BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN XXX: BỆNH DO RED SEA BREAM IRIDOVIRAL GÂY RA Ở CÁ BIỂN (RSIV)

TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710 XXX: 2022 BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN XXX: BỆNH DO RED SEA BREAM IRIDOVIRAL GÂY RA Ở CÁ BIỂN (RSIV) (Aquatic Animal Disease - Diagnostic procedure Part xxx : Red Sea Bream Iridoviral Disease) HÀ NỘI – 2022 TCVN 8710 XXX: 2022 TCVN 8710 XXX: 2022 Lời nói đầu TCVN 8710 XXX: 2022 xây dựng sở tham khảo OIE, 2019, Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animal, Chapter 2.3.8 Red Seabream Iridoviral Disease TCVN 8710 XXX: 2022 Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Bộ TCVN 8710 Bệnh thủy sản- Quy trình chẩn đốn gồm phần sau:  TCVN 8710-01: 2011, phần 1: Bệnh Còi vi rút tôm (MBV);  TCVN 8710-02: 2019, phần 2: Bệnh Hoại tử thần kinh cá biển (VNN);  TCVN 8710-03: 2019, phần 3: Bệnh Đốm trắng tôm (WSSV);  TCVN 8710-04: 2019, phần 4: Bệnh Đầu vàng tôm (YHV);  TCVN 8710-05: 2011, phần 5: Bệnh Taura tôm He (TSV);  TCVN 8710-06: 2019, phần 6: Bệnh Koi herpesvirus cá chép (KHV);  TCVN 8710-07: 2019, phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân cá chép (SVC);  TCVN 8710-08: 2012, phần 8: Bệnh hoại tử tôm (IMNV);  TCVN 8710-09: 2012, phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy tôm (NHB);  TCVN 8710-10: 2015, phần 10: Bệnh perkinsus marinus nhuyễn thể hai mảnh vỏ;  TCVN 8710-11: 2015, phần 11: Bệnh perkinsus olseni nhuyễn thể hai mảnh vỏ;  TCVN 8710-12: 2019, phần 12: Bệnh vi bào tử Enterocytozoon hepatopenaei tôm;  TCVN 8710-13: 2015, phần 13: Bệnh gan tụy Parvovirus tôm;  TCVN 8710-14: 2015, phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) cá;  TCVN 8710-15: 2015, phần 15: Bệnh nhiễm trùng Aeromonas hydrophila cá;  TCVN 8710-16:2016, phần 16: Bệnh gan thận mủ cá da trơn;  TCVN 8710-17:2016, phần 17: Bệnh sữa tôm hùm;  TCVN 8710-19: 2019, phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm;  TCVN 8710-20: 2019, phần 20: Bệnh hoại tử vỏ quan tạo máu tôm;  TCVN 8710-21: 2019, phần 21: Bệnh vi khuẩn Streptococcus agalactiae cá  TCVN 8710-22: 2021, phần 22: Bệnh sán 16 móc cá; TCVN 8710 XXX: 2022  TCVN 8710-23: 2022, phần 23: Bệnh hoại tử quan tạo máu IHNV cá hồi;  TCVN 8710-24: 2022, phần 24: Bệnh sán dollfustrema sp cá da trơn;  TCVN 8710-25: 2022, phần 25: Bệnh ký sinh trùng bonamia ostreae bonamia exitiosa hàu TCVN 8710 XXX: 2022 TCVN 8710 XXX: 2022 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710 XXX:2022 Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần XXX: BỆNH DO RED SEA BREAM IRIDOVIRAL GÂY RA Ở CÁ BIỂN (RSIV) Aquatic animal diseases – Diagnostic procedure – Part xxx: Red Sea Bream Iridoviral Disease CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn liên quan đến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn đưa hết tất cả vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập thao tác an tồn sức khỏe thích hợp xác định khả áp dụng giới hạn quy định trước sử dụng tiêu chuẩn Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định quy trình chẩn đoán bệnh Red Sea Bream Iridoviral gây cá biển (RSIV) Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau: 2.1 Bệnh Red Sea Bream Iridoviral gây cá biển Là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm vi rút nhiều loài cá biển 2.2 Red Sea Bream Iridovirus Là vi rút thuộc giống Megalocytivirus họ Iridoviridae; có dạng hình cầu 20 mặt, đường kính nhân 140-160nm, vỏ bao quanh đường kính 220-240nm Bộ gen RSIV DNA mạch kép thẳng có kích thước ~ 112 kbp với hàm lượng G + C từ 53-55% 2.3 Các từ viết tắt - ADN (Deoxyribonucleic acid): Axit deoxyribonucleic; - PBS (Phosphate buffered saline): Dung dịch muối đệm phốt phát; - RT - PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction): Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược; TCVN 8710 XXX: 2022 - TAE (Tris-brorate – EDTA): dung dịch đệm TAE; - TBE (Tris-acetate – EDTA): dung dịch đệm TBE Thuốc thử vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khống nước có độ tinh khiết tương đương, trừ trường hợp có quy định khác 3.1 Thuốc thử vật liệu thử dùng chung 3.1.1 Ethanol, từ 70 % đến 100 % (thể tích) 3.1.2 Dung dịch muối đệm phosphate (PBS) 3.2 Thuốc thử vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) Realtime PCR 3.2.1 Cặp mồi (primes), gồm mồi xuôi mồi ngược PCR 3.2.2 Cặp mồi (primes), gồm mồi xi mồi ngược, Dị (Probe) Realtime PCR 3.2.3 Kít tách chiết ADN (acid deoxyribo nucleic) 3.2.4 Kít nhân gen PCR 3.2.5 Kít nhân gen Realtime PCR 3.2.6 Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiaphúttetraaxetic) 3.2.7 Thang chuẩn DNA (Ladder/ Marker) 3.2.8 Nước tinh khiết, khơng có nuclease 3.2.9 Thạch agarose 3.2.10 Dung dịch đệm TAE (Tris – acetate – EDTA) TBE (Tris – brorate – EDTA) (xem A.1) 3.2.11 Chất nhuộm màu, Ví dụ: Sybr safe 3.2.12 Chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X) Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ thơng thường phịng thử nghiệm sinh học thiết bị, dụng cụ sau 4.1 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp chẩn đoán PCR, Realtime PCR TCVN 8710 XXX: 2022 4.1.1 Máy nhân gen PCR 4.1.2 Máy nhân gen Realtime PCR 4.1.3 Máy tách chiết ADN/ARN 4.1.4 Máy ly tâm, ly tâm với gia tốc 000 g 20 000 g 4.1.5 Máy lắc trộn vortex 4.1.6 Máy spindown 4.1.7 Bộ điện di, gồm nguồn bể chạy điện di 4.1.8 Máy đọc sản phẩm PCR Chẩn đoán lâm sàng 5.1 Đặc điểm dịch tễ - Loài bị cảm nhiễm: Cá tráp đỏ (Pagrus major), Cá tráp đen (Acanthopagrus schlegeli), cá tráp vây vàng (Acanthopagrus latus), cá cam nhật (Seriola quinqueradiata), cá cam sọc (Seriola lalandi), cá háo sọc (Pseudocaranx dentex),Cá ngừ vây xanh Đại tây dương (Thunnus thynnus), cá thu nhật (Scomberomorus niphonius), Cá sòng Nhật (Trachurus japonicus), Cá vẹt nhật (Oplegnathus fasciatus), Cá trác đá (Oplegnathus punctatus), Cá kẽm lang (Parapristipoma trilineatum), Cá đỏ lớn (Pseudosciaena crocea), Cá rô mo trung quốc (Siniperca chuatsi), cá đù đỏ (Sciaenops ocellatus) … - Tỷ lệ chết tùy thuộc vào lồi cá nhiễm bệnh, kích thước, tuổi cá, nhiệt độ mà khác (từ 0% đến 100%) Giai đoạn cá giống dễ bị cảm nhiễm giai đoạn trưởng thành - Dịch bùng phát chủ yếu vào mùa hè nhiệt độ nước thích hợp từ 250 C trở lên - Phương thức truyền lây RSIV truyền ngang 5.2 Triệu chứng lâm sàng Cá bị nhiễm vi rút có biểu lờ đờ, thể chuyển màu đen, đặc biệt phần cuối thân vây đuôi Cá bệnh nặng lên tầng mặt sau từ từ chìm xuống đáy chết, nên gọi bệnh “cá ngủ” 5.3 Dấu hiệu bệnh tích Mang nhợt nhạt, xuất huyết, lách sưng to Chẩn đốn phịng thí nghiệm 6.1 Phương pháp PCR TCVN 8710 XXX: 2022 6.1.1 Lấy mẫu - Cá có kích thước < cm: Lấy nguyên từ 10 đến 15 - Cá có kích thước từ đến cm: Lấy nguyên từ đến 10 lấy gan, lách, thận, tim, ruột, mang từ đến 10 - Cá có kích thước > cm: Lấy nguyên từ đến lấy gan, lách, thận, tim, ruột, mang từ đến - Mẫu bệnh phẩm phải lấy vô trùng để riêng biệt dụng cụ đựng mẫu 6.1.2 Bảo quản mẫu - Bảo quản vận chuyển: Bảo quản mẫu nhiệt độ từ oC đến oC khơng q 48h vận chuyển phịng thí nghiệm bảo quản cồn 90% với tỉ lệ 1:10 (1 phần mẫu:10 phần cồn) - Bảo quản phòng thí nghiệm: Mẫu được bảo quản nhiệt độ từ oC đến oC chuyển đến phịng thí nghiệm chưa phân tích phải bảo quản nhiệt độ âm 20 oC đến âm 80 oC bảo quản dung dịch Phosphate Buffered Saline (PBS) theo tỉ lệ mẫu: PBS (1:10) nhiệt độ âm 20 oC đến âm 80 oC bảo quản etanol từ 96 % đến 100 % 6.1.3 Chuẩn bị mẫu Dùng pank, kéo vô trùng để thực thao tác: tách, cắt lấy mẫu Mẫu chia thành hai phần: phần cho thực xét nghiệm phần lưu trữ Lượng mẫu lấy để tách chiết ADN khoảng 30 mg Cho 30 mg mẫu (gan, thận lách) vào dung dịch PBS (3.1.2) với tỷ lệ 9:1 (1 thể tích mẫu thể tích PBS), nghiền mẫu để tạo thành huyễn dịch 10 % Chuyển huyễn dịch vào ống vơ trùng đóng nắp để vào tủ âm sâu (- 80 oC) thời gian tối thiểu h trước tiến hành chiết tách ADN Một ống mẫu để xét nghiệm ống lưu mẫu 6.1.4 Cách tiến hành 6.1.4.1 Tách chiết ADN Sử dụng kít tách chiết (3.2.3) thích hợp an tồn theo hướng dẫn nhà sản xuất VÍ DỤ: Sử dụng kit tách chiết ADN Qiagen: DNeasy® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No 69506)1) (xem phụ lục B1) 1,2) Thông tin đưa tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định sử dụng sản phẩm nhà cung cấp Có thể sử dụng sản phẩm tương tự cho kết tương đương TCVN 8710 XXX: 2022 Hoặc sử dụng kit tách chiết TACO RNA/DNA extraction Kit (GeneReach Cat No atc-d/rna, 320 tests)2) (xem phụ lục B2) 6.1.4.2 Chuẩn bị mồi Phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu - F - R (3.2.1) để phát vi rút RSIV Trình tự cặp mồi (xem phụ lục C, Bảng C1) Mồi chuẩn bị sau: – Mồi trạng thái đông khô phải ly tâm nhanh máy spindown (4.1.5) 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước mở hoàn nguyên Dùng dung dịch đệm TE (3.2.4) để hoàn nguyên mồi nồng độ 100 µM làm gốc – Mồi sử dụng nồng độ 20 µM: Pha lỗng mồi gốc nước tinh khiết khơng có nuclease (3.2.6) (20 µl mồi gốc 80 µl nước tinh khiết khơng có nuclease) 6.1.4.3 Tiến hành phản ứng PCR Phản ứng khuếch đại thực máy nhân gen (4.1.1) theo phương pháp PCR sử dụng cặp mồi - F - R, sử dụng kit nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn nhà sản xuất 6.1.4.4 Điện di 6.1.4.4.1 Chuẩn bị bản thạch Pha thạch với nồng độ agarose (3.2.9) từ 1,5 % đến % dung dịch đệm TBE 1X TAE 1X (3.2.8) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc đun sôi; Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 oC đến 50 oC bổ sung 10 µl chất nhuộm màu (3.2.9) vào 100 ml thạch Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan Tiến hành đổ thạch vào khay điện di cài lược; không nên đổ thạch dày q 0,8 cm Khi thạch đơng lại tiến hành gỡ lược khỏi thạch Chuyển thạch vào bể điện di (4.1.7), đổ dung dịch đệm (TBE 1X TAE 1X) loại với dung dịch pha agarose đun vào bể điện di ngập thạch CHÚ THÍCH: Có thể dùng sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (VÍ DỤ: Sybr safe DNA gel stain sử dụng theo quy định nhà sản xuất) 6.1.4.4.2 Chạy điện di Hút µl chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X) (3.2.12) vào µl sản phẩm PCR trộn cho vào giếng thạch Thực điện di điện di, chạy kèm theo thang chuẩn ADN (3.2.7) để dự 10 TCVN 8710 XXX: 2022 đốn kích thước sản phẩm khuếch đại Hút 10 μl thang chuẩn ADN (3.2.7) vào giếng thạch Điện di hiệu điện 100 V thời gian 30 phút 6.1.4.5 Đọc kết quả Sau điện di, đọc kết máy đọc sản phẩm PCR (4.1.8) Điều kiện phản ứng công nhận khi: - Đối chứng âm có kết âm tính (khơng có sản phẩm khuếch đại); - Đối chứng dương có kết dương tính thể vệt sáng rõ có kích thước 570 bp Với điều kiện phản ứng Mẫu xét nghiệm âm tính khi: - Tại giếng mẫu thử không xuất vạch sáng 570 bp (khơng có sản phẩm khuếch đại); - Thang chuẩn ADN sáng chia vạch rõ ràng Mẫu xét nghiệm dương tính khi: - Tại giếng mẫu thử có sản phẩm khuếch đại có kích thước 570 bp - Thang chuẩn ADN sáng chia vạch rõ ràng 6.2 Phương pháp Realtime PCR 6.2.1 Lấy mẫu (Theo 6.1.1) 6.2.2 Bảo quản mẫu (Theo 6.1.2) 6.2.3 Chuẩn bị mẫu (Theo 6.1.3) 6.2.4 Cách tiến hành 6.2.4.1 Tách chiết ADN (Theo 6.1.3.1) 6.2.4.2 Chuẩn bị mồi Phản ứng khuếch đại thực theo phương pháp Realtime PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu vi rút RSIV sử dụng cặp mồi RSIV RT F / RSIV RT R RSIV Probe (3.2.2) (xem phụ lục D, bảng D1) 11 TCVN 8710 XXX: 2022 Mồi chuẩn bị sau: – Mồi trạng thái đông khô phải ly tâm nhanh máy spindown (4.2.6) 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước mở hoàn nguyên Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.6) để hồn ngun mồi nồng độ 100 µM làm gốc – Mồi sử dụng nồng độ 20 µM: pha lỗng mồi gốc nước tinh khiết khơng có nuclease (3.2.8) (20 µl mồi gốc 80 µl nước tinh khiết khơng có nuclease) - Đoạn dị RSIV Probe sử dụng nồng độ 10 µM: pha lỗng đoạn dị nước tinh khiết khơng có nuclease (3.2.8) (10 µl mồi gốc 90 µl nước tinh khiết khơng có nuclease) 6.2.4.3 Tiến hành phản ứng Realtime PCR Kỹ thuật Realtime PCR sử dụng cặp mồi RSIV RT F / RSIV RT R chuẩn bị (6.2.3.2) sử dụng kít nhân gen (3.2.5) theo hướng dẫn nhà sản xuất (Xem phụ lục D) VÍ DỤ: Kit nhân gen Quantitect probe PCR Kit (200): Catalogue Number: 2043435 6.2.4.4 Đọc kết quả Kết phản ứng Realtime PCR xác định đựa vào chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold: Ct) – Mẫu đối chứng âm phải cho kết âm tính – Mẫu đối chứng dương (có giá trị Ct biết trước) phải cho kết dương tính có giá trị Ct ±2 Ct biết trước Giải thích kết phản ứng Realtime PCR phát vi rút RSIV – Mẫu có giá trị Ct < 35 xem dương tính – Mẫu khơng có giá trị Ct âm tính – Mẫu có giá trị Ct khoảng 35 ≤ Ct ≤ 40 xem nghi ngờ CHÚ Ý: - Những mẫu nghi ngờ, cần thực lại xét nghiệm sử dụng phương pháp xét nghiệm tương đương khác để khẳng định kết - Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu kiểm chứng dương mẫu kiểm chứng âm; - Mẫu nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt khay đá lạnh suốt trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng Thông tin đưa tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định sử dụng sản phẩm Có thể sử dụng sản phẩm tương tự cho kết tương đương 5 12 TCVN 8710 XXX: 2022 Kết luận Cá xác định nhiễm RSIV có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng đặc trưng bệnh và: - Có kết dương tính phương pháp PCR - Có kết dương tính phương pháp Realtime PCR 13 TCVN 8710 XXX: 2022 Phụ lục A (Quy định) Thành phần chuẩn bị thuốc thử A.1 Dung dịch đệm TAE TBE A.1.1 Thành phần Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X: 100 ml Nước khử ion: 900 ml Tổng: 1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1X A.1.2 Chuẩn bị Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X hoà chung với 900 ml nước khử ion, khuấy lắc Bảo quản nhiệt độ phòng A.2 Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) A.2.1 Thành phần Natri clorua (NaCl) 8g Natri hydro photphat dihydrat (Na2HPO4.2H2O) 2,9 g Kali dihydro photphat (KH2PO4) 0,2 g Kali clorua (KCl) 0,2 g Nước cất 1000 ml A.2.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần vào 1000 ml nước cất, khuấy lắc Chỉnh pH trung tính dung dịch NaOH 1N dung dịch HCl 1N Hấp vô trùng 121 oC 30 phút 14 TCVN 8710 XXX: 2022 Phụ lục B (Tham khảo) Quy trình tách chiết ADN CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hố chất nguy hiểm có khả gây hại thao tác không cẩn thận Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da hít phải của hố chất Ln đeo găng tay, trang, mặc quần áo bảo hộ thực thao tác B1 Quy trình tách chiết ADN sử dụng kit tách chiết DNeasy ® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No 69506): – Chuyển 30 mg bệnh phẩm vào ống eppendorf, thêm 180 µl dung dịch ATL, thêm 20 µl protease K vào, lắc máy lắc trộn vortex (4.1.5); – Ủ 56 oC qua đêm hoàn toàn đồng (thỉnh thoảng lắc máy lắc trộn vortex trình ủ) Lắc máy lắc trộn vortex; – Thêm 200 µl dung dịch AL (Lysis buffer) Lắc máy lắc trộn vortex; – Ủ ấm 56 oC 10 phút; – Thêm 200 µl ethanol (từ 96 % đến 100 %) vào ống eppendorf Lắc máy lắc trộn vortex; – Hút huyễn dịch ống eppendorf, chuyển sang cột lọc có ống thu dưới; – Ly tâm máy ly tâm (4.1.4) với gia tốc 000 g phút nhiệt độ phòng; – Thay ống thu cột lọc; – Thêm 500 µl dung dịch AW1 (Wash buffer 1) vào cột lọc có ống thu dưới; – Ly tâm máy ly tâm (4.1.4) với gia tốc 000 g phút nhiệt độ phòng; – Thay ống thu cột lọc; – Thêm 500 µl dung dịch AW2 (Wash buffer 2) vào cột lọc có ống thu dưới; – Ly tâm máy ly tâm với gia tốc 20 000 g phút nhiệt độ phòng; – Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 ml; – Nhỏ 200 µl dung dịch AE (Elution buffer) vào cột ly tâm giữ nhiệt độ phòng phút; 15 TCVN 8710 XXX: 2022 – Ly tâm máy ly tâm với gia tốc 000 g phút; – Chuyển ADN thu sang ống eppendorf 1,5 ml khác; – Bảo quản mẫu ADN – 0C vài tuần – 20 0C thời gian lâu CHÚ Ý: Mẫu đối chứng âm mẫu đối chứng dương tách chiết ADN thời điểm với mẫu xét nghiệm B.2 Tách chiết ADN TACO RNA/DNA extraction Kít B.2.1 Vật liệu: Bộ kít chiết tách TACO RNA/DNA extraction Kít (GeneReach Cat No atc-d/rna, 320 tests) Ethanol 100% (cồn tuyệt đối) B.2.2 Chuẩn bị: - Pha dung dịch đệm rửa A (washing buffer A) với 135 ml cồn tuyệt đối - Pha dung dịch đệm rửa B (washing buffer B) với 230 ml cồn tuyệt đối - Tiến hành theo sơ đồ Thuốc Thử Cồn tuyệt đối Dung dịch đệm rửa A Dung dịch đệm rửa A Dung dịch đệm rửa B Dung dịch đệm rửa B Nước đệm Cồn tuyệt đối Dung dịch đệm rửa A Dung dịch đệm rửa A Dung dịch đệm rửa B Dung dịch đệm rửa B Nước đệm 16 Lượng (l) Thuốc thử Lượng (l) H G F E D C B 250 ►1 750 Hạt từ 50 ►2 750 ►3 750 ►4 750 ►5 100 ►6 250 ►7 750 Hạt từ 50 ►8 750 ►9 750 ►10 750 ►11 100 ►12 A TCVN 8710 XXX: 2022 B.2.3 Chuẩn bị mẫu: - Cho 250 µL/mẫu dung dịch đệm vào ống eppendorf - Cho 100 µL/mẫu vào ống eppendorf chứa dung đệm - Lắc máy votex (4.1.4) 15 giây - Ly tâm 12000 g phút - Cho 350 µL (mẫu dung dịch đệm) vào giếng cột B.2.4 Đưa mẫu vào máy TACO - Đặt đĩa vào máy TACO - Đặt lược vào máy TACO - Sử dụng máy TACO theo hướng dẫn sử dụng: Máy TACO tự động chiết tách khoảng 50 phút - Thu 100 µL ADN từ giếng cột 12 sang ống eppendorf CHÚ Ý: Mẫu đối chứng âm mẫu đối chứng dương tách chiết ADN thời điểm với mẫu cần phát vi rút Red Sea Bream Iridoviral gây bệnh cá biển 17 TCVN 8710 XXX: 2022 Phụ lục C (Quy định) Phương pháp PCR phát RSIV C.1 Trình tự cặp mồi Bảng C.1 – Trình tự cặp mồi [5] Tên Kích thước sản phẩm Trình tự mồi khuếch đại (bp) 4-F 5’-CGG-GGG-CAA-TGA-CGA-CTA-CA-3’ 4-R 5’-CCG-CCT-GTG-CCT-TTT-CTG-GA-3’ 568 C.2 Thực phản ứng PCR Kỹ thuật PCR bao gồm: Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi 4-F 4-R chuẩn bị (3.2.1) kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn nhà sản xuất VÍ DỤ: Kít Thermo Scienetific Dream Taq PCR Master Mix (2X), Cat No: K 10713  hướng dẫn nhà sản xuất (3.2.1) Thành phần cho phản ứng (xem bảng C.2) Bảng C.2 – Thành phần phản ứng PCR Thành phần Nồng độ (µM) Thể tích cho phản ứng (µl) Nước khơng có ARN/DNA 6,5 Dung dịch Master Mix 2X 12,5 Mồi 4-F 20 0,5 Mồi 4-R 20 0,5 Tổng thể tích dung dịch đệm thực phản ứng 20 Chuyển 20 µl hỗn hợp nhân gen vào ống phản ứng: Mẫu đối chứng dương: Cho µl mẫu ADN giám định sử dụng chủng chuẩn Thông tin đưa tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định sử dụng sản phẩm Có thể sử dụng sản phẩm tương tự cho kết tương đương 3 18 TCVN 8710 XXX: 2022 Mẫu đối chứng âm: Cho µl nước tinh khiết khơng có nuclease Mẫu thử: Cho µl mẫu kiểm tra vào ống phản ứng Tiến hành phản ứng PCR máy nhân gen (4.1.1) cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng C.3) Bảng C.3 – Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ 94 03 phút 94 30 s 58 60 s 72 60 s 72 phút 30 19 TCVN 8710 XXX: 2022 Phụ lục D (Qui định) Phương pháp Realtime PCR phát RSIV D.1 Trình tự cặp mồi Bảng D1 – Trình tự cặp mồi [6] Tên mồi đoạn dị Trình tự RSIV RT F 5'- TGA CCA GCG AGT TCC TTG ACT T -3 RSIV RT R 5'- CAT AGT CTG ACC GTT GGT GAT ACC -3' RSIV Probe 5’- FAM AAC GCC TGC ATG ATG CCT GGC TAMRA -3’ D.2 Thực phản ứng Realtime PCR Thành phần cho phản ứng nêu bảng D2: Bảng D2 – Thành phần phản ứng Realtime PCR STT Thành phần Nồng µM độ, Thể tích cho phản ứng, µl Nước khơng có ARN/ADN Dung dịch SuperMix RSIV RT F 20 0,5 RSIV RT R 20 0,5 RSIV Probe 10 0,5 12.5 Tổng thể tích dung dịch đệm thực phản ứng 20 Chuyển 12 µl hỗn hợp nhân gen vào ống phản ứng: - Mẫu kiểm chứng dương: Cho µl mẫu ADN giám định sử dụng chủng RSIV chuẩn - Mẫu kiểm chứng âm: Cho µl nước tinh khiết khơng có nuclease - Mẫu thử: Cho µl mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng Tiến hành phản ứng máy Realtime PCR (4.1.2) cài đặt chu trình nhiệt nêu bảng D3: Bảng D3 – Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime PCR [6] 20 ... – Phần XXX: BỆNH DO RED SEA BREAM IRIDOVIRAL GÂY RA Ở CÁ BIỂN (RSIV) Aquatic animal diseases – Diagnostic procedure – Part xxx: Red Sea Bream Iridoviral Disease CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu... sau: 2.1 Bệnh Red Sea Bream Iridoviral gây cá biển Là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm vi rút nhiều loài cá biển 2.2 Red Sea Bream Iridovirus Là vi rút thuộc giống Megalocytivirus họ Iridoviridae;... xác định khả áp dụng giới hạn quy định trước sử dụng tiêu chuẩn Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định quy trình chẩn đoán bệnh Red Sea Bream Iridoviral gây cá biển (RSIV) Thuật ngữ định nghĩa Trong