BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN XXX: BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU DO EHNV Ở CÁ

TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710 XXX: 2022 BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN XXX: BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU DO EHNV Ở CÁ (Aquatic Animal Disease - Diagnostic procedure Part xxx : Epizootic Haematopoietic Necrosis) HÀ NỘI – 2022 TCVN 8710 XXX : 2022 TCVN 8710 XXX: 2022 Lời nói đầu TCVN 8710 XXX: 2022 xây dựng sở tham khảo (OIE) 2021, Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animal ,Chapter 2.3.2 Infection with epizootic haematopoietic necrosis virus TCVN 8710 XXX: 2022 Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Bộ TCVN 8710 Bệnh thủy sản- Quy trình chẩn đốn gồm phần sau:  TCVN 8710-01: 2011, phần 1: Bệnh Còi vi rút tôm (MBV);  TCVN 8710-02: 2019, phần 2: Bệnh Hoại tử thần kinh cá biển (VNN);  TCVN 8710-03: 2019, phần 3: Bệnh Đốm trắng tôm (WSSV);  TCVN 8710-04: 2019, phần 4: Bệnh Đầu vàng tôm (YHV);  TCVN 8710-05: 2011, phần 5: Bệnh Taura tôm He (TSV);  TCVN 8710-06: 2019, phần 6: Bệnh Koi herpesvirus cá chép (KHV);  TCVN 8710-07: 2019, phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân cá chép (SVC);  TCVN 8710-08: 2012, phần 8: Bệnh hoại tử tôm (IMNV);  TCVN 8710-09: 2012, phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy tôm (NHB);  TCVN 8710-10: 2015, phần 10: Bệnh perkinsus marinus nhuyễn thể hai mảnh vỏ;  TCVN 8710-11: 2015, phần 11: Bệnh perkinsus olseni nhuyễn thể hai mảnh vỏ;  TCVN 8710-12: 2019, phần 12: Bệnh vi bào tử Enterocytozoon hepatopenaei tôm;  TCVN 8710-13: 2015, phần 13: Bệnh gan tụy Parvovirus tôm;  TCVN 8710-14: 2015, phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) cá;  TCVN 8710-15: 2015, phần 15: Bệnh nhiễm trùng Aeromonas hydrophila cá;  TCVN 8710-16: 2016, phần 16: Bệnh gan thận mủ cá da trơn;  TCVN 8710-17: 2016, phần 17: Bệnh sữa tôm hùm;  TCVN 8710-19: 2019, phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm;  TCVN 8710-20: 2019, phần 20: Bệnh hoại tử vỏ quan tạo máu tôm;  TCVN 8710-21: 2019, phần 21: Bệnh vi khuẩn Streptococcus agalactiae cá  TCVN 8710-22: 2021, phần 22: Bệnh sán 16 móc cá; TCVN 8710 XXX : 2022  TCVN 8710-23: 2022, phần 23: Bệnh hoại tử quan tạo máu IHNV cá hồi;  TCVN 8710-24: 2022, phần 24: Bệnh sán dollfustrema sp cá da trơn;  TCVN 8710-25: 2022, phần 25: Bệnh ký sinh trùng bonamia ostreae bonamia exitiosa hàu TCVN 8710 XXX: 2022 TCVN 8710 XXX : 2022 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710 XXX:2022 Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đốn – Phần XXX: Quy trình chẩn đốn bệnh hoại tử quan tạo máu EHNV cá Aquatic animal diseases – Diagnostic procedure – Part xxx: Epizootic Haematopoietic Necrosis CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn liên quan đến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn đưa hết tất cả vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập thao tác an toàn sức khỏe thích hợp xác định khả áp dụng giới hạn quy định trước sử dụng tiêu chuẩn Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định quy trình chẩn đốn bệnh hoại tử quan tạo máu EHNV cá Thuật ngữ, định nghĩa từ viết tắt Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau đây: 2.1 Bệnh hoại tử quan tạo máu EHNV cá Là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm loài cá Vược, cá Hồi số loài cá khác EHNV gây thiệt hại nghiêm trọng cá giống cá hồi giai đoạn ấu trùng 2.2 Vi rút gây bệnh hoại tử quan tạo máu (Epizootic Haematopoietic Necrosis Virus) Là thành viên chi Ranavirus họ Iridoviridae với loài Frog virus Các loài khác bao gồm vi rút Bohle (Bohle virus - BIV), vi rút cá da trơn châu Âu (European catfish virus - ECV), Vi rút cá mòi châu Âu (European sheatfish virus - ESV) vi rút ranavirus Santee-Cooper Ranavirus phân lập từ ếch, kỳ nhông bò sát khỏe mạnh bị bệnh Châu Mỹ, Châu Âu Úc Ranavirus có virion lớn (150–180 nm), hình tứ diện, gen DNA sợi đơi 150–170 kb nhân lên nhân tế bào chất 2.3 Các từ viết tắt - ADN (Deoxyribonucleic acid): Axit deoxyribonucleic; - PBS (Phosphate buffered saline): Dung dịch muối đệm phốt phát; TCVN 8710 XXX: 2022 - PCR (Polymerase Chain Reaction): Phản ứng chuỗi trùng hợp; - TAE (Tris-brorate – EDTA): dung dịch đệm TAE; - TBE (Tris-acetate – EDTA): dung dịch đệm TBE Thuốc thử vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khống nước có độ tinh khiết tương đương, trừ trường hợp có quy định khác 3.1 Thuốc thử vật liệu thử dùng chung 3.1.1 Ethanol, từ 70 % đến 100 % (thể tích) 3.1.2 Dung dịch muối đệm phosphate (PBS) (xem A2) 3.2 Thuốc thử vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán PCR (Polymerase Chain Reaction) 3.2.1 Cặp mồi, gồm mồi xuôi mồi ngược PCR 3.2.2 Kít tách chiết ADN (acid deoxyribo nucleic) 3.2.3 Kít nhân gen PCR 3.2.4 Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiaphúttetraaxetic) 3.2.5 Thang chuẩn DNA (Ladder/ Marker) 3.2.6 Nước tinh khiết, khơng có nuclease 3.2.7 Thạch agarose 3.2.8 Dung dịch đệm TAE (Tris – acetate – EDTA) TBE (Tris – brorate – EDTA) (xem A.1) 3.2.9 Chất nhuộm màu, Ví dụ: Sybr safe 3.2.10 Chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X) Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ thơng thường phịng thử nghiệm sinh học thiết bị, dụng cụ sau 4.1 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp chẩn đoán PCR 4.1.1 Máy nhân gen PCR TCVN 8710 XXX : 2022 4.1.2 Máy tách chiết ADN/ARN 4.1.3 Máy ly tâm, ly tâm với gia tốc 000 g 20 000 g 4.1.4 Máy lắc trộn vortex 4.1.5 Máy spindown 4.1.6 Bộ điện di, gồm nguồn bể chạy điện di 4.1.7 Máy đọc sản phẩm PCR Chẩn đoán lâm sàng 5.1 Đặc điểm dịch tễ - Các loài cá cảm nhiễm: cá Vược vây đỏ (Perca fluviatilis), cá Hồi vân (Oncorhynchus mykiss), cá Rô bạc (Bidyanus bidyanus), cá Vược Châu Âu (Sander lucioperca), cá Vược Macquarie (Macquaria australasica) số loài cá khác - EHNV phát ÚC vào năm 1986 cá nuôi phát cá da trơn Pháp (ECV), cá Măng Đức (ESV), turbot Đan Mạch loài khác Phần Lan - Tất giai đoạn cá mẫn cảm với vi rút gây bệnh EHNV giai đoạn cá giống cá hồi giai đoạn ấu trùng thường có dấu hiệu lâm sàng rõ ràng - Các quan đích bị nhiễm vi rút: thận, lách gan - EHNV tồn đường tiêu hóa gia cầm vài truyền thức ăn bị nơn trớ Nó mang lơng, chân mỏ chim EHNV có khả chịu khơ cao Vi rút tồn nhiều ngày nước 113 ngày mơ cá khơ Nó tồn 300 ngày môi trường nuôi cấy tế bào ° hai năm mô cá bảo quản –20 ° C - Các lồi chim hoạt động vectơ học lây truyền vi rút - Thời gian ủ bệnh cá Hồi vân bị nhiễm bệnh thí nghiệm từ đến 10 ngày nhiệt độ nước 19 đến 21° C từ 14 đến 32 ngày nhiệt độ nước đến 10 ° C Trong thực nghiệm bị nhiễm bệnh cá rô vây đỏ, thời gian ủ bệnh từ 10 đến 11 ngày 19 đến 21 ° C, từ 10 đến 28 ngày 12 đến 18 ° C 5.2 Triệu chứng lâm sàng - Cá bị bệnh hoại tử quan tạo máu EHNV có dấu hiệu lâm sàng khơng điển hình, cá rơ chết đột ngột dấu hiệu phổ biến nhất; - Cá bị trạng thái cân bằng, thờ ơ, cá bị sạm da bề mặt, có ban đỏ quanh lỗ mũi vùng não, xuất huyết mang gốc vây; TCVN 8710 XXX: 2022 - Cá Hồi nhiễm vi rút EHNV có dấu hiệu sạm đen bề mặt thể, hôn mê, chướng bụng thăng bằng, loét da, có bọng nước tấy đỏ gốc vây, 5.3 Dấu hiệu bệnh tích - Cá bị bệnh hoại tử quan tạo máu EHNV có dấu hiệu lách gan sưng to, tăng dịch màng bụng nhiều ổ hoại tử gan - Có tổn thương màu trắng đến vàng khu trú gan tương ứng với vùng hoại tử Chẩn đoán phịng thí nghiệm 6.1 Phương pháp PCR 6.1.1 Lấy mẫu - Cá có kích thước < cm: Lấy ngun từ 10 đến 15 - Cá có kích thước từ đến cm: Lấy nguyên từ đến 10 lấy gan, thận, lách từ đến 10 - Cá có kích thước > cm: Lấy nguyên từ đến lấy gan, thận, lách từ đến - Mẫu bệnh phẩm phải lấy vô trùng để riêng biệt dụng cụ đựng mẫu 6.1.2 Bảo quản mẫu - Bảo quản vận chuyển: Bảo quản mẫu nhiệt độ từ oC đến oC khơng q 48h vận chuyển phịng thí nghiệm bảo quản cồn 90% với tỉ lệ 1:10 (1 phần mẫu:10 phần cồn) - Bảo quản phịng thí nghiệm: Mẫu được bảo quản nhiệt độ từ oC đến oC chuyển đến phòng thí nghiệm chưa phân tích phải bảo quản nhiệt độ âm 20 oC đến âm 80 oC bảo quản dung dịch Phosphate Buffered Saline (PBS) theo tỉ lệ mẫu: PBS (1:10) nhiệt độ âm 20 oC đến âm 80 oC bảo quản etanol từ 96 % đến 100 % 6.1.3 Chuẩn bị mẫu Dùng pank, kéo vô trùng để thực thao tác: tách, cắt lấy mẫu Mẫu chia thành hai phần: phần cho thực xét nghiệm phần lưu trữ Lượng mẫu lấy để tách chiết ADN khoảng 30 mg Cho 30 mg mẫu (gan, thận lách) vào dung dịch PBS (3.1.2) với tỷ lệ 9:1 (1 thể tích mẫu thể tích PBS), nghiền mẫu để tạo thành huyễn dịch 10 % Chuyển huyễn dịch vào ống vơ trùng đóng nắp TCVN 8710 XXX : 2022 để vào tủ âm sâu (- 80 oC) thời gian tối thiểu h trước tiến hành chiết tách ADN Một ống mẫu để xét nghiệm ống lưu mẫu 6.1.4 Cách tiến hành 6.1.4.1 Tách chiết ADN Sử dụng kít tách chiết (3.2.2) thích hợp an tồn theo hướng dẫn nhà sản xuất VÍ DỤ: Sử dụng kit tách chiết ADN Qiagen: DNeasy® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No 69506)1) (xem phụ lục B1) Hoặc sử dụng kit tách chiết TACO RNA/DNA extraction Kit (GeneReach Cat No atc-d/rna, 320 tests)2) (xem phụ lục B2) 6.1.4.2 Chuẩn bị mồi Phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu (3.2.1) để phát EHNV Trình tự cặp mồi (xem phụ lục C, Bảng C1) Mồi chuẩn bị sau: – Mồi trạng thái đông khô phải ly tâm nhanh máy spindown (4.1.5) 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước mở hoàn nguyên Dùng dung dịch đệm TE (3.2.4) để hồn ngun mồi nồng độ 100 µM làm gốc – Mồi sử dụng nồng độ 20 µM: Pha lỗng mồi gốc nước tinh khiết khơng có nuclease (3.2.6) (20 µl mồi gốc 80 µl nước tinh khiết khơng có nuclease) 6.1.4.3 Tiến hành phản ứng PCR Phản ứng khuếch đại thực máy nhân gen (4.1.1) theo phương pháp PCR sử dụng cặp mồi xuôi, ngược sử dụng kit nhân gen (3.2.3) theo hướng dẫn nhà sản xuất (xem phụ lục C, Bảng C2) 6.1.4.4 Điện di 6.1.4.4.1 Chuẩn bị bản thạch Pha thạch với nồng độ agarose (3.2.7) từ 1,5 % đến % dung dịch đệm TBE 1X TAE 1X (3.2.8) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc đun sôi; Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 oC đến 50 oC bổ sung 10 µl chất nhuộm màu (3.2.9) vào 100 ml thạch Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan 1,2) Thông tin đưa tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định sử dụng sản phẩm nhà cung cấp Có thể sử dụng sản phẩm tương tự cho kết tương đương 10 TCVN 8710 XXX: 2022 Tiến hành đổ thạch vào khay điện di cài lược; không nên đổ thạch dày q 0,8 cm Khi thạch đơng lại tiến hành gỡ lược khỏi thạch Chuyển thạch vào bể điện di (4.1.6), đổ dung dịch đệm (TBE 1X TAE 1X) loại với dung dịch pha agarose đun vào bể điện di ngập thạch CHÚ THÍCH: Có thể dùng sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (VÍ DỤ: Sybr safe DNA gel stain sử dụng theo quy định nhà sản xuất) 6.1.4.4.2 Chạy điện di Hút µl chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X) (3.2.10) vào µl sản phẩm PCR trộn cho vào giếng thạch Thực điện di điện di, chạy kèm theo thang chuẩn ADN (3.2.5) để dự đốn kích thước sản phẩm khuếch đại Hút 10 μl thang chuẩn ADN (3.2.5) vào giếng thạch Điện di hiệu điện 100 V thời gian 30 phút 6.1.4.4.5 Đọc kết quả Sau điện di, đọc kết máy đọc sản phẩm PCR (4.1.7) Điều kiện phản ứng cơng nhận khi: - Đối chứng âm có kết âm tính (khơng có sản phẩm khuếch đại); - Đối chứng dương có kết dương tính thể vệt sáng rõ có kích thước 321bp 625bp 580 bp tương ứng theo cặp mồi sử dụng bảng C1 - Thang chuẩn ADN sáng chia vạch rõ ràng Với điều kiện phản ứng Mẫu xét nghiệm âm tính khi: - Tại giếng mẫu thử khơng xuất vạch sáng kích thước 321bp 625bp 580 bp tương ứng theo cặp mồi sử dụng bảng C1 (khơng có sản phẩm khuếch đại); Mẫu xét nghiệm dương tính khi: - Tại giếng mẫu thử có sản phẩm khuếch đại có kích thước 321bp 625bp 580 bp tương ứng theo cặp mồi sử dụng bảng C1 - Có kết giải trình tự gen để khẳng định kết PCR 11 TCVN 8710 XXX : 2022 Kết luận Cá xác định nhiễm bệnh hoại tử quan tạo máu EHNV cá có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng đặc trưng bệnh có kết sau đây: - Có kết dương tính với EHNV phương pháp PCR với ba cặp mồi MCP1, MCP2, MCP - Và có kết giải trình tự gen để khẳng định kết PCR 12 TCVN 8710 XXX: 2022 Phụ lục A (Quy định) Thành phần chuẩn bị thuốc thử A.1 Dung dịch đệm TAE TBE A.1.1 Thành phần Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X: 100 ml Nước khử ion: 900 ml Tổng: 1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1X A.1.2 Chuẩn bị Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X hoà chung với 900 ml nước khử ion, khuấy lắc Bảo quản nhiệt độ phòng A.2 Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) A.2.1 Thành phần Natri clorua (NaCl) 8g Natri hydro photphat dihydrat (Na2HPO4.2H2O) 2,9 g Kali dihydro photphat (KH2PO4) 0,2 g Kali clorua (KCl) 0,2 g Nước cất 1000 ml A.2.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần vào 1000 ml nước cất, khuấy lắc Chỉnh pH trung tính dung dịch NaOH 1N dung dịch HCl 1N Hấp vô trùng 121 oC 30 phút 13 TCVN 8710 XXX : 2022 Phụ lục B (Tham khảo) Quy trình tách chiết ADN CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hố chất nguy hiểm có khả gây hại thao tác không cẩn thận Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da hít phải của hố chất Ln đeo găng tay, trang, mặc quần áo bảo hộ thực thao tác B1 Quy trình tách chiết ADN sử dụng kit tách chiết DNeasy ® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No 69506): – Chuyển 30 mg bệnh phẩm vào ống eppendort, thêm 180 µl dung dịch ATL, thêm 20 µl protease K vào, lắc máy lắc trộn vortex (4.1.4); – Ủ 56 oC qua đêm hoàn toàn đồng (thỉnh thoảng lắc máy lắc trộn vortex trình ủ) Lắc máy lắc trộn vortex; – Thêm 200 µl dung dịch AL (Lysis buffer) Lắc máy lắc trộn vortex; – Ủ ấm 56 oC 10 phút; – Thêm 200 µl ethanol (từ 96 % đến 100 %) vào ống eppendort Lắc máy lắc trộn vortex; – Hút huyễn dịch ống eppendort, chuyển sang cột lọc có ống thu dưới; – Ly tâm máy ly tâm (4.1.3) với gia tốc 000 g phút nhiệt độ phòng; – Thay ống thu cột lọc; – Thêm 500 µl dung dịch AW1 (Wash buffer 1) vào cột lọc có ống thu dưới; – Ly tâm máy ly tâm (4.1.3) với gia tốc 000 g phút nhiệt độ phòng; – Thay ống thu cột lọc; – Thêm 500 µl dung dịch AW2 (Wash buffer 2) vào cột lọc có ống thu dưới; – Ly tâm máy ly tâm với gia tốc 20 000 g phút nhiệt độ phòng; – Chuyển cột lọc sang ống eppendort 1,5 ml; – Nhỏ 200 µl dung dịch AE (Elution buffer) vào cột ly tâm giữ nhiệt độ phòng phút; 14 TCVN 8710 XXX: 2022 – Ly tâm máy ly tâm với gia tốc 000 g phút; – Chuyển ADN thu sang ống eppendort 1,5 ml khác; – Bảo quản mẫu ADN – 0C vài tuần – 20 0C thời gian lâu CHÚ Ý: Mẫu đối chứng âm mẫu đối chứng dương tách chiết ADN thời điểm với mẫu cần phát bệnh hoại tử quan tạo máu (EHNV) cá hồi B.2 Tách chiết ADN TACO RNA/DNA extraction Kít B.2.1 Vật liệu: Bộ kít chiết tách TACO RNA/DNA extraction Kít (GeneReach Cat No atc-d/rna, 320 tests) Ethanol 100% (cồn tuyệt đối) B.2.2 Chuẩn bị: - Pha dung dịch đệm rửa A (washing buffer A) với 135 ml cồn tuyệt đối - Pha dung dịch đệm rửa B (washing buffer B) với 230 ml cồn tuyệt đối - Tiến hành theo sơ đồ Thuốc Thử Cồn tuyệt đối Dung dịch đệm rửa A Dung dịch đệm rửa A Dung dịch đệm rửa B Dung dịch đệm rửa B Nước đệm Cồn tuyệt đối Dung dịch đệm rửa A Dung dịch đệm rửa A Dung dịch đệm rửa B Dung dịch đệm rửa B Nước đệm Lượng (l) Thuốc thử Lượng (l) H G F E D C B 250 ►1 750 Hạt từ 50 ►2 750 ►3 750 ►4 750 ►5 100 ►6 250 ►7 750 Hạt từ 50 ►8 750 ►9 750 ►10 750 ►11 100 ►12 A 15 TCVN 8710 XXX : 2022 B.2.3 Chuẩn bị mẫu: - Cho 250 µL/mẫu dung dịch đệm vào ống eppendort - Cho 100 µL/mẫu vào ống eppendort chứa dung đệm - Lắc máy votex (4.1.4) 15 s - Ly tâm 12000 g phút - Cho 350 µL (mẫu dung dịch đệm) vào giếng cột B.2.4 Đưa mẫu vào máy TACO - Đặt đĩa vào máy TACO - Đặt lược vào máy TACO - Sử dụng máy TACO theo hướng dẫn sử dụng: Máy TACO tự động chiết tách khoảng 50 phút - Thu 100 µL ADN từ giếng cột 12 sang ống eppendort CHÚ Ý: Mẫu đối chứng âm mẫu đối chứng dương tách chiết ADN thời điểm với mẫu cần phát bệnh hoại tử quan tạo máu EHNV cá hồi 16 TCVN 8710 XXX: 2022 Phụ lục C (Quy định) Phương pháp PCR phát vi rút gây bệnh hoại tử quan tạo máu EHNV cá C.1 Trình tự cặp mồi - Sản phẩm khuếch đại từ xét nghiệm PCR sử dụng cặp mồi MCP-1 phân biệt với iridovirus Úc (EHNV BIV) với iridovirus Úc (FV3, Châu Mỹ; ECV, Châu Âu) - Sản phẩm khuếch đại từ xét nghiệm PCR sử dụng cặp mồi MCP-2 phân biệt EHNV BIV (Úc) với với FV3 (Châu Mỹ) ECV (Châu Âu) - Sản phẩm khuếch đại từ xét nghiệm PCR sử dụng cặp mồi MCP phát cụ thể ranavirus từ cá rô châu Âu, cá hồi vân, cá da trơn, cá da trơn, cá bảy màu cá (Poecilia reticulata), cá bác sĩ (Labroides dimidatus) loạt loài sinh vật lưỡng cư ranavirus Bảng C.1 – Trình tự cặp mồi [1] Cặp mồi M151 MCP -1 M152 M153 MCP -2 M154 Trình tự mồi từ đầu 5' tới 3' AAC-CCG-GCT-TTC-GGG-CAG-CA Kích thước sản phẩm (bp) 321 CGG-GGC-GGG-GTT-GAT-GAG-AT ATG-ACC-GTC-GCC-CTC-ATC-AC 625 CCA-TCG-AGC-CGT-TCA-TGA-TG EHNV-6R AAA-GAC-CCG-TTT-TGC-AGC-AAA-C EHNV-5 CGC-AGT-CAA-GGC-CTT-GAT-GT MCP 580 C.2 Thực phản ứng PCR Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng: sử dụng cặp mồi M151/M152 M153/M154 EHNV-6R/ EHNV-5 chuẩn bị (3.2.1) kít nhân gen (3.2.3) theo hướng dẫn nhà sản xuất VÍ DỤ: Kít Thermo Scienetific Dream Taq PCR Master Mix (2X), Cat No: K 1071  hướng dẫn nhà sản xuất (3.2.1) Thành phần cho phản ứng (xem bảng C.2) Thông tin đưa tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định sử dụng sản phẩm Có thể sử dụng sản phẩm tương tự cho kết tương đương 3 17 TCVN 8710 XXX : 2022 Bảng C.2 – Thành phần phản ứng PCR Thành phần Nồng độ (µM) Thể tích cho phản ứng (µl) Nước khơng có ARN/ADN 6,5 Dung dịch Master Mix 2X 12,5 Mồi xuôi 20 0,5 Mồi ngược 20 0,5 Tổng thể tích dung dịch đệm thực phản ứng 20 Chuyển 20 µl hỗn hợp nhân gen vào ống phản ứng: Mẫu đối chứng dương: Cho µl mẫu ADN giám định sử dụng chủng chuẩn Mẫu đối chứng âm: Cho µl nước tinh khiết khơng có nuclease Mẫu thử: Cho µl mẫu kiểm tra vào ống phản ứng Tiến hành phản ứng PCR máy nhân gen (4.1.1) cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng C.3) Bảng C.3 – Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 18 Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ 95 02 phút 95 30 s 58 30 s 72 60 s 72 60 s 35 TCVN 8710 XXX: 2022 Thư mục tài liệu tham khảo [1] A D Hyatt1, A R Gould1, Z Zupanovic, A A Cunningham, S Hengstberger, R J Whittington, J Kattenbelt, and B E H Coupar, Comparative studies of piscine and amphibian iridoviruses, Arch Virol (2000) 145: 301–331 [2] OIE 2019, Chapter 2.3.1 Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animal, Infection with Epizootic Haematopoietic Necrosis Virus; [3] Epizootic Hematopoietic Necrosis Epizootic Haematopoietic Necrosis Last Updated: July 2007, The Center for Food Security & Public Health (CFSPH); [4] FAO/NACA 2001 Asia Diagnostic Guide to Aquatic Animal Diseases FAO Fish Pap No.402/2; 19 ... chuẩn quy định quy trình chẩn đốn bệnh hoại tử quan tạo máu EHNV cá Thuật ngữ, định nghĩa từ viết tắt Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau đây: 2.1 Bệnh hoại tử quan tạo máu EHNV. .. trình chẩn đốn bệnh hoại tử quan tạo máu EHNV cá Aquatic animal diseases – Diagnostic procedure – Part xxx: Epizootic Haematopoietic Necrosis CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn liên quan đến... 25: Bệnh ký sinh trùng bonamia ostreae bonamia exitiosa hàu TCVN 8710 XXX: 2022 TCVN 8710 XXX : 2022 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710 XXX:2 022 Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đốn – Phần XXX: Quy