2 .1Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Hình 2.20 Bỏ vào máy tác dụng nhiệt
Hình 2.21. Máy giải trình tự gen 3500XL - hãng Applied Biosystems của Trung tâm
CHƯƠNG 3KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Vi tiêm tạo cá knockout gen
sgRNA Nrf2 cùng với Cas9 protein được vi tiêm vào giai đoạn phôi 1 tế bào cá ngựa vằn. Hiệu quả vi tiêm sẽ được kiểm tra sau những ngày này.
Hình 3.1. Điện di kiểm tra hiệu quả sau khi vi tiêm sgRNA Nrf2 vào phôi cá ngựa vằn
Hình 3.2. Kết quả chạy PCR xác định cá ngựa vằn knockout gen Nrf2 ở thế hệ F1 (được
lai từ cá F0 và cá hoang dại). Kết quả có 03 dịng (Cá 2; 4 và cá 5) được knockout gen Nrf2 thành công được tạo ra.
Qua kết quả cho thấy, cá ngựa vằn sau khi vi tiêm sgRNA-Keap1a/Cas9 ở giai đoạn 01 tế bào, được xác định hiệu quả vi tiêm knockout bằng phương pháp PCR với cặp mồi keap1a-hma-f1 (5’-TTGTGCCTGTATTTCTTCATGG) và keap1a-hma-r1 (5’- GCCTCTCCATTGAATCTGTGTT), cho kết quả thành cơng tạo band hetetoduplex (hình 1) ở thế hệ F0 (4 ngày sau khi vi tiêm).
Các dịng cá F0 này được ni lớn sau 3-4 tháng đạt giai đoạn thành thục sẽ được cho lai với cá hoang dại. Các phôi cá nở sau 4 ngày được sử dụng tiến hành chạy PCR với cặp mồi Keap1a-seq-f1 (5’-TTTCAACAATGCCAACCTGG) và Keap1a-seq-r1 (5’- GCCTCTCCATTGAATCTGTGTT) và kiểm tra các dòng cá được knockout gen keap1a hay khơng. Kết quả hình 2 cho thấy, có 3 dịng kiểm tra knocout gen thành cơng. Dịng 1 (mẫu 2.6 có 9 bp deleted); dịng 2 (mẫu 2.10 9 bp deleted); và dòng 3 (mẫu 2.11 24 bp deleted + 21 bp insert = 3 bp deleted).
3.2 Giải trình tự cá knockout gen keap1b
Hình 3.3. Giải trình tự xác định cá ngựa vằn knocout gen keap1b ở thế hệ
F1. Kết quả có 02 dịng được knockout gen keap1a thành cơng. Dịng 1 (mẫu 3 có 4 bp deleted); dịng 2 (mẫu 7 15 bp deleted).