Tiªu chuÈn ch¨n nu«i Công ty luật Minh Khuê www luatminhkhue vn TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 6261 1997 SỮA ĐỊNH LƯỢNG ĐƠN VỊ HÌNH THÀNH KHUẨN LẠC TỪ CÁC VI SINH VẬT ƯA LẠNH KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Ở 6,5OC[.]
Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 6261 : 1997 SỮA - ĐỊNH LƯỢNG ĐƠN VỊ HÌNH THÀNH KHUẨN LẠC TỪ CÁC VI SINH VẬT ƯA LẠNH - KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Ở 6,5OC Milk - Enumeration of colony-forming units of psychrotrophic micro-organisms - Colony-count technique at 6,5oC TCVN 6261 : 1997 hoàn toàn tương đương với ISO 6730 : 1992 (E); TCVN 6261 : 1997 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F12 Sữa sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn - Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học, Công nghệ Môi trường ban hành Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp định lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) từ vi sinh vật ưa lạnh sữa nguyên liệu sữa xử lý nhiệt kỹ thuật đếm khuẩn lạc 6,5 oC Tiêu chuẩn trích dẫn lSO 7218 : 1985 Vi Sinh vật học - Hướng dẫn chung kiểm tra vi sinh vật TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989) Sữa sản phẩm sữa - Chuẩn bị mẫu thử dung dịch pha loãng để kiểm tra vi sinh ISO 707 : 1985 Sữa sản phẩm sữa - Các phương pháp lấy mẫu TCVN 4550 : 1988 (ISO 5725) Độ xác phương pháp thử nghiệm - Xác định độ lặp lại độ tái lập cho phương pháp thử chuẩn phương pháp thử liên phịng thí nghiệm Định nghĩa Áp dụng định nghĩa sau tiêu chuẩn này: 3.1 Vi sinh vật ưa lạnh - Các vi khuẩn, nấm men nấm mốc điều kiện qui định tiêu chuẩn tạo thành khuẩn lạc đếm Nguyên tắc 4.1 Chuẩn bị đĩa nuôi cấy, sử dụng môi trường nuôi cấy lượng mẫu thử xác định Chuẩn bị đĩa khác điều kiện, với dung dịch pha loãng thập phân từ mẫu thử 4.2 Nuôi ấm đĩa 10 ngày, mơi trường có khơng khí 6,5 oC 4.3 Tính số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc từ vi sinh vật (CFU) mililít mẫu thử từ số khuẩn lạc thu đĩa chọn mức pha lỗng để có kết thoả đáng Dịch pha lỗng mơi trường nuôi cấy 5.1 Khái quát Hướng dẫn chung, xem ISO 7218 5.2 Nguyên liệu Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989) 5.3 Chất pha loãng để dùng cho mục đích chung Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989) 5.4 Phân phối, khử trùng bảo quản Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989) 5.5 Môi trường nuôi cấy 5.5.1 Thành phần LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Tripton 5,0 g Cao men 2,5 g Glucoza ngậm phân tử nước (C6H12O6.H2O) Sữa bột gầy 1) 1,0 g 1,0 g Thạch 10 g đến 15 g2) Nước 1000ml 1) Sữa bột gầy không chứa chất ức chế Điều phải kiểm tra thử so sánh dùng sữa bột gầy biết trước không chứa chất 2) Tuỳ theo độ đông thạch 5.5.2 Chuẩn bị 5.5.2.1 Chuẩn bị từ mơi trường hồn chỉnh khơ thương phẩm Tiến hành theo hướng dẫn nhà sản xuất, trường hợp, phải cho thêm sữa bột gầy nhà sản xuất coi việc thêm không cần thiết Nếu cần, chỉnh pH để sau khử trùng, pH 7,0 25oC 5.5.2.2 Pha chế từ thành phần khơ Hịa tan phân tán nước theo trình tự sau: cao men, tripton, glucôza cuối sữa bột gầy Chú thích - Nước hâm nóng giúp cho việc hòa tan tốt Cho thêm thạch đun sơi, khuấy thạch tan hồn tồn, đun nóng nồi nước khoảng 30 phút Chú thích - Nếu dung dịch khơng lọc qua giấy lọc Nếu cần, chỉnh pH, cho sau thử trùng pH 7,0, 25oC 5.5.2.3 Phân phối, khử trùng bảo quản Phân phối môi trường vào ống nghiệm (6.9) với lượng từ 12 ml đến 15 ml ống, vào bình cầu chai (6.9) với lượng từ 100 ml đến 150 ml Khử trùng nồi hấp (6.1) 121oC ± 1oC 15 phút Nếu mơi trường dùng làm nguội đến 45oC nồi cách thủy (6.5) Nếu không dùng ngay, trước bắt đầu tiến hành thử nghiệm vi sinh, để tránh chậm trễ rót mơi trường, làm tan chảy hồn tồn mơi trường nồi cách thủy nóng (6.6) sau làm nguội đến 45oC nồi cách thủy (6.5) (Xem 8.4.4) Bảo quản môi trường chuẩn bị chỗ tối với nhiệt độ từ oC đến +5oC khơng q ba tháng Chú thích - Để kiểm tra nhiệt độ thạch, đặt nhiệt kế vào lượng dung dịch 15 g/l thạch đựng bình riêng biệt giống hệt loại bình để đựng mơi trường Dung dịch kiểm tra nhiệt độ phải tiến hành thao tác tương tự đun nóng làm nguội, giống môi trường nuôi cấy Thiết bị Chú ý - Phải khử trùng tất dụng cụ tiếp xúc với mẫu thử, với chất pha loãng, với dung dịch với môi trường nuôi cấy phù hợp với TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989), (6.1 ) Chú thích - Có thể dùng dụng cụ sử dụng lần để thay cho dụng cụ thuỷ tinh sử dụng nhiều lần, phù nợp với yêu cầu qui định Sử dụng thiết bị thơng thường phịng thí nghiệm vi sinh, thiết bị cần thiết để xử lý mẫu thử dung dịch pha loãng theo qui định TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 :1989) đặc biệt là: 6.1 Thiết bị để khử trùng khô (lò sấy) khử trùng ướt (nồi hấp áp lực), xem ISO 7218 6.2 Tủ ấm, có khả hoạt động 6,5oC ± 0,5oC 6.3 Đĩa Petri thủy tinh chất dẻo, đường kính từ 90 mm đến 100 mm 6.4 Pipét chia độ, nhét đầu, hiệu chỉnh dung tích ml ± 0,02 ml, 10 ml ± 0,2 ml, 11 ml ± 0,2 ml LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn 6.5 Nồi cách thủy, có khả hoạt động 45 oC ± 1oC 6.6 Nồi cách thủy, có khả hoạt động từ 100 oC trở lên 6.7 Thiết bị đếm khuẩn lạc, bao gồm phận chiếu sáng có đen, gắn với kính lúp có độ khuếch đại 1,5 lần có dụng cụ đếm điện tử 6.8 pH mét bù nhiệt, có độ xác tới ± 0,1 đơn vị pH 25 oC 6.9 Ống nghiệm có dung tích khoảng 20 ml (hoặc bình chai có dung tích thích hợp) bình cầu chai có dung tích từ 150 ml đến 250 ml dùng để khử trùng bảo quản mơi trường ni cấy Chú thích - Có thể dùng chai bình cầu có nắp xốy kim loại khơng độc Lấy mẫu Lấy mẫu theo ISO 707 Cách tiến hành Chú thích - Để tăng độ xác phương pháp, việc chuẩn bị dung dịch pha loãng phải chuẩn hóa cẩn thận Những yếu tố tác động đến độ xác là: - Kiểu loại thiết bị khuấy trộn; - Thời gian khuấy trộn; - Dịch pha loãng; - Thời gian hạt to lắng xuống; - Thời gian khuấy cho phép chuẩn bị dung dịch loãng theo hệ thập phân Chú ý - Phải thực thao tác vô trùng thông thường Những thao tác quy định 8.1 8.2 không tiến hành ánh nắng mặt trời 8.1 Chuẩn bị mẫu thử dung dịch pha loãng ban đầu Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO : 1989), 8.1.1 8.2 Dung dịch pha loãng theo hệ thập phân Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989), 8.2 Chú thích 7- Có thể dùng loạt dung dịch pha lỗng khác, thí dụ: dung dịch pha lỗng ban đầu 10 ml mẫu thử 90 ml chất pha loãng, 11 ml mẫu thử 99 ml chất pha lỗng Độ tập trung tính xác phương pháp lớn sử dụng lượng mẫu thử chất pha loãng lớn 8.3 Thời gian,tiến hành Xem TCVN 6263 : 1997 (ISO 8261 : 1989), 8.3 8.4 Cấy nuôi ấm 8.4.1 Lấy hai đĩa Petri (6.3) vô trùng Dùng pipét vô trùng (6.4) cho vào đĩa ml mẫu thử 8.4.2 Lấy tiếp hai đĩa Petri vô trùng Dùng pipét vô trùng khác cho vào đĩa ml dung dịch mẫu thử pha loãng 10-1 8.4.3 Nếu cần, lặp lại thao tác này, sử dụng dung dịch pha loãng thập phân 8.4.4 Kiểm tra nhiệt độ môi trường nuôi cấy (5.5) không vượt 46 oC Chú thích - Nếu nhiệt độ mơi trường ni cấy lớn 46 oC làm hư hại giết chết vi sinh vật ưa lạnh mẫu thử Nếu cảm thấy có hư hại phải kéo dài việc để đĩa nuôi tủ ấm nhiệt độ thấp Rót vào đĩa Petri khoảng 12 ml đến 15 ml mơi trường ni cấy (5.5) Chú thích - Nếu dùng 15 ml mà không thu phân bố vi sinh vật nên dùng 20 ml 8.4.5 Khuấy trộn thật kỹ chất cấy với môi trường cách xoay đĩa Petri hỗn hợp đông đặt đĩa Petri mặt phẳng nằm ngang, mát 8.4.6 Thời gian từ chuẩn bị dung dịch pha loãng thứ đến trộn chất nuôi cấy với môi trường không vượt 15 phút LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn 8.4.7 Chuẩn bị đủ số đối chứng để kiểm tra độ vô trùng 8.4.8 Lật ngược đĩa cấy xong đặt chúng vào tủ ấm (6.2) nhiệt độ 6,5 oC 10 ngày Chú thích 10 - Để tránh lan rộng, cần phải đề phịng sau: - Phủ thêm lớp mơi trường nuôi cấy lên mặt đĩa cấy sau đông cứng, - Nhỏ thêm giọt glixerol lên giấy lọc nắp đĩa 8.4.9 Không chồng đĩa lên Để chồng đĩa tách xa hẳn xa thành tủ ấm 8.5 Đọc kết 8.5.1 Đếm số khuẩn lạc đĩa (xem 9.1), sử dụng thiết bị đếm khuẩn lạc (6.7) Kiểm tra đĩa ánh sáng dịu Điều quan trọng chấm khuẩn lạc nhỏ phải đếm điều người kỹ thuật viên phải tránh lẫn lộn hạt nhỏ không tan chất kết tủa đĩa với khuẩn lạc nhỏ Kiểm tra thật cẩn thận đốm cịn nghi ngờ, dùng kính lúp có độ khuếch đại cao thấy cần, để phân biệt khuẩn lạc với chất lạ 8.5.2 Những khuẩn lạc mọc lan xem khuẩn lạc đơn lẻ Nếu khuẩn lạc mọc lan 1/4 bề mặt đĩa đếm khuẩn lạc phần cịn lại đĩa tính số lượng tương ứng cho toàn đĩa Nếu lan rộng 1/4 bề mặt đĩa loại bỏ đĩa Biểu thị kết 9.1 Chỉ giữ lại đĩa có 10 khuẩn lạc, nhiều 300 khuẩn lạc Tính số CFU từ vi sinh vật, N, mililít sữa theo cơng thức: N= Σc tổng số khuẩn lạc đếm tất đĩa giữ lại; n1 số đĩa độ pha lỗng thứ có chứa từ 10 đến 300 khuẩn lạc; n2 số đĩa độ pha lỗng thứ hai có chứa từ 10 đến 300 khuẩn lạc; d hệ số pha loãng tương ứng với độ pha lỗng thứ Chú thích 11 – Nếu có nhiều hai độ pha lỗng đếm cho kết từ 10 đến 300 khuẩn lạc cơng thức phải sửa đổi, có tính đến độ pha lỗng Với ba độ pha lỗng theo cơng thức: N= Trong n3 số đĩa độ pha loãng thứ ba giữ lại, có chứa từ 10 đến 300 khuẩn lạc Làm tròn số kết thu đến chữ số có nghĩa Khi số cần làm trịn mà khơng có chữ số có nghĩa đứng theo sau làm trịn số đứng trước chữ số cho thành số chẵn Thí dụ: 28.500 làm trịn thành 28.000 11.500 làm tròn thành 12.000 Lấy kết số đơn vị hình thành khuẩn lạc từ vi sinh vật ưa lạnh CFU mililit sữa, biểu thị theo số từ 1,0 đến 9,9 nhân với 10x, x lũy thừa tương ứng 10 Thí dụ: Việc đếm khuẩn lạc vi sinh vật cho kết sau (hai đĩa Petri cho độ pha lỗng ni ủ): - Độ pha loãng thứ (10-2) giữ lại chứa 168 215 khuẩn lạc - Độ pha loãng thứ hai (10-3) giữ lại chứa 14 25 khuẩn lạc N= - Làm tròn kết hướng dẫn thu 19 000 1,9 x 10 CFU vi sinh vật ưa lạnh mililít sữa LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn 9.2 Nếu có hai đĩa tương ứng với mẫu thử chứa 10 khuẩn lạc báo cáo kết " 10 x 1/d CFU vi sinh vật ưa lạnh mililít sữa”, d hệ số pha lỗng độ pha loãng thấp 9.3 Nếu tất đĩa chứa nhiều 300 khuẩn lạc tính số lượng ước tính từ đĩa có số khuẩn lạc gần 300 nhân số với số nghịch đảo độ pha loãng cao Báo cáo kết theo “số lượng đơn vị khuẩn lạc vi sinh vật ưa lạnh ước tính mililít sữa” 10 Độ lặp lại Độ chênh lệch tuyệt đối kết thu từ hai lần thử nghiệm riêng rẽ, sử dụng phương pháp, phân tích nguyên liệu, người tiến hành phịng thí nghiệm, dùng thiết bị, khoảng thời gian ngắn, không vượt 30% kết thấp Chú thích 12) Nếu trường hợp không thỏa mãn yêu cầu độ lặp lại 5% lớn cần xem xét nguồn gốc có khả gây sai lỗi 13) Định nghĩa độ lặp lại, xem TCVN 4550:1988 (ISO 5725) 11 Báo cáo kết Báo cáo kết phải phương pháp sử dụng kết thử nghiệm thu được, rõ phương pháp biểu thị Cũng phải đề cập đến tất chi tiết thao tác không qui định tiêu chuẩn này, tuỳ ý lựa chọn, với chi tiết bất thường khác ảnh hưởng tới kết Báo cáo kết bao gồm tất thông tin cần thiết việc nhận biết đầy đủ mẫu thử LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162