2 .1Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp chuẩn bị chuỗi RNA hướng dẫn đơn single guilde RNA
(sgRNA) và Cas9 mRNA
Các dòng cá ngựa vằn được loại bỏ gen Nrf2 sẽ được tạo ra bởi phương pháp CRISPR-Cas9. Cụ thể
Hình 2.2. Vị trí được thế kế ở vị trí Neh2 domain (exon 2) của bộ gen cá ngựa vằn.
Biểu đồ được tạo bằng phần mềm Snapgen 2.3.2.
Để thiết kế các chuỗi RNA hướng dẫn đơn (sgRNA) cụ thể, chúng tơi tìm các mục tiêu của vị trí RNA hướng dẫn (gRNA) bộ gen bằng cách làm theo hướng dẫn của trang web: http://chopchop.cbu.uib.no . Cụ thể, nhập tên gen (trong nghiên cứu này là gen nfe2l2a (Nrf2) vào mục “Target”, bấm chọn “Danio rerio (danRer11/GEC11)” ở mục “In”. Tiếp theo chọn “CRISPR/Cas9” ở mục “Using” và “knockout” ở mục “For”. Cuối cùng bấm vào nút giữa cuối cùng “Find Target Sites” (Hình 1).
Các vị trí gRNA mục tiêu của Nrf2 ở cá ngựa vằn lần lượt là 5'-
TGGATCTGATCGATATCCTGTGG -3' (Trình tự PAM được gạch chân) (Hình 2; 5). Tiếp theo để xác định được hiệu quả knockout gen Nrf2 sau khi vi tiêm để tạo cá thế hệ F0 và F1. Các cặp mồi Nrf2.hma.f1; Nrf2.hma.r1 (Hình 14; bảng 1) được thiết kế theo đề xuất của trang web: http://chopchop.cbu.uib.no (Hình 3; 5). Các cặp mồi được đề xuất sau khi lựa chọn các vị trí RNA dẫn đường được thực hiện.
Hình 2.3. Trang web (http://chopchop.cbu.uib.no) hỗ trợ thiết kế vị trí
các chuỗi RNA hướng dẫn đơn (sgRNA) của gen Nrf2 ở cá ngựa vằn. Cụ thể, nhập tên gen (trong nghiên cứu này là gen nfe2l2a) vào mục “Target”, bấm chọn Danio rerio (danRer11/GEC11) ở mục “In”. Tiếp theo chọn CRISPR/Cas9 ở mục “Using” và knockout ở mục “For”. Cuối
cùng bấm vào nút giữa cuối cùng “Find Target Sites”.
Hình 2.4. Vị trí sgRNA nfe2l2a (Nrf2) cá ngựa vằn được thiết kế từ
http://chopchop.cbu.uib.no/. Rank: 1 với trình tự mục tiêu:
Hình 2.5. Lựa chọn cặp mồi để phát hiện indel sau khi knockout gen
Nrf2 bằng CRISPR-Cas9 ở cá ngựa vằn. Cặp mồi thiết kế sẵn có từ trang web http://chopchop.cbu.uib.no sau khi thiết kế sgRNA
keap1b. Cụ thể cặp mồi đầu tiên Nrf2.hma.f1: 5’- ctaGTGTGTGATGCCTGACCTC và Nrf2.hma.r1: 5’-
CAGTGTcttctcctgctcctg được lựa chọn. Các trình tự gRNA mục tiêu của Nrf2 ở cá ngựa vằn 5'-
TGGATCTGATCGATATCCTGTGG -3' sau đó được gởi đến cơng ty “Integrated DNA Technologies, Inc” để tổng hợp RNA dẫn đường đơn (sgRNA) keap1a và keap1b. Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3 được mua từ công ty “Integrated DNA Technologies, Inc”