2 .1Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.2 Giải trình tự cá knockout gen keap1b
Hình 3.3. Giải trình tự xác định cá ngựa vằn knocout gen keap1b ở thế hệ
F1. Kết quả có 02 dịng được knockout gen keap1a thành cơng. Dịng 1 (mẫu 3 có 4 bp deleted); dịng 2 (mẫu 7 15 bp deleted).
Hình 3.5. Kết quả sau khi giải trình tự
Qua kết quả cho thấy, cá ngựa vằn sau khi vi tiêm sgRNA-Keap1b/Cas9 ở giai đoạn 01 tế bào, được xác định hiệu quả vi tiêm knockout bằng phương pháp PCR với cặp mồi keap1b-hma-f1 (5’- GTGTGTATGATGTGTGCGTGTC) và keap1b-hma-r1 (5’-CTCCAGCGTGTAGCTGAAGAC), cho kết quả thành cơng tạo band hetetoduplex (hình 3) ở thế hệ F0 (4 ngày sau khi vi tiêm).
Các dòng cá F0 này được nuôi lớn sau 3-4 tháng đạt giai đoạn thành thục sẽ được cho lai với cá hoang dại. Các phôi cá nở sau 4 ngày được sử dụng tiến hành chạy PCR với cặp mồi Keap1b-seq-f1 (5’-
CCCCCTCAGGATTCGCGT) và Keap1b-seq-r1 (5’-
CGACGTGTGTGTCGAGCG) và kiểm tra các dòng cá được knockout gen keap1a hay khơng. Kết quả hình 4 cho thấy, có 2 dịng kiểm tra knocout gen thành cơng. Dịng 1 (mẫu 3 có 4 bp deleted); dịng 2 (mẫu 7 15 bp deleted).
Các dịng cá F1 này được ni lớn và cho sinh sản tạo ra cá F2. Các dịng cá F2 này đang được ni sàn lọc tạo các dịng ổn định phục vụ cho thí nghiệm
Tóm lại, chủ nhiệm đề tài đã tạo được các dòng cá knockout gen keap1a và keap1b theo như tiến độ đề tài.
Hình 3.6. Cá F1 được cho lai tạo dòng cá ổn định ở thế hệ hệ F2 knockout
Hình 3.7. Giàn cá chuyển gen Nrf2 của Trung tâm Công nghệ sinh
học Thành phố Hồ Chí Minh
Hình 3.9. Mơ tả tóm tắt phương pháp tạo dòng cá knockout gen ổn định đến thế hệ F2
bằng phương pháp CRISPR-Cas9