Hình 2.21 Máy giải trình tự gen 3500XL - hãng Applied Biosystems Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh 58 Hình 3.1 Điện di kiểm tra hiệu sau vi tiêm sgRNA Nrf2 vào phôi cá ngựa vằn giai đoạn F0 (4 ngày sau vi tiêm) 59 Trang 43 NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HĨA Hình 2.19 Bỏ mẫu vào máy để chuẩn bị sấy khô Chương – Vật liệu phương pháp nghiên cứu Trang 44 NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HĨA Hình 2.20 Bỏ vào máy tác dụng nhiệt Hình 2.21 Máy giải trình tự gen 3500XL - hãng Applied Biosystems Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Chương – Vật liệu phương pháp nghiên cứu Trang 45 NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HÓA CHƯƠNG 3KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Vi tiêm tạo cá knockout gen sgRNA Nrf2 với Cas9 protein vi tiêm vào giai đoạn phôi tế bào cá ngựa vằn Hiệu vi tiêm kiểm tra sau ngày Hình 3.1 Điện di kiểm tra hiệu sau vi tiêm sgRNA Nrf2 vào phôi cá ngựa vằn giai đoạn F0 (4 ngày sau vi tiêm) Chương – Kết thảo luận Trang 46 NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HĨA Hình 3.2 Kết chạy PCR xác định cá ngựa vằn knockout gen Nrf2 hệ F1 (được lai từ cá F0 cá hoang dại) Kết có 03 dịng (Cá 2; cá 5) knockout gen Nrf2 thành công tạo Qua kết cho thấy, cá ngựa vằn sau vi tiêm sgRNA-Keap1a/Cas9 giai đoạn 01 tế bào, xác định hiệu vi tiêm knockout phương pháp PCR với cặp mồi keap1a-hma-f1 (5’-TTGTGCCTGTATTTCTTCATGG) keap1a-hma-r1 (5’GCCTCTCCATTGAATCTGTGTT), cho kết thành cơng tạo band hetetoduplex (hình 1) hệ F0 (4 ngày sau vi tiêm) Các dịng cá F0 ni lớn sau 3-4 tháng đạt giai đoạn thành thục cho lai với cá hoang dại Các phôi cá nở sau ngày sử dụng tiến hành chạy PCR với cặp mồi Keap1a-seq-f1 (5’-TTTCAACAATGCCAACCTGG) Keap1a-seq-r1 (5’- GCCTCTCCATTGAATCTGTGTT) kiểm tra dịng cá knockout gen keap1a hay khơng Kết hình cho thấy, có dịng kiểm tra knocout gen thành cơng Dịng (mẫu 2.6 có bp deleted); dòng (mẫu 2.10 bp deleted); dòng (mẫu 2.11 24 bp deleted + 21 bp insert = bp deleted) Chương – Kết thảo luận Trang 47 NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HĨA 3.2 Giải trình tự cá knockout gen keap1b Hình 3.3 Giải trình tự xác định cá ngựa vằn knocout gen keap1b hệ F1 Kết có 02 dịng knockout gen keap1a thành cơng Dịng (mẫu có bp deleted); dịng (mẫu 15 bp deleted) Hình 3.4 cặp mồi nrf2-seq-f5 chạy điện di cặp mồi nrf2-seq-f1 chạy giải trình tự Chương – Kết thảo luận Trang 48 NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HĨA Hình 3.5 Kết sau giải trình tự Qua kết cho thấy, cá ngựa vằn sau vi tiêm sgRNA-Keap1b/Cas9 giai đoạn 01 tế bào, xác định hiệu vi tiêm knockout phương pháp PCR với cặp mồi keap1b-hma-f1 (5’- GTGTGTATGATGTGTGCGTGTC) keap1b-hma-r1 (5’-CTCCAGCGTGTAGCTGAAGAC), cho kết thành cơng tạo band hetetoduplex (hình 3) hệ F0 (4 ngày sau vi tiêm) Các dòng cá F0 nuôi lớn sau 3-4 tháng đạt giai đoạn thành thục cho lai với cá hoang dại Các phôi cá nở sau ngày sử dụng tiến hành chạy PCR với cặp mồi Keap1b-seq-f1 (5’CCCCCTCAGGATTCGCGT) Keap1b-seq-r1 (5’CGACGTGTGTGTCGAGCG) kiểm tra dòng cá knockout gen keap1a hay khơng Kết hình cho thấy, có dịng kiểm tra knocout gen thành cơng Dịng (mẫu có bp deleted); dịng (mẫu 15 bp deleted) Các dòng cá F1 nuôi lớn cho sinh sản tạo cá F2 Các dịng cá F2 ni sàn lọc tạo dịng ổn định phục vụ cho thí nghiệm Chương – Kết thảo luận Trang 49 NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HĨA Tóm lại, chủ nhiệm đề tài tạo dòng cá knockout gen keap1a keap1b theo tiến độ đề tài Hình 3.6 Cá F1 cho lai tạo dịng cá ổn định hệ hệ F2 knockout gen Nrf2 Chương – Kết thảo luận Trang 50 NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HĨA Hình 3.7 Giàn cá chuyển gen Nrf2 Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Hình 3.8 Cá chia đực, rõ ràng Chương – Kết thảo luận Trang 51 NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HĨA Hình 3.9 Mơ tả tóm tắt phương pháp tạo dòng cá knockout gen ổn định đến hệ F2 phương pháp CRISPR-Cas9 3.3 Kết luận Đã tạo dòng cá knockout gen Nrf2 CRISPR-Cas9 Kết luận kiến nghị Chương – Kết thảo luận Trang 52 NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HÓA TÀI LIỆU THAM KHẢO Bannikov A V., Lavrov A V (2017) CRISPR/CAS9, the king of genome editing tools Mol Biol 51:514–525 Benson AM, Hunkeler MJ, Talalay P (1980) Increase of NAD(P)H: quinone reductase by dietary antioxidants: Possible role in protection against carcinogenesis and toxicity Proc Natl Acad Sci U S A 77:5216–5220 https://doi.org/10.1073/pnas.77.9.5216 Blackwell TK, Steinbaugh MJ, Hourihan JM, et al (2015) SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans Free Radic Biol Med 88 https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2015.06.008 Blake DJ, Singh A, Kombairaju P, et al (2010) Deletion of Keap1 in the lung attenuates acute cigarette smoke-induced oxidative stress and inflammation Am J Respir Cell Mol Biol 42:524–536 https://doi.org/10.1165/rcmb.2009-0054OC Chan K, Lu R, Chang JC, Kan YW (1996) NRF2, a member of the NFE2 family of transcription factors, is not essential for murine erythropoiesis, growth, and development Proc Natl Acad Sci U S A 93:13943–13948 https://doi.org/10.1073/pnas.93.24.13943 Chang N, Sun C, Gao L, et al (2013) Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in Zebrafish embryos Cell Res 23:465–472 https://doi.org/10.1038/cr.2013.45 Cleasby A, Yon J, Day PJ, et al (2014) Structure of the BTB domain of Keap1 and its interaction with the triterpenoid antagonist CDDO PLoS One https://doi.org/10.1371/journal.pone.0098896 Cong L, Ran FA, Cox D, et al (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems Science (80- ) 339:819–823 https://doi.org/10.1126/science.1231143 de Zeeuw D, Akizawa T, Audhya P, et al (2013) Bardoxolone Methyl in Type Diabetes and Stage Chronic Kidney Disease N Engl J Med 369:2492–2503 https://doi.org/10.1056/NEJMoa1306033 Debaun JR, Smith JYR, Miller EC, Miller JA (1970) Reactivity in vivo of the carcinogen N-hydroxy-2-acetylaminofluorene: Increase by sulfate ion Science (80- ) 167:184–186 https://doi.org/10.1126/science.167.3915.184 Delmastro-Greenwood M, Freeman BA, Wendell SG (2014) Redox-Dependent AntiInflammatory Signaling Actions of Unsaturated Fatty Acids Annu Rev Physiol 76:79– 105 https://doi.org/10.1146/annurev-physiol-021113-170341 Trang 53 NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HÓA Dinkova-Kostova AT, Fahey JW, Kostov R V., Kensler TW (2017) KEAP1 and done? Targeting the NRF2 pathway with sulforaphane Trends Food Sci Technol https://doi.org/10.1016/j.tifs.2017.02.002 Eggler AL, Small E, Hannink M, Mesecar AD (2009) Cul3-mediated Nrf2 ubiquitination and antioxidant response element (ARE) activation are dependent on the partial molar volume at position 151 of Keap1 Biochem J 422:171–80 https://doi.org/10.1042/BJ20090471 Egner PA, Chen JG, Zarth AT, et al (2014) Rapid and sustainable detoxication of airborne pollutants by broccoli sprout beverage: Results of a randomized clinical trial in China Cancer Prev Res 7:813–823 https://doi.org/10.1158/1940-6207.CAPR-14-0103 Endo Y, Muraki K, Fuse Y, Kobayashi M (2020) Evaluation of antioxidant activity of spice-derived phytochemicals using zebrafish Int J Mol Sci 21 https://doi.org/10.3390/ijms21031109 Fourquet S, Guerois R, Biard D, Toledano MB (2010) Activation of NRF2 by Nitrosative Agents and H O Involves KEAP1 Disulfide Formation J Biol Chem 285:8463–8471 https://doi.org/10.1074/jbc.M109.051714 Harper C, Lawrence C (2011) The laboratory zebrafish Howe K, Clark MD, Torroja CF, et al (2013) The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome Nature 496: https://doi.org/10.1038/nature12111 Hruscha A, Krawitz P, Rechenberg A, et al (2013) Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish Dev 140:4982–4987 https://doi.org/10.1242/dev.099085 Huerta C, Jiang X, Trevino I, et al (2016) Characterization of novel small-molecule NRF2 activators: Structural and biochemical validation of stereospecific KEAP1 binding Biochim Biophys Acta - Gen Subj 1860 https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2016.07.026 Hwang WY, Fu Y, Reyon D, et al (2013) Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system Nat Biotechnol 31:227–229 https://doi.org/10.1038/nbt.2501 Itoh K, Chiba T, Takahashi S, et al (1997) An Nrf2/Small Maf Heterodimer Mediates the Induction of Phase II Detoxifying Enzyme Genes through Antioxidant Response Trang 54 NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HÓA Elements Biochem Biophys Res Commun 236:313–322 https://doi.org/10.1006/bbrc.1997.6943 Itoh K, Igarashi K, Hayashi N, et al (1995) Cloning and Characterization of a Novel Erythroid Cell-Derived CNC Family Transcription Factor Heterodimerizing with the Small Maf Family Proteins Itoh K, Ishii T, Wakabayashi N, Yamamoto M (1999) Regulatory mechanisms of cellular response to oxidative stress Free Radic Res 31:319–324 https://doi.org/10.1080/10715769900300881 Jao LE, Wente SR, Chen W (2013) Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system Proc Natl Acad Sci U S A 110:13904–13909 https://doi.org/10.1073/pnas.1308335110 Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, et al (2012) A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity Science (80- ) 337:816–821 https://doi.org/10.1126/science.1225829 Kobayashi M, Itoh K, Suzuki T, et al (2002) Identification of the interactive interface and phylogenic conservation of the Nrf2-Keap1 system Genes Cells 7:807–20 Kobayashi M, Li L, Iwamoto N, et al (2009) The Antioxidant Defense System Keap1Nrf2 Comprises a Multiple Sensing Mechanism for Responding to a Wide Range of Chemical Compounds Mol Cell Biol 29:493–502 https://doi.org/10.1128/MCB.0108008 Kotani H, Taimatsu K, Ohga R, et al (2015) Efficient Multiple Genome Modifications Induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 Protein Complex in Zebrafish PLoS One 10:e0128319 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0128319 Lee Y, Chou T-F, Pittman SK, et al (2017) Keap1/Cullin3 Modulates p62/SQSTM1 Activity via UBA Domain Ubiquitination Cell Rep 19:188–202 https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.03.030 Li D, Qiu Z, Shao Y, et al (2013a) Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system Nat Biotechnol 31:681–683 Li L, Kobayashi M, Kaneko H, et al (2008) Molecular evolution of Keap1: Two Keap1 molecules with distinctive intervening region structures are conserved among fish J Biol Chem 283:3248–3255 https://doi.org/10.1074/jbc.M708702200 Trang 55 NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HÓA Li W, Teng F, Li T, Zhou Q (2013b) Simultaneous generation and germline transmission of multiple gene mutations in rat using CRISPR-Cas systems Nat Biotechnol 31:684– 686 Mali P, Yang L, Esvelt KM, et al (2013) RNA-guided human genome engineering via Cas9 Science (80- ) 339:823–826 https://doi.org/10.1126/science.1232033 McMahon M, Lamont DJ, Beattie KA, Hayes JD (2010) Keap1 perceives stress via three sensors for the endogenous signaling molecules nitric oxide, zinc, and alkenals Proc Natl Acad Sci U S A 107:18838–43 https://doi.org/10.1073/pnas.1007387107 Miller EC (1978) Some Current Perspectives on Chemical Carcinogenesis in Humans and Experimental Animals: Presidential Address Cancer Res 38:1479–1496 Nakajima H, Nakajima-Takagi Y, Tsujita T, et al (2011) Tissue-Restricted Expression of Nrf2 and Its Target Genes in Zebrafish with Gene-Specific Variations in the Induction Profiles PLoS One 6:e26884 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0026884 Nguyen VT, Bian L, Tamaoki J, et al (2020) Generation and characterization of keap1aand keap1b-knockout zebrafish Redox Biol 36:101667 https://doi.org/10.1016/j.redox.2020.101667 Okawa H, Motohashi H, Kobayashi A, et al (2006) Hepatocyte-specific deletion of the keap1 gene activates Nrf2 and confers potent resistance against acute drug toxicity Biochem Biophys Res Commun 339:79–88 https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2005.10.185 Ota S, Hisano Y, Ikawa Y, Kawahara A (2014) Multiple genome modifications by the CRISPR/Cas9 system in zebrafish Genes to Cells 19:555–564 https://doi.org/10.1111/gtc.12154 Pergola PE, Raskin P, Toto RD, et al (2011) Bardoxolone Methyl and Kidney Function in CKD with Type Diabetes N Engl J Med 365:327–336 https://doi.org/10.1056/NEJMoa1105351 Pitoniak A, Bohmann D (2015) Mechanisms and functions of Nrf2 signaling in Drosophila Free Radic Biol Med 88:302–313 Prestera T, Zhang Y, Spencer SR, et al (1993) The electrophile counterattack response: Protection against neoplasia and toxicity Adv Enzyme Regul 33:281–296 https://doi.org/10.1016/0065-2571(93)90024-8 Trang 56 NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HÓA Reddy NM, Potteti HR, Mariani TJ, et al (2011) Conditional Deletion of Nrf2 in Airway Epithelium Exacerbates Acute Lung Injury and Impairs the Resolution of Inflammation Am J Respir Cell Mol Biol 45:1161–1168 https://doi.org/10.1165/rcmb.2011-0144OC Saito R, Suzuki T, Hiramoto K, et al (2015) Characterizations of Three Major Cysteine Sensors of Keap1 in Stress Response Mol Cell Biol 36:271–284 https://doi.org/10.1128/MCB.00868-15 Singh K, Connors SL, Macklin EA, et al (2014) Sulforaphane treatment of autism spectrum disorder (ASD) Proc Natl Acad Sci U S A 111:15550–15555 https://doi.org/10.1073/pnas.1416940111 Sung YH, Kim JM, Kim HT, et al (2014) Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases Genome Res 24:125–131 https://doi.org/10.1101/gr.163394.113 Suzuki T, Maher J, Yamamoto M (2011) Select heterozygous Keap1 mutations have a dominant-negative effect on wild-type Keap1 in vivo Cancer Res 71:1700–1709 https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-10-2939 Sykiotis GP, Bohmann D (2008) Keap1/Nrf2 Signaling Regulates Oxidative Stress Tolerance and Lifespan in Drosophila Dev Cell 14:76–85 https://doi.org/10.1016/j.devcel.2007.12.002 Takaya K, Suzuki T, Motohashi H, et al (2012) Validation of the multiple sensor mechanism of the Keap1-Nrf2 system Free Radic Biol Med 53:817–827 https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2012.06.023 Talalay P, De Long MJ, Prochaska HJ (1988) Identification of a common chemical signal regulating the induction of enzymes that protect against chemical carcinogenesis Proc Natl Acad Sci U S A 85:8261–8265 https://doi.org/10.1073/pnas.85.21.8261 Tian W, Rojo de la Vega M, Schmidlin CJ, et al (2018) Kelch-like ECH-associated protein (KEAP1) differentially regulates nuclear factor erythroid-2–related factors and (NRF1 and NRF2) J Biol Chem 293:2029–2040 https://doi.org/10.1074/jbc.RA117.000428 Tullet JMA, Green JW, Au C, et al (2017) The SKN-1/Nrf2 transcription factor can protect against oxidative stress and increase lifespan in C elegans by distinct mechanisms Aging Cell 16:1191–1194 https://doi.org/10.1111/acel.12627 Trang 57 NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HÓA Uruno A, Yagishita Y, Katsuoka F, et al (2016) Nrf2-Mediated Regulation of Skeletal Muscle Glycogen Metabolism Mol Cell Biol 36:1655–1672 https://doi.org/10.1128/MCB.01095-15 Wakabayashi N, Itoh K, Wakabayashi J, et al (2003) Keap1-null mutation leads to postnatal lethality due to constitutive Nrf2 activation Nat Genet 35:238–245 https://doi.org/10.1038/ng1248 Wiedenheft B, Sternberg SH, Doudna JA (2012) RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea Nature 482:331–338 Yamamoto M, Kensler TW, Motohashi H (2018) The KEAP1-NRF2 system: A thiolbased sensor-effector apparatus for maintaining redox homeostasis Physiol Rev 98:1169–1203 https://doi.org/10.1152/physrev.00023.2017 Yamamoto T, Suzuki T, Kobayashi A, et al (2008) Physiological significance of reactive cysteine residues of Keap1 in determining Nrf2 activity Mol Cell Biol 28:2758–70 https://doi.org/10.1128/MCB.01704-07 Zhang Y, Hou Y, Liu C, et al (2016) Identification of an adaptor protein that facilitates Nrf2-Keap1 complex formation and modulates antioxidant response Free Radic Biol Med 97: https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2016.05.017 ... HỌC VĂN HIẾN KHOA KỸ THUẬT – CƠNG NGHỆ BÁO CÁO KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HĨA TP HỒ CHÍ MINH – 2022 Chương – Tổng... đặc điểm oxy hóa tương lai Trang NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HĨA Mục đích nghiên cứu - Mục tiêu nghiên cứu làm rõ vai trò sinh lý Nrf2 bị chức... thu thập cá ngựa vằn tự nhiên Chương – Tổng quan Trang 21 NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP DÒNG CÁ NGỰA VẰN KNOCKOUT GENE NRF2 PHỤC VỤ NGHIÊN CỨU OXY HÓA 5,9 – 8,5 16 – 38°C Trong tự nhiên, cá ngựa vằn chủ