2 .1Thời gian và địa điểm nghiên cứu
2.3.2 Loại bỏ gen bằng CRISPR-Cas9 và Phương pháp vi tiêm
Cá ngựa vằn hoang dại AB được sử dụng cho sinh sản để tiến hành loại bỏ gen
Đầu tiên chuẩn hóa 10 nmol của 100 bases Alt-R CRISR-Cas9 sgRNA Nrf2 bằng cách thêm 100 µL nuclease free duplex buffer (IDT) để có nồng độ cuối là 100 µM.
Tiếp theo pha lỗng Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg (10 µg/µL) (10 µg/µL Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3 0.5 µL; Cas9 working protein buffer (20 mM HEPES; 150 mM KCl 7.5 pH) 9.5 µL, để đạt nồng độ cuối 0.5 µg/µL Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3).
Để pha dung dịch thực hiện vi tiêm tạo sản phẩm RNP, kết hợp 3 µL sgRNA Nrf2 với 3 µL của 0.5 µg/µL Alt-R S.p HiFi Cas9 Nuclease V3. Ủ ở nhiệt độ 37oC cho 10 phút, sau đó để mẫu hạ xuống nhiệt độ phịng.
Cho đẻ cá ngựa vằn dòng AB:
Để tiến hành knockout gen Nrf2, dòng cá ngựa vằn AB (được thu thập từ trường Đại học Tsukuba, Nhật Bản) được sử dụng để cho sinh sản tạo phôi trứng, sẵn sàng để thực hiện knockout gen keap1a và keap1b.
Cá ngựa vằn ni đạt kích thước khoảng 3 tháng tuổi. Sau đó cá cá đực và cái được tách ra nuôi từng bể riêng.
Trước ngày cho đẻ 1 ngày, tiến hành ghép cá đực và cái theo tỉ lệ 3 cái: 2 đực trong bể cho đẻ được tiết kế có lớp lưới inox ngăn bên dưới để trứng rơi xuống, mà tránh cá bố mẹ ăn trứng (Hình 9)
Hình 2.7. Thiết lập bể cho đẻ cá ngựa vằn dịng cá AB. A: Bể có thể tích 1.5 lít nước. Bể
để trong đĩa petri sẵn sàng phục vụ vi tiêm. Trứng màu trắng đục là trứng không thụ tinh. Trứng màu trong suốt là trứng phát triển tốt.
Thu trứng cá ngựa vằn dòng AB ở giai đoạn 1 tế bào và thực hiện vi tiêm 3 nL sản phẩm kết hợp RNP. Vi tiêm ít nhất 20 trứng cho mỗi lần tiêm. Sau khi vi tiêm kiểm tra tỉ lệ sống của phôi tại thời điểm 8 hrs; 24 hrs; 48 hrs; và 96 hrs).
Sau 96 hrs, tiến hành thu 15 ấu trùng cá riêng biệt để chạy PCR với cặp mồi Nrf2.hma.f1/r1 và Nrf2.hma.f1/r1 để kiểm tra hiệu quả knockout gen ở thế hệ F0. Phân tích sản phẩm PCR trên 9% acrylamide gel và đánh giá hiệu quả chuyển gen.
Sau khi đánh giá hiệu quả sau vi tiêm, cá F0 sẽ được ni đến giai đoạn thành thục (~3 tháng), sau đó cho lai với cá hoang dại tạo ra đàn cá F1, ấu trùng cá F1 hoặc F2 ở giai đoạn sau 96 hrs sau khi thụ tinh sẽ được đánh giá hiệu quả knockout gen bằng cặp mồi Nrf2.hma.f1 và Nfr2.hma. r1. Nếu xuất hiện band heteroduplex, các mẫu này sẽ được thực hiện giải trình tự với mồi ở bảng 1 để đánh giá liệu gen đó được loại bỏ (deletion) hay thêm vào (insertion) các nucleotide.
Bảng 2.4: Trình tự các cặp mồi (Oligonucleotide)
Genes
Nrf2
2.4 Xác định kiểu gen
Đối với kiểu gen, DNA tổng số được chiết xuất từ cắt vây đuôi cá trưởng thành bằng cách sử dụng môi trường tách chiết: 10 mM Tris-HCl (pH 8.2), 10 mM EDTA (pH 8.0), NaCl 200 mM, 0.1 % sodium đoecyl sulfate và 400 g/mL proteinase K (Nacalai Tesque, Kyoto, Nhật Bản), bằng cách ủ ở 55°C trong 4 h. DNA tổng số thu được sẽ được khuếch đại bằng PCR bằng cách sử dụng cặp mồi 5′-
TGTGATGCCTGACCTCTGATGT và mồi 5′- GTCGAACACCTCACGGCCC cho gen Nrf2 (Bảng 2). Kiểu gen được đánh giá sau khi chạy điện di trên 9% gel
2.4.1 Cắt đuôi cá, tách DNA
Số con cá được cắt đuôi để tiến hành chạy PCR là 32 con. Để thực hiện cần chuẩn bị cá F1 Nrf2 knockout gen; Chất gây mê (Ben zocaine); 32 ly đựng nước có đánh số từ 1 đến 32; 32 ống eppendorf có đánh số từ 1 đến 32 có chứa 50µL TNEST để giúp phân hủy đi cá sau khi cắt nhằm thu được DNA của cá; nước sạch; 2 đĩa petri; Muỗng; Nhíp cắt đi cá.
Bảng 2.5: các thành phần của môi trường TNES, dùng để chiết xuất DNA
Hình 2.8. Đĩa petri bên trái chứa 50 µL Ben zocaine (chất gây mê) với 50 mL
Hình 2.9. Các dụng cụ cần chuẩn bị để tiến hành cắt đuôi cá.
Các bước tiến hành cắt đuôi cá: Đầu tiên bắt cá F1 Nrf2 knockout gene cho vào đĩa petri có pha chất gây mê để cá nằm yên (khoảng 1 phút). Sau đó, vớt cá qua đĩa petri chứa nước sạch, lấy nhíp cắt 1 phần đi cá (cắt 1 phần đi cá để cá có thể phục hồi đi). Sau đó bỏ đi cá đã cắt vào ống eppendorf đã chuẩn bị có chứa TNEST và đậy nắp lại. Cuối cùng thả cá sau khi tiến hành cắt đuôi xong vào ly chứa nước sạch đã chuẩn bị.
Hình 2.10. Thao tác bỏ đi cá đã cắt vào ống eppendorf chứa TNEST.
Thêm 0.5 µL enzyme proK (50 mg/mL) for 50 uL mơi trường TNEST buffer. Sau đó, ủ mẫu ở 55oC ít nhất 4 hrs. Sau khi mẫu ủ, tiến hành pha loãng mẫu DNA 1/10 để chạy PCR.
2.4.2. Chạy PCR mẫu cá F1 Nrf2
Sau khi để mẫu đi cá qua đêm thì sẽ chạy PCR. Đầu tiền là pha loãng mẫu DNA của cá ngựa vằn. Hút 2µL mẫu đi cá pha với 38µL H2O. Sau đó, chuẩn bị các thiết bị và hoá chất bao gồm: H2O, 10uM-Nrf2.seq.f5, 10uM-Nrf2.seq.r5, DreamTag Green PCR master mix.
Bảng 2.6: Các thành phần để chạy PCR
Sau đó, chia đều 9 µL premix vào PCR tube.
Cho thêm 1 µL DNA đã pha lỗng vào mỗi PCR tube. Rồi tiến hành đưa các PCR tube vào máy PCR để chạy theo chu trình.
Bảng 2.7: Chu trình chạy PCR95oC 95oC 95 oC 60 oC 72 oC 72 oC 4 oC ∞
Hình 2.11. Tiến hành bỏ mẫu vào để chạy PCR
Sau khi chạy PCR xong thì sẽ tiến hành đổ gel. Các dụng cụ, thiết bị và hoá chất cần chuẩn bị bao gồm: khuôn đổ gel, lược tạo giếng cho gel, H2O, 30% Acrylamide, 10X TBE, TEMDED, 10% APS.
Sau đó, trộn đều hỗn hợp rồi đổ vào khuôn, gắn lược. Đợi khoảng 30 phút sau gel sẽ đông lại.
Sau khi gel đông và mẫu trong máy PCR chạy xong thì sẽ tiến hành hút 9 µL từ PCR tube để bơm vào các giếng trong miếng gel. Giếng đầu tiên sẽ cho 7 µL thang vào.
Sau khi xong sẽ cho gel vào máy chạy điện di để chạy điện di mẫu. Chu trình chạy điện di mẫu: 200V, 60mA, 50 phút.
Hình 2.13. Quá trình chạy điện di
Sau khi chạy điện di 50 phút thì sẽ lấy gel ra và cho vào trong dung dịch ethidium bromide khoảng 30 phút rồi cho vào máy để đọc gel.
Hình 2.14. Kết quả sau khi chạy điện di2.5 GIẢI TRÌNH TỰ 2.5 GIẢI TRÌNH TỰ
2.5.1 Tinh sạch mẫu
Bước 1: Cho vào tuýp 5µL mẫu PCR, 2µL EXP SAPit
Bước 2: Chạy mẫu ở điều kiện 37oC trong vòng 15 phút và 80oC trong vòng 15 phút
PCR for sequencing Nrf2 KO
Exo SAPit mixture
PCR product Exp SAPit
Premix 2 Nrf2.seq.f1
Big dye terminator
Buffer bigdye 10uM Nrf2.seq.f1 H2O
Total
Add Exo SAPit mixture
Hình 2.16. Hố chất EXP SAPit2.5.2 Giải trình tự 2.5.2 Giải trình tự
Sau đây là các bước pha mẫu để giả trình tự:
Bước Ethanol/EDTA precipitation 1.Ly tâm mẫu chạy 5-10 giây
2.Thêm 2.5 uL của 125 mM EDTA
QUAN TRỌNG! Cho trực tiếp EDTA xuống dưới các mẫu GTT.
3.Thêm 30uL của 100% Ethanol. Tổng mẫu 42.5 uL/giếng 4.Chuyển 42.5 uL mỗi mẫu từ tube PCR sang eppendoft 1.5 mL
5.Votex eppendoft 2-3 seconds. Sau đó ly tâm nhanh 5-10 seconds at 1.000 g 6.Để mẫu ở nhiệt độ phòng 15 phút tạo kết tủa
QUAN TRỌNG! Thời gian tạo kết tủa là quan trọng
7. Li tâm 2.000 g, 45 min, 4oC
QUAN TRỌNG! Thực hiện bước kế tiếp ngay lập tức.
8.Cẩn thận loại bỏ dịch nổi 9.Thêm 30 uL, 75% Ethanol
10. Vortex nhanh 5-10 giây
11. Li tâm 2000 g, 15 min, 4oC
QUAN TRỌNG! Thực hiện bước kế tiếp ngay lập tức.
Nếu không thể, tiến hành li tâm tiếp 2 phút trước khi chuyển sang bước tiếp theo
12. Cẩn thận loại bỏ dịch nổi
13. Li tâm 1000 g trong 1 phút
14. Để khơ trong khơng khí, miệng úp xuống, tránh sáng ở nhiệt độ phòng 5-10 phút.
15. Cho 15 uL HIDI-Formamide để hồn tan cục kết tủa
16. Nung nóng mẫu 96oC trong 2 phút, bỏ trong đá 4oC ngay lập tức.
17. Chuyển mẫu vào đĩa giải trình tự. Đậy nắp
18. Thực hiện giải trình tự
Hình 2.20. Bỏ vào máy tác dụng nhiệt
Hình 2.21. Máy giải trình tự gen 3500XL - hãng Applied Biosystems của Trung tâm
CHƯƠNG 3KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Vi tiêm tạo cá knockout gen
sgRNA Nrf2 cùng với Cas9 protein được vi tiêm vào giai đoạn phôi 1 tế bào cá ngựa vằn. Hiệu quả vi tiêm sẽ được kiểm tra sau những ngày này.
Hình 3.1. Điện di kiểm tra hiệu quả sau khi vi tiêm sgRNA Nrf2 vào phơi cá ngựa vằn
Hình 3.2. Kết quả chạy PCR xác định cá ngựa vằn knockout gen Nrf2 ở thế hệ F1 (được
lai từ cá F0 và cá hoang dại). Kết quả có 03 dịng (Cá 2; 4 và cá 5) được knockout gen Nrf2 thành công được tạo ra.
Qua kết quả cho thấy, cá ngựa vằn sau khi vi tiêm sgRNA-Keap1a/Cas9 ở giai đoạn 01 tế bào, được xác định hiệu quả vi tiêm knockout bằng phương pháp PCR với cặp mồi keap1a-hma-f1 (5’-TTGTGCCTGTATTTCTTCATGG) và keap1a-hma-r1 (5’- GCCTCTCCATTGAATCTGTGTT), cho kết quả thành cơng tạo band hetetoduplex (hình 1) ở thế hệ F0 (4 ngày sau khi vi tiêm).
Các dịng cá F0 này được ni lớn sau 3-4 tháng đạt giai đoạn thành thục sẽ được cho lai với cá hoang dại. Các phôi cá nở sau 4 ngày được sử dụng tiến hành chạy PCR với cặp mồi Keap1a-seq-f1 (5’-TTTCAACAATGCCAACCTGG) và Keap1a-seq-r1 (5’- GCCTCTCCATTGAATCTGTGTT) và kiểm tra các dịng cá được knockout gen keap1a hay khơng. Kết quả hình 2 cho thấy, có 3 dịng kiểm tra knocout gen thành cơng. Dịng 1 (mẫu 2.6 có 9 bp deleted); dịng 2 (mẫu 2.10 9 bp deleted); và dòng 3 (mẫu 2.11 24 bp deleted + 21 bp insert = 3 bp deleted).
3.2 Giải trình tự cá knockout gen keap1b
Hình 3.3. Giải trình tự xác định cá ngựa vằn knocout gen keap1b ở thế hệ
F1. Kết quả có 02 dịng được knockout gen keap1a thành cơng. Dịng 1 (mẫu 3 có 4 bp deleted); dịng 2 (mẫu 7 15 bp deleted).
Hình 3.5. Kết quả sau khi giải trình tự
Qua kết quả cho thấy, cá ngựa vằn sau khi vi tiêm sgRNA-Keap1b/Cas9 ở giai đoạn 01 tế bào, được xác định hiệu quả vi tiêm knockout bằng phương pháp PCR với cặp mồi keap1b-hma-f1 (5’- GTGTGTATGATGTGTGCGTGTC) và keap1b-hma-r1 (5’-CTCCAGCGTGTAGCTGAAGAC), cho kết quả thành công tạo band hetetoduplex (hình 3) ở thế hệ F0 (4 ngày sau khi vi tiêm).
Các dịng cá F0 này được ni lớn sau 3-4 tháng đạt giai đoạn thành thục sẽ được cho lai với cá hoang dại. Các phôi cá nở sau 4 ngày được sử dụng tiến hành chạy PCR với cặp mồi Keap1b-seq-f1 (5’-
CCCCCTCAGGATTCGCGT) và Keap1b-seq-r1 (5’-
CGACGTGTGTGTCGAGCG) và kiểm tra các dịng cá được knockout gen keap1a hay khơng. Kết quả hình 4 cho thấy, có 2 dịng kiểm tra knocout gen thành cơng. Dịng 1 (mẫu 3 có 4 bp deleted); dịng 2 (mẫu 7 15 bp deleted).
Các dòng cá F1 này được nuôi lớn và cho sinh sản tạo ra cá F2. Các dịng cá F2 này đang được ni sàn lọc tạo các dịng ổn định phục vụ cho thí nghiệm
Tóm lại, chủ nhiệm đề tài đã tạo được các dòng cá knockout gen keap1a và keap1b theo như tiến độ đề tài.
Hình 3.6. Cá F1 được cho lai tạo dòng cá ổn định ở thế hệ hệ F2 knockout
Hình 3.7. Giàn cá chuyển gen Nrf2 của Trung tâm Cơng nghệ sinh
học Thành phố Hồ Chí Minh
Hình 3.9. Mơ tả tóm tắt phương pháp tạo dịng cá knockout gen ổn định đến thế hệ F2
bằng phương pháp CRISPR-Cas9
3.3 Kết luận
Đã tạo được 3 dòng cá knockout gen Nrf2 bằng CRISPR-Cas9 5. Kết luận và kiến nghị
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Bannikov A V., Lavrov A V. (2017) CRISPR/CAS9, the king of genome editing tools. Mol. Biol. 51:514–525
Benson AM, Hunkeler MJ, Talalay P (1980) Increase of NAD(P)H: quinone reductase by dietary antioxidants: Possible role in protection against carcinogenesis and toxicity. Proc Natl Acad Sci U S A 77:5216–5220. https://doi.org/10.1073/pnas.77.9.5216
Blackwell TK, Steinbaugh MJ, Hourihan JM, et al (2015) SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radic Biol Med 88.
https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2015.06.008
Blake DJ, Singh A, Kombairaju P, et al (2010) Deletion of Keap1 in the lung attenuates acute cigarette smoke-induced oxidative stress and inflammation. Am J Respir Cell Mol Biol 42:524–536. https://doi.org/10.1165/rcmb.2009-0054OC
Chan K, Lu R, Chang JC, Kan YW (1996) NRF2, a member of the NFE2 family of transcription factors, is not essential for murine erythropoiesis, growth, and development. Proc Natl Acad Sci U S A 93:13943–13948. https://doi.org/10.1073/pnas.93.24.13943 Chang N, Sun C, Gao L, et al (2013) Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in Zebrafish embryos. Cell Res 23:465–472. https://doi.org/10.1038/cr.2013.45
Cleasby A, Yon J, Day PJ, et al (2014) Structure of the BTB domain of Keap1 and its interaction with the triterpenoid antagonist CDDO. PLoS One 9.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0098896
Cong L, Ran FA, Cox D, et al (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science (80- ) 339:819–823. https://doi.org/10.1126/science.1231143
de Zeeuw D, Akizawa T, Audhya P, et al (2013) Bardoxolone Methyl in Type 2 Diabetes and Stage 4 Chronic Kidney Disease. N Engl J Med 369:2492–2503.
https://doi.org/10.1056/NEJMoa1306033
Debaun JR, Smith JYR, Miller EC, Miller JA (1970) Reactivity in vivo of the carcinogen N-hydroxy-2-acetylaminofluorene: Increase by sulfate ion. Science (80- ) 167:184–186. https://doi.org/10.1126/science.167.3915.184
Delmastro-Greenwood M, Freeman BA, Wendell SG (2014) Redox-Dependent Anti- Inflammatory Signaling Actions of Unsaturated Fatty Acids. Annu Rev Physiol 76:79– 105. https://doi.org/10.1146/annurev-physiol-021113-170341
Dinkova-Kostova AT, Fahey JW, Kostov R V., Kensler TW (2017) KEAP1 and done? Targeting the NRF2 pathway with sulforaphane. Trends Food Sci Technol.
https://doi.org/10.1016/j.tifs.2017.02.002
Eggler AL, Small E, Hannink M, Mesecar AD (2009) Cul3-mediated Nrf2 ubiquitination and antioxidant response element (ARE) activation are dependent on the partial molar volume at position 151 of Keap1. Biochem J 422:171–80.
https://doi.org/10.1042/BJ20090471
Egner PA, Chen JG, Zarth AT, et al (2014) Rapid and sustainable detoxication of airborne pollutants by broccoli sprout beverage: Results of a randomized clinical trial in China. Cancer Prev Res 7:813–823. https://doi.org/10.1158/1940-6207.CAPR-14-0103
Endo Y, Muraki K, Fuse Y, Kobayashi M (2020) Evaluation of antioxidant activity of spice-derived phytochemicals using zebrafish. Int J Mol Sci 21.
https://doi.org/10.3390/ijms21031109
Fourquet S, Guerois R, Biard D, Toledano MB (2010) Activation of NRF2 by Nitrosative Agents and H 2 O 2 Involves KEAP1 Disulfide Formation. J Biol Chem 285:8463–8471. https://doi.org/10.1074/jbc.M109.051714
Harper C, Lawrence C (2011) The laboratory zebrafish
Howe K, Clark MD, Torroja CF, et al (2013) The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature 496:.
https://doi.org/10.1038/nature12111
Hruscha A, Krawitz P, Rechenberg A, et al (2013) Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Dev 140:4982–4987.
https://doi.org/10.1242/dev.099085
Huerta C, Jiang X, Trevino I, et al (2016) Characterization of novel small-molecule NRF2 activators: Structural and biochemical validation of stereospecific KEAP1 binding. Biochim Biophys Acta - Gen Subj 1860. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2016.07.026 Hwang WY, Fu Y, Reyon D, et al (2013) Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol 31:227–229. https://doi.org/10.1038/nbt.2501 Itoh K, Chiba T, Takahashi S, et al (1997) An Nrf2/Small Maf Heterodimer Mediates the Induction of Phase II Detoxifying Enzyme Genes through Antioxidant Response
Elements. Biochem Biophys Res Commun 236:313–322. https://doi.org/10.1006/bbrc.1997.6943
Itoh K, Igarashi K, Hayashi N, et al (1995) Cloning and Characterization of a Novel Erythroid Cell-Derived CNC Family Transcription Factor Heterodimerizing with the Small Maf Family Proteins
Itoh K, Ishii T, Wakabayashi N, Yamamoto M (1999) Regulatory mechanisms of cellular response to oxidative stress. Free Radic Res 31:319–324.
https://doi.org/10.1080/10715769900300881
Jao LE, Wente SR, Chen W (2013) Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing