Tính cấp thiết của đề tài
Oxidative stress causes damage to various cellular components, including DNA, proteins, and lipids, and is associated with several human pathological conditions such as cancer, neurodegeneration, and inflammatory diseases (Endo et al 2020) Key proteins involved in combating oxidative stress include superoxide dismutase (SOD), catalase, glutathione peroxidase (Gpx), peroxiredoxin (Prdx), as well as small thiol molecules like glutathione (GSH) and thioredoxin (Txn), which play a crucial role in the removal of oxidative stress.
Khám phá gần đây về hệ thống chống oxy hóa tế bào đã dẫn đến khái niệm "chất chống oxy hóa gián tiếp", hoạt động bằng cách tăng cường khả năng chống oxy hóa qua việc kích thích biểu hiện gen do yếu tố phiên mã Nrf2 Nrf2, một yếu tố phiên mã dị loại hóa, liên kết với yếu tố phản ứng chống oxy hóa (ARE) trong vùng điều hòa của các gen mục tiêu, kích thích một loạt các gen bảo vệ tế bào mã hóa enzym giải độc giai đoạn 2 và protein chống oxy hóa như glutathione S-transferase, NAD(P)H: quinone oxidoreductase và glutamate-cysteine ligase Trong điều kiện bình thường, Nrf2 bị phân hủy liên tục qua con đường ubiquitin-proteasome phụ thuộc Keap1, nhưng khi gặp electrophin hoặc căng thẳng oxy hóa, Nrf2 thoát khỏi sự phân hủy, tích tụ trong nhân và kích hoạt phiên mã các gen mục tiêu.
Phòng thí nghiệm của giáo sư Makoto Kobayashi đã phân lập các gen nrf2, keap1a và keap1b từ cá ngựa vằn, chứng minh rằng hệ thống Keap1-Nrf2 có vai trò bảo vệ tế bào được bảo tồn ở động vật có xương sống (Tian et al 2018) Nghiên cứu này cung cấp những hiểu biết mới về chức năng của Nrf2, bao gồm việc phân lập các dòng cá ngựa vằn đột biến với phản ứng suy giảm đối với các hợp chất kích hoạt Nrf2, cũng như sự biểu hiện đặc hiệu của Nrf2 và các gen mục tiêu của nó trong mô (Kobayashi et al 2002, 2009; Nakajima et al 2011).
Vai trò sinh lý của Nrf2 ở cá ngựa vằn vẫn chưa được làm rõ, điều này cần được nghiên cứu thêm để hiểu các chức năng của Nrf2 từ góc độ tiến hóa.
Nghiên cứu về việc thiết lập dòng cá ngựa vằn knockout gen nrf2 nhằm phục vụ cho nghiên cứu oxy hóa đã được thực hiện bằng cách loại bỏ gen Nrf2 Mục tiêu của nghiên cứu là xác định các đặc điểm của cá ngựa vằn sau khi gen này bị loại bỏ.
Nghiên cứu của chúng tôi về CRISPR-Cas9 cho thấy cá ngựa vằn đã loại bỏ gen Nrf2 vẫn có khả năng sống sót và sinh sản Điều này mở ra cơ hội sử dụng cá ngựa vằn như một mô hình lý tưởng để phân tích các đặc điểm oxy hóa trong các nghiên cứu tương lai.
Mục tiêu của nghiên cứu này là làm rõ vai trò sinh lý của Nrf2 khi bị mất chức năng Chúng tôi sẽ tạo ra các dòng cá loại bỏ gen Nrf2 và kiểm tra đặc tính di truyền ở các thế hệ từ F0 đến F2 Đồng thời, nghiên cứu cũng sẽ làm sáng tỏ chức năng sinh lý của cá ngựa vằn bị loại bỏ gen Nrf2, dựa trên các nghiên cứu trước đây liên quan đến cảm biến căng thẳng.
Mục tiêu nghiên cứu của tôi là tạo ra dòng cá ngựa vằn loại bỏ gen Nrf2 đến thế hệ F2, mặc dù thời gian thực hiện trong khuôn khổ đề tài sinh viên là ngắn.
Nhiệm vụ nghiên cứu
- Loại bỏ được gen Nrf2 để xác định đặc điểm cá ngựa vằn bằng phương pháp
Phương pháp nghiên cứu
- Loại bỏ gen Nrf2 ở cá ngựa vằn bằng phương pháp CRISPR-Cas9 và vi tiêm
CRISPR-Cas9 vào phôi cá ngựa vằn giai đoạn một tế bào.
Các kết quả đạt được của đề tài
- Loại bỏ được gen Nrf2 ở cá ngựa vằn mà cá thể vẫn có khả năng sống tiếp và sinh sản
Kết cấu của khoá luận tốt nghiệp
- Chương 2 - Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu
- Chương 3 - Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
- Chương 4 – Kết quả và thảo luận
TỔNG QUAN
Giới thiệu về kỹ thuật knockout gene
Kỹ thuật knockout gene là phương pháp di truyền nhằm làm cho một gen trong sinh vật không hoạt động Quá trình này bắt đầu trong ống nghiệm, sử dụng plasmid, nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn hoặc các cấu trúc DNA khác, sau đó tiến hành nuôi cấy tế bào Các tế bào riêng lẻ sẽ được chuyển gen với cấu trúc DNA, với mục tiêu tạo ra động vật chuyển gen có gen đã được thay đổi Thay vì loại bỏ hoàn toàn đoạn gen, có thể thay thế bằng một đoạn gen khác vào vị trí đã loại bỏ.
Tổng quan về hệ thống CRISPER-Cas9
Hiện nay, một lượng lớn thông tin về bộ gen của nhiều sinh vật, bao gồm thực vật và động vật, đã được công bố Tuy nhiên, chức năng sinh học và sự phát triển của các gen riêng lẻ trong các bộ gen này vẫn chưa được hiểu rõ hoàn toàn Sự phát triển của các nuclease ở các vị trí nhân tạo như zinc-finger nucleases (ZFNs) và transcription activator-like effector nucleases (TALENs) đã mở ra cơ hội để nghiên cứu các kiểu hình của các gen bị mất chức năng Cả ZFNs và TALENs đều bao gồm một miền DNA-Binding (miền zinc-finger hoặc TALE) và miền xúc tác FOK I nuclease.
Các DNA sợi đơn bị phá vỡ (Double strand breaks (DSBs)) được gây ra bởi
ZFNs và TALENs có khả năng sửa chữa gen tại các locus mục tiêu thông qua tái tổ hợp với các gen tương đồng hoặc không tương đồng Quá trình sửa chữa này thường dẫn đến việc chèn hoặc xóa (indel) các đột biến tại vị trí của DSBs, gây ra đột biến lệch khung đọc (frameshift mutation) và làm mất chức năng của gen Mặc dù ZFNs và TALENs là những công cụ mạnh mẽ cho chỉnh sửa gen, quy trình thiết kế và ứng dụng thực tế của chúng rất phức tạp, dẫn đến tính khả thi thấp, đặc biệt trong các ứng dụng lâm sàng (Kotani et al 2015).
Hình 1.1 Spacer, protospacer và PAM Protospacer là DNA đích;
PAM tiếp giáp với DNA sợi đôi được nhắm mục tiêu Phần đệm (Spacer) là một phần của RNA dẫn đường gắn kết với protospacer.
Nguồn: https://www.idtdna.com/
Gần đây, hệ thống CRISPR-Cas9 đã trở thành một công nghệ chỉnh sửa gen nổi bật (Jinek et al 2012) CRISPR, viết tắt của Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, ban đầu được hiểu là các đoạn DNA nhân sơ chứa trình tự base lặp lại Những đoạn trình tự này được xen kẽ bởi các đoạn DNA đệm có nguồn gốc từ DNA ngoại lai, như thể thực khuẩn hoặc plasmid Bên cạnh đó, hệ thống này còn bao gồm các gen cas, tạo thành một hệ miễn dịch thích ứng trong vi khuẩn và vi khuẩn cổ, giúp bảo vệ gen khỏi virus và plasmid xâm nhập (Wiedenheft et al 2012) Đặc biệt, loại II CRISPR/Cas9 đã chứng minh tính hiệu quả trong việc thực hiện các thay đổi gen nhắm mục tiêu trong tế bào động vật có vú (Cong et al 2013; Mali et al.).
2013) và các sinh vật mô hình khác nhau bao gồm cá ngựa vằn (Hwang et al 2013), chuột (Li et al 2013b), và chuột nhắt (Li et al 2013a, b).
Quá trình chỉnh sửa gen CRISPR-Cas9 bắt đầu bằng việc hình thành ribonucleoprotein (RNP) từ sự kết hợp giữa CRISPR RNA (crRNA) và CRISPR RNA chuyển hóa (tracrRNA) để tạo ra RNA dẫn đường (gRNA) RNP có thể được hình thành trong tế bào hoặc trong phòng thí nghiệm, sau đó cần được chuyển vào tế bào nếu được tạo ra bên ngoài Giai đoạn tiếp theo là gRNA hướng dẫn RNP đến mục tiêu bên trong tế bào, và cuối cùng, mục tiêu sẽ được phân tách.
Trong hệ thống CRISPR/Cas9, các chuỗi gen mục tiêu nằm cạnh trình tự PAM được nhận diện bởi gRNA, có nhiệm vụ bổ sung cho các vị trí đích và bị cắt bởi phức hợp gRNA và nuclease Cas9 Sự cắt này dẫn đến các đột biến indel, gây gián đoạn gen Nhiều nghiên cứu đã xác nhận sự gián đoạn gen do CRISPR/Cas9 gây ra ở cá ngựa vằn (Jao et al 2013; Hwang et al 2013; Chang et al 2013; Hruscha et al 2013; Sung et al 2014; Bannikov và Lavrov 2017).
Sau khi phân tách DNA bộ gen, có thể xảy ra các kết quả khác nhau như xóa, thay đổi trình tự và chèn nhỏ Các con đường sửa chữa DNA của tế bào, ví dụ như nối kết cuối không tương đồng (NHEJ), đóng vai trò quan trọng trong những biến đổi này Nguồn: https://www.idtdna.com/
Trình tự CRISPR lần đầu tiên được tìm ra vào năm 1987 do các nghiên cứu của
Yoshizumi Ishino và các cộng sự tại Đại học Osaka, Nhật Bản, đã thúc đẩy nghiên cứu về chức năng đặc biệt của hệ miễn dịch vi khuẩn trong những năm gần đây Vào năm 2012, hai nhóm nghiên cứu độc lập do Tiến sĩ Emmanuelle Charpentier tại Đại học Umea và Tiến sĩ Jennifer Doudna tại Đại học California, Berkeley dẫn dắt đã khám phá cơ chế hoạt động của enzyme Cas và hệ thống CRISPR.
Tiến sĩ Craig Mello, người được trao giải thưởng Nobel về Sinh lý học và Y học năm
Năm 2006, nghiên cứu về RNAi (RNA interference) đã mở ra một tương lai hứa hẹn cho phương pháp CRISPR/Cas, được Mello nhận định là có ý nghĩa to lớn và khả năng mạnh mẽ, cho phép thay đổi bộ gen theo mong muốn Phương pháp này có thể được áp dụng rộng rãi trong nông nghiệp và liệu pháp gen để điều trị các bệnh lý ở người Đây thực sự là một thành công của nghiên cứu khoa học cơ bản và là một đột phá lớn trong lĩnh vực di truyền học phân tử.
Sửa chữa theo hướng tương đồng (HDR) cho phép kết hợp các trình tự mới vào DNA, với khả năng thay đổi trình tự nhỏ cho mục đích chỉnh sửa gen và thêm các trình tự lớn như toàn bộ gen một cách ngẫu nhiên gRNA (RNA hướng dẫn) là một phân tử RNA tổng hợp ngắn, đóng vai trò quan trọng trong hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR, bao gồm chuỗi nucleotide dài khoảng 20 bp liên kết với trình tự DNA mục tiêu Phân tử gRNA kết hợp với endonuclease Cas, tạo thành hai thành phần chính của chỉnh sửa gen dựa trên CRISPR sgRNA là thuật ngữ dùng để mô tả gRNA, trong khi gRNA chỉ định mục tiêu cho endonuclease trong chỉnh sửa gen Cả sgRNA và gRNA đều là các phân tử tổng hợp tương tự crRNA trong hệ thống CRISPR về mặt chức năng.
Có ba loại gRNA dựa trên phương pháp tổng hợp Chúng là crRNA tổng hợp, sgRNA lentivirus và sgRNA tổng hợp.
Hình 1.5 Các dạng gRNA khác nhau được sử dụng để loại bỏ gen.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chọn sử dụng sgRNA, bao gồm crRNA và tracrRNA, do tính bền vững của nó Điểm nổi bật là sgRNA không cần ủ nhiệt trước khi được chuyển vào phôi cá ngựa vằn.
Hình 1.6 Vị trí PAM và gRNA Cas9 Vị trí PAM nằm trên chuỗi
DNA không phải là mục tiêu trong quy trình loại bỏ gen RNA dẫn đường kết nối với sợi mục tiêu, trong đó RNA dẫn đường được cấu thành từ hai phần: crRNA và tracrRNA.
Cả hai loại gRNA, bao gồm gRNA (A) và sgRNA (B), đều có khả năng kết hợp với Cas9 để hình thành Ribonucleoprotein (RNP) Sau đó, RNP có thể được phân phối đến các tế bào để thực hiện các chức năng cần thiết.
CRISPR/Cas đang chứng tỏ tiềm năng ứng dụng mạnh mẽ trong việc sửa chữa sai hỏng DNA ở các bệnh lý di truyền Hệ thống này cũng được nghiên cứu để biệt hóa tế bào gốc thành nhiều loại tế bào khác nhau thông qua điều chỉnh di truyền Ngoài ra, CRISPR/Cas còn cho phép tạo ra động vật và thực vật biến đổi gen hiệu quả Gần đây, nhóm nghiên cứu của Giáo sư Yoshio Koyanagi đã sử dụng CRISPR/Cas để phá hủy gen HIV, mở ra cơ hội liệu pháp tiềm năng cho bệnh AIDS Nhiều kết quả khả quan từ nghiên cứu này đã được công bố trên các tạp chí uy tín, cho thấy sự phát triển nhanh chóng và ứng dụng rộng rãi của hệ thống CRISPR/Cas trong biến đổi DNA.
Hiện tại, nghiên cứu về cơ chế phân tử của hệ thống Keap1/Nrf2 ở Việt Nam vẫn chưa được công bố Tuy nhiên, các mô hình cá ngựa vằn và medaka đã được nghiên cứu và ứng dụng bởi Trường Đại học Tự nhiên và Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh.
Định nghĩa về hệ thống keap1-nrf2
1.3.1 Lịch sử tiền khám phá Nrf2
Nhận thức về mối liên hệ giữa môi trường và sức khỏe, đặc biệt là trong việc gây ung thư, đã được Percival Pott nêu ra lần đầu tiên vào năm 1775 Ông phát hiện tỷ lệ ung thư bìu cao ở những người làm nghề quét ống khói tại London và cho rằng muội than là nguyên nhân môi trường gây ra bệnh này Đến năm 1915, Yamagiwa và Ichikawa đã chứng minh rõ ràng mối liên hệ giữa hóa chất môi trường và ung thư, khi họ phát hiện ung thư mãn tính trên tai thỏ do tiếp xúc với than đá Ngày nay, việc tránh và loại bỏ tiếp xúc với các yếu tố môi trường bất lợi được coi là rất quan trọng trong việc ngăn ngừa ung thư hóa học ở con người.
Trong những năm 1960 và 1970, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chất gây ung thư từ than đá và môi trường làm việc cần trải qua chuyển hóa sinh học để tạo thành các chất cộng hóa trị với protein, RNA và DNA Quá trình này thường được xúc tác bởi enzyme pha I, như hệ thống cytochrom P-450 Mặc dù có sự chú ý ngày càng tăng đối với hóa chất gây ung thư ở người, nhiều nghiên cứu đã tìm kiếm các thuốc điều trị ung thư có khả năng ức chế quá trình kích hoạt trao đổi chất hoặc tăng cường giải độc Các chất chống oxy hóa từ thực phẩm, như flavonoid và isothiocyanate, đã được xem xét vì tính an toàn của chúng Tiền xử lý động vật gặm nhấm bằng BHA, một chất chống oxy hóa từ thực phẩm, đã cho thấy khả năng ức chế hiệu quả quá trình gây ung thư.
Benson et al (1980) reported that BHA enhances the activity of detoxifying enzymes such as glutathione S-transferase, epoxide hydratase, and NAD(P)H: quinone oxyoreductase in various mouse tissues Numerous antioxidant compounds, including phenolics, azo dyes, polycyclic aromatics, flavonoids, coumarins, cinnamates, indoles, isothiocyanates, 1,2-dithiole-3-thiones, and thiocarbamates, have been identified as activators of these detoxifying enzymes Some of these activators possess a unique chemical feature as Michael acceptors, characterized by olefinic bonds that create an electron-deficient environment through electron-withdrawing interactions The effectiveness of these activators commonly involves the modification of sulfhydryl groups via oxidation, reduction, or alkalinization (Talalay et al 1988) Low-dose exposure of cells to electrophilic sulfhydryl-reactive compounds increases the activity of these phase II enzymes, thereby providing cellular protection against electrophile toxicity, a phenomenon known as the anti-electrophile response.
Theo nghiên cứu của Prestera và cộng sự (1993), giả thuyết được đưa ra cho rằng các tế bào có khả năng cảm biến các phân tử nhờ vào chức năng sulfhydryl độc đáo, cho phép chúng nhận diện và phản ứng với các chất kích hoạt enzyme bảo vệ.
1.3.2 Khám phá Nrf2: một phân tử chính trong phản ứng chống electrophile
Hoạt động enzyme giải độc bởi các chất electrophile chủ yếu liên quan đến việc tăng khả năng phiên mã của các gen tương ứng Các yếu tố điều hòa quan trọng cho sự biểu hiện của gen mã hóa enzyme pha II đã được xác định là yếu tố đáp ứng chống oxy hóa (ARE) và yếu tố đáp ứng electrophile (EpRE) Tuy nhiên, các yếu tố điều hòa mã hóa cho ARE/EpRE vẫn chưa được biết cho đến khi nghiên cứu của Itoh et al chỉ ra rằng việc loại bỏ hoàn toàn gen NRF2 ở chuột đã dẫn đến sự giảm hoạt động của các enzyme pha II NRF2, ban đầu được phân lập như một yếu tố phiên mã, đã được xác định là một phân tử điều hòa chính trong phản ứng chống electrophile, mở ra hướng nghiên cứu mới trong độc học và giúp hiểu rõ hơn về các cơ chế giải độc ở cấp độ phân tử.
1.3.3 Lịch sử khám phá KEAP1: Bộ cảm biến nhận biết các chất elecreophile Thật may mắn, cảm biến của các chất hóa học từ môi trường và điều hòa hoạt động của NRF2 đã sớm được phát hiện Năm 1999, Itoh et al phân lập (bằng cách sàng lọc hai loại nấm men) một loại protein mới giàu group thiol (R-SH) và là phân tử ức chế của NRF2, được đặt tên là KEAP1 (Itoh et al 1999) KEAP1 thúc đẩy sự suy giảm NRF2 trong điều kiện không bị căng thẳng Ngược lại trong điều kiện có các chất kích thích oxy hóa khử, chúng có khả năng trực tiếp làm thay đổi các nhóm thiol của KEAP1 và dẫn đến bất hoạt chức năng của KEAP1, kết quả NRF2 không bị ức chế bởi KEAP1, ổn định hoạt động và di chuyển vào nhân tế bào nơi mà NRF2 có khả năng phiên mã tạo ra các gen bảo vệ tế bào chất Do đó KEAP1 được coi là bộ cảm biến sinh học (biological sensor) cho các chất electrophile và ROS.
1.3.4 Tổng quan về chức năng của hệ thống phân tử KEAP1-NRF2
Hệ thống KEAP1-NRF2 được công nhận là cơ chế phòng thủ chính của cơ thể chống lại tác động môi trường có hại Hệ thống này bao gồm hai thành phần quan trọng: KEAP1, hoạt động như bộ cảm biến nhận diện các chất ái lực điện tử, và NRF2, đóng vai trò kích hoạt sự biểu hiện của các gen bảo vệ tế bào Trong tế bào chất, KEAP1 hình thành phức hợp ligase ubiquitin E3 với CULLIN3 (CUL3) và NRF2, dẫn đến việc đánh dấu NRF2 cho quá trình thoái hóa nhanh chóng thông qua hệ thống proteasome.
Trong điều kiện không căng thẳng, NRF2 được tổng hợp nhưng thường xuyên bị suy giảm Khi tiếp xúc với các chất ái lực điện tử hoặc gốc tự do, cysteine của KEAP1 bị sửa đổi, làm giảm hoạt động ligase ubiquitin E3 của phức hợp KEAP1-CUL3, dẫn đến sự ổn định của NRF2 NRF2 mới được tạo ra sau đó sẽ chuyển vào nhân, kết hợp với protein sMAF, liên kết với yếu tố ARE/EpRE và kích hoạt mạnh mẽ các enzyme pha II, đóng vai trò là yếu tố phiên mã chính.
Hình 1.8 Cơ chế phân tử của hệ thống KEAP1-NRF2 kích hoạt gen mục tiêu
NRF2 trong điều kiện căng thẳng Nguồn: https://www.idtdna.com/
Nghiên cứu toàn cầu về hệ thống KEAP1-NRF2 đã cung cấp bằng chứng quan trọng về vai trò của NRF2 trong việc duy trì sức khỏe Sự điều hòa của hệ thống KEAP1-NRF2 không chỉ quan trọng cho sức khỏe mà còn là cơ sở cho việc hiểu rõ hơn về các bệnh lý khác nhau ở con người.
Hệ thống KEAP1-NRF2 hiện đang được xem là một mục tiêu tiềm năng trong việc phát triển thuốc cho nhiều bệnh lý khác nhau ở con người, bao gồm bệnh tiểu đường, viêm nhiễm và ung thư.
1.3.5 Cơ chế bảo tồn của hệ thống KEAP1-NRF2 giữa các loài động vật có xương sống
Hệ thống KEAP1-NRF2 được bảo tồn cao giữa các loài động vật có xương sống, từ cá đến động vật có vú, với zebrafish điều chỉnh hoạt động NRF2 tương tự như ở động vật có vú Hệ thống này cũng xuất hiện ở động vật không xương sống, như ở ruồi giấm, nơi ortholog NRF2 được gọi là cap’n’ collar (CNC) Gen cnc ở Drosophila tạo ra nhiều biến thể, trong đó CncC là isoform dài nhất và giống nhất với NRF2 của động vật có vú CncC cần sMAF để thực hiện chức năng tương tự như NRF2, trong khi ortholog KEAP1 ở Drosophila tương tác với CncC và hoạt động như một bộ điều hòa ức chế, tương tự như vai trò của KEAP1 trong việc điều chỉnh NRF2 ở động vật có vú.
Bản tóm tắt về dư lượng cystein của Keap1 cho thấy sự bảo tồn của từng cystein với ký hiệu O cho các cystein được bảo tồn, ∆ cho những cystein không được bảo tồn nhưng tồn tại ba axit amin, và X cho các cystein không được bảo tồn Các cystein cảm biến được đánh dấu bằng màu đỏ, xanh lá cây và xanh dương Các loài được đề cập bao gồm chuột (Mm), người (Hs), cá medaka (Ol) và cá ngựa vằn (Dr).
C Elegans sở hữu một ortholog NRF2 gọi là SKN-1, hoạt động qua hệ thống phòng thủ chống lại căng thẳng oxy hóa (Blackwell et al 2015) Drosophila và C Elegans thường được sử dụng trong nghiên cứu lão hóa do tuổi thọ ngắn của chúng Kích hoạt CncC bằng đột biến KEAP1 giúp kéo dài tuổi thọ Drosophila, trong khi gián đoạn SKN-1 ở C Elegans làm giảm khả năng chống lại căng thẳng và rút ngắn tuổi thọ (Tullet et al 2017) SKN-1 đóng góp vào việc kéo dài tuổi thọ, cho thấy củng cố phản ứng căng thẳng oxy hóa là cơ chế chống lão hóa hiệu quả Nghiên cứu gần đây trên chuột chũi trần, loài gặm nhấm có tuổi thọ dài, cho thấy hoạt động NRF2 cao hơn liên quan chặt chẽ đến tuổi thọ của chúng (Yamamoto et al 2018), ủng hộ quan niệm rằng hoạt động NRF2 cao có lợi cho tuổi thọ.
1.3.6 Cơ chế điều hoà hoạt động của hệ thống KEAP1-NRF2
KEAP1 là một protein giàu thiol với nhiều gốc cysteine, một số gốc nằm gần các axit amin cơ bản trong các dạng anion phản ứng của nhóm sulfhydryl Các nghiên cứu đã ghi nhận sự liên kết cộng hóa trị giữa các gốc cystein và các chất gây cảm ứng electrophile thông qua phép đo phổ khối Gốc cystein đóng vai trò quan trọng trong chức năng cảm biến của KEAP1, được chứng minh qua các thí nghiệm trên tế bào nuôi cấy, cá ngựa vằn và chuột Ba gốc cystein chính của KEAP1, bao gồm Cys151 ở domain BTB và Cys273 cùng Cys288 ở domain IVR, là yếu tố then chốt trong việc điều chỉnh hoạt động của ligase ubiquitin E3 trong phức hợp KEAP1 - CUL3.
Mã Cysteine của phản ứng KEAP1 liên quan đến các rối loạn oxy hóa khử khác nhau, trong đó ba gốc cystein chính là Cys151, Cys273 và Cys288 đóng vai trò quan trọng trong việc phản ứng với nhiều loại electrophile Cụ thể, OA-NO2 đại diện cho axit béo nitro, trong khi 4HNE là viết tắt của 4-hydroxynonel (Yamamoto et al 2018).
Ứng dụng trị liệu của hệ thống KEAP1-NRF2
Dựa trên những đóng góp quan trọng của NRF2 trong việc ngăn ngừa và điều trị nhiều bệnh lý, các nghiên cứu toàn cầu đã tìm kiếm các chất kích hoạt NRF2 tự nhiên và mạnh mẽ Dimethyl fumarate (Tecfidera) đã được FDA phê duyệt cho bệnh nhân đa xơ cứng, trong khi CDDO-Me, một triterpenoid mạnh, đang thử nghiệm lâm sàng tại Nhật Bản cho bệnh thận đái tháo đường, mặc dù gặp khó khăn tại Mỹ do biến chứng tim Các chất kích thích khác như axit béo nitro và sulforaphane từ bông cải xanh cũng đang được phát triển Việc sửa đổi cystein ngoài KEAP1 có thể tăng cường hiệu quả bảo vệ, với các nghiên cứu nhỏ cho thấy sulforaphane có tiềm năng trong điều trị bệnh tự kỷ và ô nhiễm không khí Mặc dù các electrophile tác động mạnh đến KEAP1, cần xem xét các chiến lược không phụ thuộc vào electrophile để tìm kiếm các chất gây cảm ứng NRF2 có độ đặc hiệu cao hơn.
KEAP1 chứa nhiều cảm biến cysteine độc đáo và hoạt động tự động, cho thấy NRF2 và KEAP1 tích hợp tín hiệu oxit nitric, Zn2+ và alkenal với tín hiệu oxi hóa khử Các chất kích hoạt NRF2 có tác động đa dạng, nhưng sự phát triển của các công tắc oxi hóa khử dựa trên thiol trong KEAP1 giúp động vật có vú thích nghi với nhiều loại hóa chất thực vật Kích hoạt NRF2 mang lại nhiều lợi ích như duy trì tín hiệu oxy hóa khử, tăng cường sinh học xenobiotic, kiểm soát viêm, ức chế gluconeogenesis và lipogenesis gan, hỗ trợ tạo protein và ngăn ngừa xơ hóa Hầu hết các bệnh mãn tính, đặc biệt ở người cao tuổi, không có nguyên nhân độc nhất và không biểu hiện bệnh lý đơn lẻ, có thể được điều trị hiệu quả bằng thuốc kích hoạt NRF2, giúp bảo vệ tế bào tốt hơn so với các biện pháp can thiệp điều trị cụ thể khác.
Hệ thống KEAP1-NRF2 ở cá ngựa vằn
Cá ngựa vằn (Danio rerio) là một mô hình lý tưởng cho nghiên cứu y tế và sinh học nhờ vào sự trong suốt của giai đoạn phôi thai và ấu trùng, cho phép theo dõi dễ dàng sự biểu hiện gen So với chuột, việc chăm sóc cá ngựa vằn dễ dàng và chi phí thấp hơn, đồng thời cung cấp số lượng phôi lớn cho phân tích thống kê Mặc dù việc tạo ra cá ngựa vằn mang gen trực tiếp còn gặp khó khăn, nhưng nghiên cứu gần đây đã chỉ ra tiềm năng của các cụm lặp lại palindromic ngắn xen kẽ nhau trong việc phát triển các ứng dụng sinh học.
CRISPR-Cas9 đã được áp dụng thành công trong nghiên cứu cá ngựa vằn, cho phép sửa đổi bộ gen của chúng một cách dễ dàng (Ota et al., 2014) Nhờ vào công nghệ này, việc phân tích gen và biểu hiện gen ở cá ngựa vằn trở nên thuận lợi hơn bao giờ hết.
Hình 1.11 Các điểm mạnh khi sử dụng mô hình cá ngựa vằn trong nghiên cứu sinh học phân tử.
Cá ngựa vằn đã được chứng minh là mô hình hiệu quả trong nghiên cứu dịch bệnh và sàng lọc thuốc (Lam & Gong, 2006; Mukaigasa và cộng sự, 2018) Hệ thống Keap1-Nrf2 ở cá ngựa vằn được bảo tồn tốt hơn so với các loài động vật có vú (Fuse & Kobayashi, 2017), với Nrf2 và Keap1 đã được phân lập bởi Kobayashi và cộng sự (2002) Đặc biệt, thể đột biến Nrf2, nrf2afh318, cho thấy độ nhạy cao với stress oxy hóa (Mukaigasa et al., 2012) Keap1 cũng được phát hiện ở hai đồng trực hệ, keap1a và keap1b, trong đó keap1a được xác định bởi Li và cộng sự (2008) Nghiên cứu trước đó chỉ ra rằng cả hai đều có hoạt động đàn áp tương tự trong Nrf2 nhưng khác nhau về khả năng cảm nhận căng thẳng (Kobayashi và cộng sự, 2009) Vì vậy, cá ngựa vằn là mô hình lý tưởng để nghiên cứu Nrf2 và hàm Keap1.
Khả năng thành công
Trước đây rất khó để tạo ra đột biến gen ở cá, nhưng gần đây, phương pháp
Công nghệ CRISPR-Cas9 đã được áp dụng thành công trong việc chỉnh sửa gen ở cá ngựa vằn (Ota et al 2014), cho phép chúng tôi dễ dàng thay đổi bộ gen của loài này Nhằm nghiên cứu các chức năng sinh lý, chúng tôi đã quyết định tạo ra các dòng cá ngựa vằn bị loại bỏ gen Keap1a và Keap1b.
Tính mới, tính thời sự
Đề tài nghiên cứu này mô tả việc knockout gen Nrf2 bằng phương pháp CRISPR-Cas9 trên cá ngựa vằn, đánh dấu lần đầu tiên ứng dụng công nghệ này tại Việt Nam Thành công của dự án sẽ mở ra cơ hội cho các nhà khoa học trong nước khám phá thêm về phương pháp loại bỏ gen Nghiên cứu tập trung vào việc sử dụng cá ngựa vằn như một mô hình động vật để tìm hiểu vai trò sinh lý của Nrf2, cho thấy rằng cá ngựa vằn là một mô hình lý tưởng để phân tích chức năng in vivo của các phân tử liên quan đến căng thẳng Điểm nổi bật của nghiên cứu này dựa trên các phát hiện in vitro trước đây của Mukagasa et al 2012, chứng minh rằng hai Nrf2 ở cá ngựa vằn có khả năng cảm biến các chất oxy hóa khác nhau.
Ý nghĩa khoa học và sự cần thiết vấn đề cần nghiên cứu
Xác định vai trò sinh lý của "cảm biến căng thẳng" là rất quan trọng, không chỉ cho nghiên cứu khoa học cơ bản mà còn cho các ứng dụng thực tiễn, như trong việc phát triển thuốc kích hoạt Nrf2.
Việc xác định vai trò sinh lý của Keap1 như một "thuốc ức chế ung thư" là rất quan trọng, giúp chúng ta hiểu rõ hơn về sự cân bằng giữa chống lão hóa và chống ung thư.
Giới thiệu chung về cá ngựa vằn
Cá ngựa vằn được sắp xếp theo hệ thống phân loại như sau:
Ngành có dây sống: Chordata
Họ cá rô phi: Cyprinidae
Tên tiếng việt: Cá ngựa vằn; Cá sọc ngựa.
Cá ngựa vằn (Danio rerio) là một loại cá nước ngọt nhiệt đới phổ biến trong nuôi cá cảnh và nghiên cứu khoa học nhờ vào khả năng dễ nuôi, sinh sản nhanh và đặc điểm gen thú vị Từ giữa thế kỷ 20, cá ngựa vằn đã trở thành động vật mô hình thí nghiệm, và vào những năm 1980, tiến sĩ George Streisinger cùng nhóm nghiên cứu tại đại học Oregon đã cách mạng hóa mô hình nghiên cứu di truyền, mở rộng từ động vật không xương sống sang cá ngựa vằn.
Các nhóm nghiên cứu tại Boston và Đức đã thực hiện hai cuộc sàng lọc di truyền lớn, tạo ra hàng ngàn chủng đột biến, cung cấp công cụ quan trọng để hiểu rõ sự phát triển ở mức độ phân tử Những nghiên cứu này, được công bố vào đầu những năm 1990, đã đưa cá ngựa vằn trở thành mô hình động vật nghiên cứu về sự phát triển Qua thời gian, cá ngựa vằn đã được mở rộng ứng dụng trong nghiên cứu sức khỏe, bệnh lý ở con người, thử độc tính, và nghiên cứu cách thức hành động cũng như tiến hóa (Harper and Lawrence 2011).
1.9.2 Lịch sử phân bố tự nhiên
Cá ngựa vằn, có nguồn gốc từ Nam Á, chủ yếu phân bố ở hạ lưu nhiều sông lớn tại Ấn Độ, Bangladesh và Nepal, nơi có khí hậu gió mùa với mùa mưa và mùa khô Loài cá này thường sống ở vùng ngập lũ, trong các vùng nước nông, đứng hoặc chảy chậm, có thảm thực vật thủy sinh và lớp nền phù sa Chất lượng nước trong môi trường sống của cá ngựa vằn có thể thay đổi đáng kể, với pH từ 5,9 đến 8,5 và nhiệt độ từ 16 đến 38°C Trong tự nhiên, chúng chủ yếu ăn động vật phù du, côn trùng, tảo, mảnh vụn và các vật liệu hữu cơ khác.
1.9.3 Đặc tính sinh học cơ bản
Cá ngựa vằn là loài cá nhỏ, năng động, nổi bật với 5 đến 7 sọc ở hai bên cơ thể và có 3 vây chưa ghép đôi cùng 2 vây có cặp Chúng có chiều dài từ 25 mm đến 35 mm khi được một tuổi, với tốc độ tăng trưởng nhanh nhất trong 3 tháng đầu đời và chậm lại sau 18 tháng Cá ngựa vằn nuôi trong phòng thí nghiệm phát triển nhanh hơn so với cá hoang dã Cá cái thường lớn hơn cá đực, có màu vàng nhạt ở bụng và vây hậu môn lớn hơn, trong khi cá đực mảnh mai hơn (Harper and Lawrence 2011).
Hình 1.12 Cá ngựa vằn đực và cái.
Cá ngựa vằn có thời gian sinh sản ngắn từ 2 đến 4 tháng, với quá trình thụ tinh diễn ra bên ngoài Chúng thường đẻ trứng trước và trong mùa mưa trong tự nhiên, nhưng trong điều kiện phòng thí nghiệm, cá ngựa vằn có thể đẻ hàng trăm trứng mỗi ngày Trứng có đường kính khoảng 0,7 mm và các phôi trong suốt sẽ hình thành các cơ quan chính trong vòng 36 giờ sau khi thụ tinh Ấu trùng bắt đầu tìm kiếm thức ăn từ ngày thứ 5 Tuổi thọ của cá ngựa vằn trong môi trường phòng thí nghiệm dao động từ 42 đến 66 tháng, nhưng các chủng đột biến có thể có tuổi thọ ngắn hơn do khiếm khuyết di truyền.
1.9.4 Bộ gen cá ngựa vằn
Cá ngựa vằn sở hữu bộ gen lưỡng bội với 25 cặp nhiễm sắc thể, được giải trình tự bởi viện Welcome Trust Sanger từ năm 2001 Bộ gen này dài khoảng 1.4x 10^9 bp, tương đương gần một nửa kích thước bộ gen người, và dự đoán chứa hơn 26,000 gen mã hóa protein, cao hơn bất kỳ động vật nào đã được giải trình tự trước đó, bao gồm cả người, chuột và gà Đặc biệt, các trình tự lặp lại chiếm khoảng 40%, tương tự như đặc điểm của bộ gen người Mức độ tương đồng giữa bộ gen cá ngựa vằn và người đạt khoảng 70% (Howe et al 2013).
Hình 1.13 Sự tương quan giữa bộ gen người, gà, chuột và cá ngựa vằn (Howe et al 2013)
Một so sánh giữa gen mã hóa protein ở người và cá ngựa vằn cho thấy rằng 71.4% số gen ở người có ít nhất một đồng phân với cá ngựa vằn, trong khi 69% số gen cá ngựa vằn cũng có ít nhất một đồng phân ở người Đặc biệt, trong số các gen đồng phân, có 47% gen ở người có mối quan hệ 1-1 với đồng phân ở cá ngựa vằn (Howe et al 2013).
Một trong những đồng phân quan trọng trong con đường chống oxy hóa bảo vệ tế bào là sự hoạt hóa Keap1-Nrf2, đã được nghiên cứu và cho thấy sự bảo tồn từ cá ngựa vằn đến con người Đáng chú ý, ở người chỉ tồn tại một gen keap1, trong khi cá ngựa vằn có hai dạng đồng phân là keap1a và keap1b (Nguyen et al 2020).
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp chuẩn bị chuỗi RNA hướng dẫn đơn -single guilde
RNA (sgRNA) và Cas9 mRNA
Các dòng cá ngựa vằn được loại bỏ gen Nrf2 sẽ được tạo ra bởi phương pháp CRISPR-Cas9 Cụ thể
Hình 2.2 Vị trí được thế kế ở vị trí Neh2 domain (exon 2) của bộ gen cá ngựa vằn.
Biểu đồ được tạo ra bằng phần mềm Snapgen 2.3.2 Để thiết kế các chuỗi RNA hướng dẫn đơn (sgRNA) cụ thể, chúng tôi tìm kiếm các mục tiêu của vị trí RNA hướng dẫn (gRNA) bộ gen theo hướng dẫn trên trang web http://chopchop.cbu.uib.no Cụ thể, chúng tôi nhập tên gen nfe2l2a (Nrf2) vào mục “Target”, chọn “Danio rerio (danRer11/GEC11)” ở mục “In”, sau đó chọn “CRISPR/Cas9” ở mục “Using” và “knockout” ở mục “For” Cuối cùng, chúng tôi nhấn nút “Find Target Sites” để tìm các vị trí mục tiêu.
Các vị trí gRNA mục tiêu của Nrf2 ở cá ngựa vằn lần lượt là 5'-
Trình tự gen TGGATCTGATCGATATCCTGTGG -3' với phần PAM được gạch chân (Hình 2; 5) được sử dụng để xác định hiệu quả knockout gen Nrf2 thông qua vi tiêm tạo cá thế hệ F0 và F1 Các cặp mồi Nrf2.hma.f1 và Nrf2.hma.r1 (Hình 14; bảng 1) được thiết kế dựa trên đề xuất từ trang web http://chopchop.cbu.uib.no (Hình 3; 5), sau khi lựa chọn các vị trí RNA dẫn đường.
Hình 2.3 Trang web (http://chopchop.cbu.uib.no) hỗ trợ thiết kế vị trí các chuỗi RNA hướng dẫn đơn (sgRNA) của gen Nrf2 ở cá ngựa vằn.
Cụ thể, nhập tên gen (trong nghiên cứu này là gen nfe2l2a) vào mục
To find target sites for Danio rerio (danRer11/GEC11), select "Target" and then choose "CRISPR/Cas9" under the "Using" section, followed by selecting "knockout" in the "For" section Finally, click the central button labeled "Find Target Sites."
Hình 2.4 Vị trí sgRNA nfe2l2a (Nrf2) cá ngựa vằn được thiết kế từ http://chopchop.cbu.uib.no/ Rank: 1 với trình tự mục tiêu:
TGGATCTGATCGATATCCTGTGG được lựa chọn (trình tự PAM được gạch chân).
Hình 2.5 Lựa chọn cặp mồi để phát hiện indel sau khi knockout gen
Nrf2 được nghiên cứu thông qua kỹ thuật CRISPR-Cas9 ở cá ngựa vằn, với cặp mồi thiết kế sẵn từ trang web http://chopchop.cbu.uib.no Cặp mồi đầu tiên được sử dụng là Nrf2.hma.f1:
Các trình tự gRNA mục tiêu của Nrf2 ở cá ngựa vằn 5'-
The sequence TGGATCTGATCGATATCCTGTGG -3' was sent to Integrated DNA Technologies, Inc for the synthesis of single-guide RNA (sgRNA) for keap1a and keap1b Additionally, the Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3 was procured from Integrated DNA Technologies, Inc.
Hình 2.6 sgRNA Nrf2 của cá ngựa vằn được tổng hợp từ công ty IDT.
2.3.2 Loại bỏ gen bằng CRISPR-Cas 9 và Phương pháp vi tiêm
Cá ngựa vằn hoang dại AB được sử dụng trong nghiên cứu sinh sản nhằm loại bỏ gen Để chuẩn hóa, cần thực hiện quy trình với 10 nmol của 100 bases Alt-R CRISPR-Cas9 sgRNA Nrf2 bằng cách thêm 100 µL nuclease free duplex buffer (IDT), đạt nồng độ cuối cùng là 100 µM.
Tiếp theo pha loóng Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 àg (10 àg/àL) (10 àg/àL Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3 0.5 àL; Cas9 working protein buffer (20 mM HEPES;
Để chuẩn bị dung dịch vi tiêm tạo sản phẩm RNP, pha trộn 3 àL sgRNA Nrf2 với 3 àL của 0.5 àg/àL Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3 trong dung dịch 150 mM KCl (pH 7.5) Sau khi kết hợp, ủ hỗn hợp ở nhiệt độ 37°C trong 10 phút, sau đó để mẫu hạ xuống nhiệt độ phòng.
Để thực hiện knockout gen Nrf2, dòng cá ngựa vằn AB được thu thập từ trường Đại học Tsukuba, Nhật Bản, đã được sử dụng để sinh sản và tạo phôi trứng, chuẩn bị cho việc knockout gen keap1a và keap1b.
Cá ngựa vằn nuôi đạt kích thước khoảng 3 tháng tuổi Sau đó cá cá đực và cái được tách ra nuôi từng bể riêng.
Trước ngày đẻ trứng một ngày, cần ghép cá đực và cái với tỷ lệ 3 cái và 2 đực trong bể đẻ Bể này được thiết kế với lớp lưới inox ngăn bên dưới, giúp trứng rơi xuống mà không bị cá bố mẹ ăn mất.
Bể đẻ cá ngựa vằn dòng AB được thiết lập với thể tích 1.5 lít, bao gồm 3 cá cái và 2 cá đực Sau khi đẻ, trứng cá được thu thập và đặt trong đĩa petri để chuẩn bị cho vi tiêm Trứng có màu trắng đục cho thấy chúng là trứng không thụ tinh.
Trứng màu trong suốt là trứng phát triển tốt.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thu thập trứng cá ngựa vằn dòng AB ở giai đoạn 1 tế bào và thực hiện vi tiêm 3 nL sản phẩm kết hợp RNP Mỗi lần tiêm, ít nhất 20 trứng được vi tiêm, và sau đó, tỉ lệ sống sót của phôi được kiểm tra tại các thời điểm 8 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 96 giờ.
Sau 96 hrs, tiến hành thu 15 ấu trùng cá riêng biệt để chạy PCR với cặp mồi
Nrf2.hma.f1/r1 và Nrf2.hma.f1/r1 để kiểm tra hiệu quả knockout gen ở thế hệ F0
Phân tích sản phẩm PCR trên 9% acrylamide gel và đánh giá hiệu quả chuyển gen.
Sau khi đánh giá hiệu quả vi tiêm, cá F0 sẽ được nuôi trong khoảng 3 tháng cho đến khi thành thục, sau đó tiến hành lai với cá hoang dã để tạo ra đàn cá F1 Ấu trùng cá F1 hoặc F2 sẽ được đánh giá hiệu quả knockout gen sau 96 giờ thụ tinh bằng cặp mồi Nrf2.hma.f1 và Nfr2.hma.r1 Nếu phát hiện band heteroduplex, các mẫu sẽ được giải trình tự với mồi trong bảng 1 để xác định xem gen đã bị loại bỏ (deletion) hay thêm vào (insertion) nucleotide.
Bảng 2.4: Trình tự các cặp mồi (Oligonucleotide)
Genes Mục đích Trình tự mồi
Xác định kiểu gen
DNA tổng số được chiết xuất từ cắt vây đuôi cá trưởng thành bằng môi trường tách chiết gồm 10 mM Tris-HCl (pH 8.2), 10 mM EDTA (pH 8.0), 200 mM NaCl, 0.1% sodium dodecyl sulfate và 400 g/mL proteinase K, ủ ở 55°C trong 4 giờ Sau đó, DNA thu được sẽ được khuếch đại bằng PCR với cặp mồi 5′- TGTGATGCCTGACCTCTGATGT và 5′- GTCGAACACCTCACGGCCC cho gen Nrf2 Kiểu gen được đánh giá thông qua điện di trên 9% gel polyacrylamide.
2.4.1 Cắt đuôi cá, tách DNA
Để tiến hành chạy PCR, cần cắt đuôi của 32 con cá F1 Nrf2 knockout gen Quy trình chuẩn bị bao gồm các vật liệu như chất gây mê Ben zocaine, 32 ly nước được đánh số từ 1 đến 32, và 32 ống Eppendorf chứa 50µL TNEST để phân hủy đuôi cá sau khi cắt nhằm thu thập DNA Ngoài ra, cần có nước sạch, 2 đĩa petri, muỗng và nhíp để thực hiện việc cắt đuôi cá.
Bảng 2.5: các thành phần của môi trường TNES, dùng để chiết xuất DNA
Hỡnh 2.8 Đĩa petri bờn trỏi chứa 50 àL Ben zocaine (chất gõy mờ) với 50 mL nước Đĩa petri bên phải chứa nước sạch.
Hình 2.9 Các dụng cụ cần chuẩn bị để tiến hành cắt đuôi cá.
Để tiến hành cắt đuôi cá F1 Nrf2 knockout gene, trước tiên, cho cá vào đĩa petri có pha chất gây mê khoảng 1 phút để cá nằm yên Sau đó, chuyển cá sang đĩa petri chứa nước sạch và sử dụng nhíp để cắt một phần đuôi cá, giúp cá có khả năng phục hồi Phần đuôi cá đã cắt được cho vào ống eppendorf chứa TNEST và đậy nắp lại Cuối cùng, thả cá vào ly nước sạch đã chuẩn bị sau khi cắt đuôi xong.
Hình 2.10 Thao tác bỏ đuôi cá đã cắt vào ống eppendorf chứa TNEST.
Thờm 0.5 àL enzyme proK (50 mg/mL) for 50 uL mụi trường TNEST buffer Sau đó, ủ mẫu ở 55oC ít nhất 4 hrs Sau khi mẫu ủ, tiến hành pha loãng mẫu DNA 1/10 để chạy PCR.
2.4.2 Chạy PCR mẫu cá F1 Nrf2
Sau khi để mẫu đuôi cá qua đêm, tiến hành chạy PCR Đầu tiên, pha loãng mẫu DNA của cỏ ngựa vằn bằng cách kết hợp 2µL mẫu với 38µL H2O Tiếp theo, chuẩn bị các thiết bị và hóa chất cần thiết, bao gồm H2O, 10µM-Nrf2.seq.f5, 10µM-Nrf2.seq.r5 và DreamTag Green PCR master mix.
Bảng 2.6: Các thành phần để chạy PCR
Chuẩn bị pha premix để chạy PCR X1 Mẫu X1 X23
Water, nuclease-free 5.5 àL 3.5 àL 81.3 àL
10uM-Nrf2.seq.f5 0.5 àL 0.3 àL 7.4 àL
10uM-Nrf2.seq.r5 0.5 àL 0.3 àL 7.4 àL
DreamTag Green PCR master mix 7.5 àL 4.8 àL 110.9 àL
Sau đú, chia đều 9 àL premix vào PCR tube.
Cho thờm 1 àL DNA đó pha loóng vào mỗi PCR tube Rồi tiến hành đưa cỏc PCR tube vào máy PCR để chạy theo chu trình.
Bảng 2.7: Chu trình chạy PCR
Hình 2.11 Tiến hành bỏ mẫu vào để chạy PCR
Sau khi hoàn thành quá trình chạy PCR, bước tiếp theo là đổ gel Để thực hiện, cần chuẩn bị các dụng cụ và hóa chất như khuôn đổ gel, lược tạo giếng, nước H2O, 30% Acrylamide, dung dịch 10X TBE, TEMED và 10% APS.
Bảng 2.8: Thành phần các chất để đổ gel Đổ gel Acrylamide 9% 1 Gel 2 Gel
Sau đó, trộn đều hỗn hợp rồi đổ vào khuôn, gắn lược Đợi khoảng 30 phút sau gel sẽ đông lại.
Sau khi gel được đổ và mẫu trong máy PCR hoàn tất quá trình chạy, tiến hành hút 9 µL từ ống PCR để bơm vào các giếng trên miếng gel Đối với giếng đầu tiên, cần thêm 7 µL thang vào.
Hình 2.12 Bơm mẫu vào các giếng trong gel
Sau khi xong sẽ cho gel vào máy chạy điện di để chạy điện di mẫu Chu trình chạy điện di mẫu: 200V, 60mA, 50 phút.
Hình 2.13 Quá trình chạy điện di
Sau khi chạy điện di 50 phút thì sẽ lấy gel ra và cho vào trong dung dịch ethidium bromide khoảng 30 phút rồi cho vào máy để đọc gel.
Hình 2.14 Kết quả sau khi chạy điện di
GIẢI TRÌNH TỰ
Bước 1: Cho vào tuýp 5àL mẫu PCR, 2àL EXP SAPit
Bước 2: Chạy mẫu ở điều kiện 37 o C trong vòng 15 phút và 80 o C trong vòng
PCR for sequencing Nrf2 KO
PCR product 5uL Incubate 37oC 15min
Exp SAPit 2uL 80oC 15 min
4oC oo for sequencing or store at -20oC
Premix 2 Nrf2.seq.f1 x 1 x6 PCR condition
Big dye terminator 0.5 uL 3uL 96oC 10sec
10uM Nrf2.seq.f1 0.15 uL 0.9uL 60oC 4min cycles
Total 7 uL 42uL 4oC oo
Add Exo SAPit mixture 3 uL
Hình 2.15 Cách pha Exo SAPit để tinh sạch sản phẩm PCR.
Hình 2.16 Hoá chất EXP SAPit 2.5.2 Giải trình tự
Sau đây là các bước pha mẫu để giả trình tự:
1 Ly tâm mẫu chạy 5-10 giây
2 Thêm 2.5 uL của 125 mM EDTA
QUAN TRỌNG! Cho trực tiếp EDTA xuống dưới các mẫu GTT.
3 Thêm 30uL của 100% Ethanol Tổng mẫu 42.5 uL/giếng
4 Chuyển 42.5 uL mỗi mẫu từ tube PCR sang eppendoft 1.5 mL
5 Votex eppendoft 2-3 seconds Sau đó ly tâm nhanh 5-10 seconds at 1.000 g
6 Để mẫu ở nhiệt độ phòng 15 phút tạo kết tủa
QUAN TRỌNG! Thời gian tạo kết tủa là quan trọng
QUAN TRỌNG! Thực hiện bước kế tiếp ngay lập tức.
Nếu không thể, tiến hành li tâm tiếp 2 phút trước khi chuyển sang bước tiếp theo
8 Cẩn thận loại bỏ dịch nổi
QUAN TRỌNG! Thực hiện bước kế tiếp ngay lập tức.
Nếu không thể, tiến hành li tâm tiếp 2 phút trước khi chuyển sang bước tiếp theo
12 Cẩn thận loại bỏ dịch nổi
14 Để khô trong không khí, miệng úp xuống, tránh sáng ở nhiệt độ phòng 5-10 phút.
15 Cho 15 uL HIDI-Formamide để hoàn tan cục kết tủa
16 Nung nóng mẫu 96oC trong 2 phút, bỏ trong đá 4oC ngay lập tức.
17 Chuyển mẫu vào đĩa giải trình tự Đậy nắp
18 Thực hiện giải trình tự
Hình 2.18 Quá trình ly tâm mẫu
Hình 2.19 Bỏ mẫu vào máy để chuẩn bị sấy khô
Hình 2.20 Bỏ vào máy tác dụng nhiệt
Hình 2.21 Máy giải trình tự gen 3500XL - hãng Applied Biosystems của Trung tâm
Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh
Trong chương 3, chúng tôi trình bày kết quả và thảo luận về việc vi tiêm tạo cá knockout gen sgRNA Nrf2 kết hợp với protein Cas9 vào giai đoạn phôi 1 tế bào của cá ngựa vằn Hiệu quả của phương pháp vi tiêm này sẽ được kiểm tra sau một khoảng thời gian nhất định.
Hình 3.1 Điện di kiểm tra hiệu quả sau khi vi tiêm sgRNA Nrf2 vào phôi cá ngựa vằn giai đoạn F0 (4 ngày sau khi vi tiêm).
Kết quả chạy PCR xác định cá ngựa vằn knockout gen Nrf2 ở thế hệ F1, được lai từ cá F0 và cá hoang dã, cho thấy có ba dòng cá (Cá 2, 4 và 5) đã thành công trong việc knockout gen này.
Nrf2 thành công được tạo ra.
Kết quả cho thấy, sau khi vi tiêm sgRNA-Keap1a/Cas9 vào giai đoạn 01 tế bào của cá ngựa vằn, hiệu quả knockout đã được xác định bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi keap1a-hma-f1 và keap1a-hma-r1 Phân tích cho thấy thành công tạo ra band heteroduplex ở thế hệ F0, diễn ra 4 ngày sau khi vi tiêm.
Sau 3-4 tháng nuôi lớn, các dòng cá F0 sẽ được lai với cá hoang dại để tạo ra phôi cá Sau 4 ngày, phôi cá được tiến hành kiểm tra bằng phương pháp PCR với cặp mồi Keap1a-seq-f1 và Keap1a-seq-r1 nhằm xác định sự knockout của gen keap1a Kết quả cho thấy có 3 dòng cá đã thành công trong việc knockout gen: dòng 1 (mẫu 2.6 có 9 bp bị xóa), dòng 2 (mẫu 2.10 có 9 bp bị xóa), và dòng 3 (mẫu 2.11 có 24 bp bị xóa cùng với 21 bp được chèn, tổng cộng 3 bp bị xóa).
3.2 Giải trình tự cá knockout gen keap1b
Hình 3.3 Giải trình tự xác định cá ngựa vằn knocout gen keap1b ở thế hệ
F1 Kết quả có 02 dòng được knockout gen keap1a thành công Dòng 1 (mẫu 3 có 4 bp deleted); dòng 2 (mẫu 7 15 bp deleted).
Hình 3.4 cặp mồi nrf2-seq-f5 chạy điện di và cặp mồi nrf2-seq-f1 chạy giải trình tự
Hình 3.5 Kết quả sau khi giải trình tự
Kết quả cho thấy, cá ngựa vằn sau khi được vi tiêm sgRNA-Keap1b/Cas9 ở giai đoạn 01 tế bào đã thành công trong việc knockout gen, được xác nhận qua phương pháp PCR với cặp mồi keap1b-hma-f1 và keap1b-hma-r1, tạo ra band heteroduplex ở thế hệ F0 chỉ sau 4 ngày vi tiêm.
Sau 3-4 tháng nuôi lớn, các dòng cá F0 đạt giai đoạn thành thục sẽ được lai với cá hoang dã Sau 4 ngày, các phôi cá nở sẽ được tiến hành chạy PCR sử dụng cặp mồi Keap1b-seq-f1.
Nghiên cứu đã kiểm tra các dòng cá đã knockout gen keap1a, và kết quả cho thấy có hai dòng thành công Cụ thể, dòng 1 (mẫu 3) có 4 bp bị xóa, trong khi dòng 2 (mẫu 7) có 15 bp bị xóa.
Các dòng cá F1 được nuôi dưỡng và sinh sản để tạo ra cá F2 Hiện tại, các dòng cá F2 đang được nuôi sàn lọc nhằm phát triển các dòng ổn định phục vụ cho các thí nghiệm.
Tóm lại, chủ nhiệm đề tài đã tạo được các dòng cá knockout gen keap1a và keap1b theo như tiến độ đề tài.
Hình 3.6 Cá F1 được cho lai tạo dòng cá ổn định ở thế hệ hệ F2 knockout gen Nrf2.
Hình 3.7 Giàn cá chuyển gen Nrf2 của Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh
Hình 3.8 Cá được chia ra đực, cái rõ ràng
Hình 3.9 Mô tả tóm tắt phương pháp tạo dòng cá knockout gen ổn định đến thế hệ F2 bằng phương pháp CRISPR-Cas9
3.3 Kết luận Đã tạo được 3 dòng cá knockout gen Nrf2 bằng CRISPR-Cas9
5 Kết luận và kiến nghị
Giải trình tự cá knockout gen keap1b
Hình 3.3 Giải trình tự xác định cá ngựa vằn knocout gen keap1b ở thế hệ
F1 Kết quả có 02 dòng được knockout gen keap1a thành công Dòng 1 (mẫu 3 có 4 bp deleted); dòng 2 (mẫu 7 15 bp deleted).
Hình 3.4 cặp mồi nrf2-seq-f5 chạy điện di và cặp mồi nrf2-seq-f1 chạy giải trình tự
Hình 3.5 Kết quả sau khi giải trình tự
Kết quả cho thấy, cá ngựa vằn sau khi vi tiêm sgRNA-Keap1b/Cas9 ở giai đoạn 01 tế bào đã đạt hiệu quả knockout, được xác nhận bằng phương pháp PCR với cặp mồi keap1b-hma-f1 và keap1b-hma-r1 Thành công này được thể hiện qua sự xuất hiện của band heteroduplex ở thế hệ F0, 4 ngày sau khi vi tiêm.
Sau 3-4 tháng nuôi lớn, các dòng cá F0 đạt giai đoạn thành thục sẽ được lai với cá hoang dại Phôi cá nở sau 4 ngày sẽ được tiến hành chạy PCR bằng cặp mồi Keap1b-seq-f1.
Kết quả kiểm tra các dòng cá knockout gen keap1a cho thấy có hai dòng thành công Dòng 1 (mẫu 3) có 4 bp bị xóa, trong khi dòng 2 (mẫu 7) có 15 bp bị xóa.
Các dòng cá F1 được nuôi dưỡng và sinh sản để tạo ra cá F2 Hiện tại, các dòng cá F2 đang được nuôi sàn lọc nhằm phát triển các dòng ổn định phục vụ cho mục đích thí nghiệm.
Tóm lại, chủ nhiệm đề tài đã tạo được các dòng cá knockout gen keap1a và keap1b theo như tiến độ đề tài.
Hình 3.6 Cá F1 được cho lai tạo dòng cá ổn định ở thế hệ hệ F2 knockout gen Nrf2.
Hình 3.7 Giàn cá chuyển gen Nrf2 của Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh
Hình 3.8 Cá được chia ra đực, cái rõ ràng
Hình 3.9 Mô tả tóm tắt phương pháp tạo dòng cá knockout gen ổn định đến thế hệ F2 bằng phương pháp CRISPR-Cas9
Kết luận
Đã tạo được 3 dòng cá knockout gen Nrf2 bằng CRISPR-Cas9
5 Kết luận và kiến nghị
