TÌM HIỂU đặc điểm mô BỆNH học ở tôm sú (p monodon) BỆNH HOẠI tử cơ QUAN tạo máu và cơ QUAN lập BIỂU mô

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THUỲ NGÂN TÌM HIỂU ĐẶC ĐIỂM MƠ BỆNH HỌC Ở TƠM SÚ (P.monodon) BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU VÀ CƠ QUAN LẬP BIỂU MÔ (IHHNV – Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus ) tập nghiên cứu Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2008 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THUỲ NGÂN TÌM HIỂU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC Ở TÔM SÚ (P.monodon) BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU VÀ CƠ QUAN LẬP BIỂU MÔ (IHHNV – Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus ) tập nghiên cứu Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ths BÙI THỊ BÍCH HẰNG 2008 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC Lời cảm tạ i Tóm tắt ii Danh sách hình iii Danh mục từ viết tắt iii CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược nghề nuôi tôm giới, Việt Nam 2.2 Tác nhân gây bệnh IHHNV 2.2.1 Đặc điểm tác nhân gây bệnh IHHNV 2.2.2 Dấu hiệu bệnh lý 2.2.3 Phân bố lan truyền bệnh 2.2.4 Chẩn đoán bệnh 2.2.5 Thiệt hại IHHNV gây @ bệnhTài Trung tâm Học2.2.6 liệuNhững ĐH nghiên Cần cứu Thơ liệu học tập nghiên cứu 2.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh Phương pháp PCR 2.3.2 Phương pháp mô học CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 11 3.2 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 11 3.2.1 Chẩn đoán bệnh IHHNV kỹ thuật PCR theo kit IQ 2000 11 TM 3.2.2 Kỹ thuật mô học 14 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 4.1 Kết xét nghiệm PCR 17 4.2 Kết mô học 17 4.2.1 Những biến đổi mô học lớp biểu mô vỏ tôm sú nhiễm IHHNV 17 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4.2.2 Những biến đổi mô học mang tôm sú nhiễm IHHNV .17 4.2.3 Những biến đổi mô học mô liên kết gan tuỵ tôm sú nhiễm IHHNV 19 4.2.4 Những biến đổi mô học tuyến râu tôm sú nhiễm IHHNV 20 4.2.5 Những biến đổi mô học tôm sú nhiễm IHHNV 21 4.2.6 Những biến đổi mô học quan tạo máu tôm sú nhiễm IHHNV 21 Chương 5: KẾT LUẬN & ĐỀ XUẤT 23 5.1 Kết luận 23 5.2 Đề xuất 23 Tài Liệu Tham Khảo 24 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM TẠ Xin trân trọng cảm tạ cô Bùi Thị Bích Hằng giáo viên hướng dẫn thực đề tài tận tình dẫn, giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Xin trân trọng cảm tạ quí thầy phụ trách phong thí nghiệm cán phụ trách thư viện khoa Thuỷ Sản tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận văn Có kết ngày hơm tơi xin chân thành cảm ơn tất q thầy trường, khoa thuỷ sản giáo dục, truyền đạt kiến thức cần thiết từ ngày đầu bước chân đến giảng đường Cảm ơn tập thể lớp Bệnh Học Thuỷ Sản- K30 giúp đỡ đóng góp ý kiến quý báo suốt khoảng thời gian thực đề tài Và cuối xin chân thành cảm tạ cha mẹ tơi, gia đình tơi hết lịng ni dưỡng, thương u, bảo bọc tạo điều kiện tốt để tơi lớn lên, giáo dục có thành ngày hơm Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TĨM TẮT Để tìm hiểu đặc điểm mô bệnh học bệnh hoại tử quan tạo máu quan lập biểu mô (IHHNV) tôm sú giống, trước tiên ứng dụng kỹ thuật PCR (dùng kit IQ 2000 TM) xét nghiệm 66 mẫu được15 mẫu dương tính Sau đó, tiến hành làm tiêu mô học mẫu xét nghiệm phương pháp truyền thống (Lightner, 1996) Quá trình thực từ tháng 01/ 2008 đến tháng 05/ 2008 khoa thuỷ sản trường Đại Học Cần Thơ Kết quan sát tiêu mô học cho thấy tôm bị bệnh IHHNV biểu mức độ vi thể thể vùi IHHNV nhân phì đại tế bào biểu mô vỏ, mang, quan tạo máu, tuyến râu, cơ, mô liên kết gan tuỵ tượng hoại tử làm cấu trúc bình thường quan Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1: Kết điện di sản phẩm PCR 13 Hình 4.1: Lớp biểu mơ vỏ tơm nhiễm IHHNV 17 Hình 4.2: Cấu tạo vi thể mang bị nhiễm IHHNV 18 Hình 4.3: Thể vùi Cowdry loại A mô liên kết gan tuỵ hoại tử với nhiều khoảng trống 19 Hình 4.4: Tuyến râu tôm sú nhiễm IHHNV 20 Hình 4.5: (A) Cơ tơm sú bình thường; (B) Cơ tôm sú bị bệnh 21 Hình 4.6: Mơ tạo máu nhiễm IHHNV 22 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT bp = Base pair ĐBSCL = Đồng Bằng Sông Cửu Long IHHNV = Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus NTTS = Nuôi Trồng Thuỷ Sản Trung tâmTSHọc liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu = Thủy Sản ORF = Open Reading Frame PCR = Polymerase Chain Reaction µl = Micro lít nm = Nano mét ADN = Acid Deoxyribonucleotide % = Phần trăm WSSV = White spot syndrome virus YHV = Yellow head virus iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU Trung Việt Nam có truyền thống lâu đời hoạt động khai thác NTTS (Ni Trồng Thuỷ Sản) Ngành thuỷ sản đóng góp 3% GDP mười năm qua xem ngành có bước trưởng thành nhanh chóng thập kỷ vừa Tháng 12/ 1999 Chính phủ thơng qua chương trình phát triển NTTS Việt Nam giai đoạn 2000- 2010, đến năm 2010 tổng sản lượng NTTS phải đạt triệu tấn, kim ngạch xuất đạt 2,5 tỷ la (Tạp chí TS, số 6, 2007) Riêng sản lượng tôm nuôi năm 2004 theo Bob Rosenberry, Việt Nam đứng thứ hai giới (350.000 tấn) vượt Thái Lan (300.000 tấn) Thu nhập ngoại tệ từ NTTS tăng lên hàng năm riêng tôm mang lại ước tính gần tỷ USD Thật vậy, tôm sú (Penaues monodon) đối tượng thuỷ sản có giá trị thương phẩm cao đối tượng nuôi quan trọng số nước phát triển Châu Á Tuy nhiên nuôi thuỷ sản phát triển theo hướng suất cao ln kèm theo phát triển dịch bệnh ln khó khăn NTTS Ở Việt Nam, dịch bệnh NTTS vài năm qua cho thấy yếu tố giới hạn quan trọng mà cần phải giải phụcThơ nhằm@ đưaTài nghề nuôihọc thuỷ tập sản phát triển theo cứu tâmcóHọc liệupháp ĐHkhắc Cần liệu nghiên hướng bền vững Bệnh đốm trắng bệnh đầu vàng nuôi tôm sú hay bệnh mủ gan ký sinh trùng cá da trơn bệnh nguy hiểm gây tác hại nghiêm trọng cho nghề nuôi Trong đó, tơm sú nhiễm virus gây bệnh đốm trắng có tỷ lệ chết cao (> 80%) mà chưa có thuốc trị hiệu (Tạp chí TS, số 6, 2007) Trong IHHNV (Infectiuos Hypodermal and Haematopoietic necrosis) tác nhân nguy hiểm tôm P stylirostris P vannamei (Kalagayan et al., 1991) IHHNV virus gây bệnh hoại tử quan tạo máu cow quan lập biểu mô tôm Penaeid, lần phát vào năm 1981 Hawai gây chết hàng loạt tôm P stylirostris (Lightner et al., 1983) Theo Carpenter & Brock (1992) IHHNV gây thiệt hại nặng nề mặt kinh tế gây chết 90% tơm P stylirostris sau hai mươi ngày thả nuôi Tuy virus không gây chết cho tôm sú lại tác nhân gây chậm lớn, dị hình (Flegel, 1997) Mặc khác đợt dịch bệnh IHHNV gây xảy mùa năm tôm giống rủi ro Ngày nay, với phát triển khoa học kỹ thuật phương pháp chẩn đốn bệnh thuỷ sản ngày tiến Trước tiên phải kể đến PCR (Polymerase Chain Reaction), kỹ thuật khuếch đại trình tự ADN LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com cách nhanh nhất, phát minh đặt tên Mullis & ctv vào năm 1985 Bên cạnh phương pháp mơ bệnh học phương pháp góp phần quan trọng vào việc chẩn đốn bệnh thuỷ sản, đặc biệt bệnh tôm Mô bệnh học không mô tả tổn thương mô tế bào mức độ vi thể mà so sánh đối chiếu tổn thương với biểu lâm sàng cá, tôm, nhuyễn thể (Lightner and Bell, 1988) Để ứng dụng mô bệnh học vào việc chẩn đốn tác nhân gây bệnh IHHNV tơm sú tìm hiểu đặc điểm mơ học virus đề tài ”Tìm hiểu đặc điểm mơ bệnh học tôm sú bệnh hoại tử quan tạo máu quan lập biểu mô (IHHNV)” thực Mục tiêu: Mô tả đặc điểm mô bệnh học tôm sú nhiễm IHHNV Việt Nam Nội dung: Xét nghiệm IHHNV tôm sú giống PCR nhằm tìm mẫu bị bệnh Tiến hành làm tiêu mơ học mẫu dương tính với IHHNV Quan sát đặc điểm mô bệnh học tôm nhiễm IHHNV Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược nghề nuôi tôm giới, Việt Nam Trên giới: Các quốc gia tham gia sản xuất tôm khu vực Châu Á Thái Lan giải vấn đề kỹ thuật, công nghệ nuôi tôm Ấn Độ có nhiều cố gắng để cải tiến biện pháp khoa học công nghệ Ở quốc gia nhiều biện pháp kỹ thuật tiên tiến áp dụng vào sản xuất tơm giống có chất lượng cao như: sàng lọc tôm bố mẹ bệnh phương pháp kiểm tra PCR, hạn chế sử dụng thuốc kháng sinh, tăng cường sử dụng chế phẩm sinh học, áp dụng phương pháp kiểm dịch vệ sinh nghiêm ngặt, … Ấn Độ Thái Lan thành lập ngân hàng tơm bố mẹ có khả kháng bệnh nghiên cứu phát triển đàn tôm bố mẹ thơng qua phương pháp hố, … Tóm lại đẩy mạnh phát triển khoa học công nghệ nhằm nâng cao tính bền vững ni tơm ưu tiên hàng đầu người sản xuất quốc gia xuất tôm (Nguyễn Thị Ngọc, 2007) song với ĐH việc tăng số lượng bệnh tômhọc tập ngày càngnghiên phát triển cứu Trung tâmSong Học liệu Cần Thơ tơm @ Tài liệu nhiều xuất nhiều bệnh lạ chưa có giải pháp điều trị Theo Bùi Quang Tề (2006) có gần 30 bệnh hội chứng tôm nuôi với số tác nhân gây bệnh quan trọng virus, vi khuẩn, nấm nguyên sinh động vật Hiện chưa có phương pháp điều trị bệnh virus thành công tôm Ở Việt Nam Nghề nuôi tôm Việt Nam thực phát triển vào năm 1987 nuôi tôm thương phẩm phát triển vào năm đầu thập kỷ 90 kỷ trước Đến thập kỷ 90 (1994 – 1995) phát triển ni tơm Việt Nam có phần chững lại gặp phải nạn dịch bệnh tôm Trong năm 1996 – 1999 dịch bệnh có giảm tiếp tục gây thiệt hại cho người nuôi (Phạm Văn Công, 2007) Năm 2000 xem năm đánh dấu bùng nổ nghề nuôi tôm thương phẩm phủ ban hành nghị 09 cho phép chuyển đổi phần diện tích trồng lúa, làm muối suất thấp, đất hoang hố sang NTTS (Tạp Chí Thuỷ Sản, số 6, 2007) Theo Hanafi & T Ahmad (1999) (trích dẫn từ Lê Khanh (2006)) diện tích nuôi tôm Việt Nam tăng từ 250.000 năm 2.000 sang 478.000 năm 2001 540.000 năm 2003, diện tích ni tơm tiếp tục LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Cột 5: mẫu nhiễm IHHNV nặng Cột 6: mẫu nhiễm IHHNV trung bình Cột 7: mẫu nhiễm IHHNV nhẹ Cột 8: mẫu không nhiễm IHHNV Cột M: trọng lượng phân tử đánh dấu 848, 630, 333bp 3.2.2 Kỹ thuật mô học: (phương pháp Lightner, 1996) Dụng cụ hố chất: Dụng cụ: tiểu phẩu, kính hiển vi, máy cắt lát, lame, lamelle, khuôn đúc, khai nhuộm, máy ảnh, … Hoá chất: dung dịch cố định Davidson’s, nước cất, cồn tuyệt đối, xylen, parafin, thuốc nhuộm Hematoxylin & Eosin, keo Canada palsam, … Phương pháp làm tiêu mô học Cho tôm post trực tiếp vào dung dịch cố định Davidson’s vòng 12 đến 24 giờ, sau mẫu chuyển sang giữ cồn 70o Xử lý mẫu trìnhliệu xử lýĐH mẫu Cần mơ tơmThơ (Coolidge Howard, 1997) đặt cứu Trung tâmQui Học @ Tài liệu học tập vàcàinghiên máy xử lý mô theo bước: STT Hoá chất sử dụng Thời gian (phút) 10 11 12 Cồn 80o Cồn 95o Cồn 95o Cồn 100o Cồn 100o Cồn 100o Cồn 100o Xylen Xylen Parafin - Xylen (7:3) Parafin - Sáp ong (1: 1) Parafin - Sáp ong (7:1) 30 60 30 60 180 180 180 30 30 60 60 60 Sau hoàn thành bước cài đặt chương trình xử lý mơ tiến hành cho sọt chứa mẫu mô vào lọ số cho chương trình cài đặt vận hành Đúc khối: 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sau q trình xử lý, chuyển khn nhựa chứa mẫu sang vị trí số máy đúc khối Để khối mơ parafin khoảng 30 phút, sau tiến hành đúc khối Mẫu mô đặt khung cố định inox tiến hành đúc khối parafin nóng chảy 65oC Định hướng mẫu mơ cho đúng, cẩn thận cho paraffin nóng chảy vào khn Để đảm bảo mẫu giữ vị trí cho khuôn đúc qua khu vực làm lạnh nhanh để cố định vị trí khn Đặt khn nhựa xử lý có kí hiệu lên trên, cho thêm parafin để cố định khuôn nhựa Tiếp theo đặt khuôn mẫu qua ngăn làm lạnh nhanh để parafin rắn lại, sau tách khối parafin có chứa mẫu khỏi khuôn Cắt lát mẫu mô Chuẩn bị máy cắt Đặt dao vào máy cắt vặn ốc thật chặt Độ lệch lưỡi dao với mặt cắt khối mẫu tạo thành góc khoảng 15- 30 o Cắt mẫu Trước tiến hành cắt mẫu, phải điều chỉnh độ dày lát cắt Có thể bắt đầu lát cắt 10- 12µm Sau khối mẫu đạt đến vị trí mong muốn điều chỉnh độ dày lát cắt khoảng 4µm tiến hành cắt lát mẫu cắt vào phiến kính@ Tài liệu học tập nghiên cứu Trung tâm HọcDán liệulátĐH Cần Thơ Chuẩn bị chậu nước ấm 40 – 50 oC lát cắt thả thẳng nước ấm, nhúng phiến kính vào bên lát cắt Cẩn thận đính đầu lát cắt vào phiến kính, điều chỉnh lát cắt hướng, từ từ rút phiến kính khỏi nước, lát cắt dán chặt vào phiến kính Sau dán lát cắt, tiến hành làm khô tiêu khoảng 12 tủ sấy nhiệt độ 37oC sấy khô bàn sấy 45- 60oC để loại bỏ parafin Nhuộm tiêu bản: theo Mayer’s gồm bước sau: STT Hoá chất sử dụng Thời gian (phút) Xylen Xylen Xylen Cồn 100o Cồn 100o Cồn 70o Nước cất Haematoxylin Nước máy 5 5 5 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 10 11 12 13 14 15 16 17 1% acid alcohol Nước máy Eosin Cồn 95o Cồn 100o Cồn 100o Xylen Xylen 10 giây 5 5 Dán tiêu bản: Sử dụng keo Canada để dán tiêu vĩnh viễn Nhỏ giọt keo lên lam có chứa mẫu, dán lamelle lên vùng có miếng mơ Thao tác cần làm nhanh để tránh xâm nhập nước khơng khí vào miếng mơ Đọc kết quả: Tiêu quan sát kính hiển vi có độ phóng đại 40X - 100X Hình chụp vật kính 100X thấy xuất dấu hiệu bệnh quan tôm Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết xét nghiệm PCR Qua 66 mẫu tôm sú giống hộ dân mang lên xét nghiệm PCR (WSSV, IHHNV, YHV) từ tháng 03/ 2008 đến tháng 04/2008 15 mẫu dương tính với IHHNV âm tính với tác nhân WSSV, YHV Cột 1: Thang AND Cột 2: Đối chứng dương Cột 3: Đối chứng âm Cột 4: Mẫu dương tính Cột 4: Mẫu dương tính Cột 5: Mẫu âm tính Trung tâm 4.2 HọcKếtliệu Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu ĐH mô học 4.2.1 Những biến đổi mô học lớp biểu mô vỏ tôm sú nhiễm IHHNV Lớp biểu mô vỏ quan đích mà IHHNV cơng Lớp cấu tạo nhiều tế bào biểu mô Kết quan sát mô học cho thấy hầu hết mẫu nhiễm IHHNV xuất thể vùi Thể vùi IHHNV có dạng trịn, nhân tế bào phình to bắt màu hồng đậm với eosin Hình 4.1: Lớp biểu mơ vỏ tôm nhiễm IHHNV, mũi tên thể vùi IHHNV (E100) 16 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Trong nghiên cứu IHHNV tơm lai P esculentus x P.monodon Úc Owens & ctv (1992) tìm thấy thể vùi Cowdry loại A lớp biểu mô vỏ Thể vùi ưa eosin làm nhân phình to, nằm trung tâm nhân Ngồi ơng cịn tìm thấy thể vùi quan: mang, lớp biểu mô vỏ, tuyến râu, tuyến sinh dục, tim, tổ chức limpho, mô tạo máu, hệ thần kinh, 4.2.2 Những biến đổi mô học mang tôm sú nhiễm IHHNV Cơ quan hô hấp tôm sú mang nằm gốc đôi phần phụ phần đầu ngực, từ đôi chân hàm số đến số Mang cấu tạo sợi mang hình lơng chim Các sợi mang có khung kitin nâng đỡ, mặt sợi mang bao bọc tế bào biểu mơ lát đơn, phía có nhiều mạch máu phân bố Trục mang gắn liền với vách phần đầu xuyên qua cấu trúc dạng ống Những nhánh mang xuất phát từ trục gọi sợi mang sơ cấp Từ sợi mang sơ cấp phân chia thành sợi mang thứ cấp (Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003) Trung Theo kết mô bệnh 15 tôm nhiễm IHHNV, quan sát thấy thể vùi Cowdry loại A tế bào biểu mô mang làm nhân tế bào phì đại, thể vùi ưa eosin nằm trung tâm nhân, tách rời mép rìa nhiễm sắc thể vịng sáng màu.ĐH Mang khơng cịn giữ trúchọc bìnhtập thường số cứu tâmkhơng Họcbắtliệu Cần Thơ @được Tài cấu liệu vànữa, nghiên sợi mang sơ cấp tách rời trục Hình 4.2: Cấu tạo vi thể mang bị nhiễm IHHNV Mũi tên vàng thể vùi Cowdry loại A, mũi tên xanh tế bào mang bình thường ( E100) Lightner et al (1983a) miêu tả biểu bệnh IHHNV tôm P stylirostris mặt mô học hoại tử, viêm sưng lớp biểu mô dày, ruột, mang, cơ, hệ thần kinh, mô liên kết mô tạo máu, đồng thời xuất thể vùi Cowdry loại A nhân tế bào Trong trường hợp này, mẫu tôm sú P 17 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com monodon chưa thấy hoại tử nặng hay viêm sưng quan tôm P stylirostris Sau thí nghiệm Tang et al ( 2003) mô mang tôm cho ăn thức ăn tôm nhiễm IHHNV quan sát thấy thể vùi Cowdry loại A Đặc điểm thể vùi Cowdry loại A Owens et al (1992) mô tả rõ ràng kỹ thuật TEM (Transmission electron microscopy) mang tôm lai P esculentus x P monodon Thể vùi ưa eosin làm nhân lớn dần theo trình phát triển bệnh, tách rời mép rìa nhiễm sắc thể vịng sáng khơng nhuộm màu, bên có chứa nhiều virus 4.2.3 Những biến đổi mô học mô liên kết gan tuỵ tôm nhiễm IHHNV Gan nằm phần đầu thể, gan tơm có dạng khối, có nhiều ống nhỏ hay gọi ống tiểu quản kết lại tập trung thành ống đổ vào ruột (Bá, 1978 trích dẫn từ Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003 ) Mô liên kết gan tuỵ nằm ống tiểu quản gan tuỵ có nhiệm vụ liên kết chúng lại Khi nhuộm hematoxylin eosin nhân tế bào bắt màu xanh dương, vùng tế bào chất với lưới nội chất có màu xanh nhạt hay tím Trung Qua kết quan sát mơ liên kết gan tuỵ tôm sú nhiễm IHHNV xuất thể vùi Cowdry loại A Thể vùi khơng tìm thấy tế bào gan tâmtuỵHọc Thơ Tài liệu tập nghiên liệu tổĐH chứcCần limpho Đồng@ thời, mơ liênhọc kết cịnvà có tượng cứu hoại tử làm liên kết ống tiểu quản gan tuỵ tạo nhiều khoảng trống ống Hình 4.3: Thể vùi Cowdry loại A mô liên kết gan tuỵ hoại tử với nhiều khoảng trống Mũi tên thể vùi Cowdry loại A (E100) Trong số nghiên cứu trước tôm P stylirostris tôm thẻ chân trắng (P.vannamei) Timenez, 1999 cho biết thể vùi IHHNV thường xuất mô liên kết gan tuỵ Tuy nhiên, Hsieh et al (2006) 18 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com nghiên cứu IHHNV tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) tìm thấy thể vùi Cowdry loại A tế bào biểu mô gan Thể vùi làm nhân phình to Trong nghiên cứu bệnh IHHNV tôm lai Úc, Owens et al (1992) phát thể vùi Cowdry xuất tổ chức limpho Tương tự, Maria & Cristina (1999) phát thể vùi tổ chức limpho tôm P vannamei nhuộm Mayer- Bennet + Hematoxylin & Eosin với tượng tạo spheroids Năm 2006, Hsieh et al cho biết IHHNV gây tỷ lệ chết cao tôm post Macrobrachium rosenbergii P stylirostris quan đích khác Nghiên cứu sâu mức độ phân tử, Hsieh et al (2003) cho biết dịng virus IHHN tơm xanh có trình tự nucleotit tương đương với IHHNV tôm sú P monodon Đài Loan 99,7% 4.2.4 Những biến đổi mô học tuyến râu tôm sú nhiễm IHHNV Trung Tuyến râu quan tiết tôm, nằm phần đầu gần gốc râu gồm đôi tuyến nằm gốc râu II, ống dẫn chất tiết ngắn đổ qua lỗ tiết nằm mặt đốt gốc thứ hai râu Ống tiết nằm khắp nơi phần đầu, xếp đường rối hỗn độn phức tạp, hai trạng tâmthái Học liệutiếtĐH Cầnxuất Thơ Tài học nghiên xuất không tiết.@ Cấu tạo liệu ống tiết tập đơn giản, bao xung cứu quanh ống tiết tế bào biểu mô, tế bào có dạng hình khối lập phương hay hình cột Đặc điểm tế bào có nhân trung tâm hạch nhân rõ (Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003) Quan sát tiêu mô học tuyến râu tơm sú tìm thấy thể vùi IHHNV Thể vùi làm nhân trương to chiếm tồn nhân Lúc khơng nhìn thấy hạch nhân tế bào Đặc điểm thể vùi quan tương tự thể vùi quan khác Hình 4.4: Tuyến râu tơm sú nhiễm IHHNV Mũi tên vàng thể vùi IHHNV, mũi tên xanh tế bào tuyến râu bình thường (E100) 19 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nghiên cứu IHHNV tôm P stylirostris Lightner et al (1983), tôm lai P esculentus x P monodon Owen et al (1992), Maria & Cristina (1999) P vannamei, tôm M rosenbergii Hsieh et al (2006),…đều phát thể vùi Cowdry loại A tuyến râu Đặc điểm thể vùi tương tự đặc điểm thể vùi tôm sú P monodon mà quan sát 4.2.5 Những biến đổi mô học tôm sú nhiễm IHHNV Quan sát tiêu mô học mặt cắt dọc ta thấy sợi cơ, mặt cắt ngang bó Nhân tế bào bắt màu tím hematoxylin & eosin cịn sợi hay bó bắt màu hồng Chức bảo vệ phần nội quan bên đồng thời thực chức co giản (Lightner, 1988) Trung Virus IHHN công vào nhân tế bào tạo thể vùi nhân phì đại Nhưng mức độ tổn thương tùy vào mức độ nhiễm bệnh Với 15 mẫu tôm nhiễm IHHNV, qua quan sát mô học chúng tơi nhận thấy có xuất thể vùi nhân tế bào với mức độ Trong trường hợp ảnh hưởng IHHNV lên tế bào mức độ nhẹ Cùng chung nhận định đó, nghiên cứu IHHNV tôm lai, Owens et al (1992) có mơ tả thể vùi Cowdry loại A nhiều quan (lớp biểu mô vỏ, mô tạo máu, mang, mơ liên kết gan tụy, …) thấy thể vùi xuất cơ.liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu tâmhiện Học A B Hình 4.5: (A) Cơ tơm sú bình thường; (B) Cơ tôm sú bị bệnh, mũi tên thể vùi IHHNV Mặt khác, nghiên cứu IHHNV tôm xanh, Hsieh ctv (2006) ghi lại biến đổi hoại tử hố lỏng phần đốt bụng Tuy nhiên khơng tìm thấy thể vùi phần 4.2.6 Những biến đổi mô học quan tạo máu tôm sú nhiễm IHHNV 20 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Mô tạo máu quan tạo tế bào máu mới, đóng vai trị quan trọng việc tuần hồn, phục hồi vết thương, đơng máu, thực bào kết nang vật chất sống (Fontaine & Lightner, 1973) Mô tạo máu quan mà IHHNV công gây tổn thương tôm P stylirostris (Lightner, 1983) Thật vậy, qua kết quan sát tiêu mô học mô tạo máu thấy xuất thể vùi IHHNV Đặc điểm thể vùi thể vùi ưa eosin nằm trung tâm nhân, làm nhân phì đại Theo Owens & ctv (1992) nghiên cứu IHHNV tơm lai IHHNV biểu thể vùi nhiều quan khác như: tế bào hệ thần kinh, tuyến sinh dục tổ chức limpho Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Hình 4.6: Mơ tạo máu nhiễm IHHNV Mũi tên vàng tế bào mô tạo máu với thể vùi IHHNV.Mũi tên xanh tế bào mơ tạo máu bình thường (E100) 21 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương 5: KẾT LUẬN & ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Khi tôm sú (P monodon) bị bệnh IHHNV biểu mức độ vi thể tạo thể vùi IHHNV nhân phì đại tế bào biểu mô vỏ, mang, quan tạo máu, tuyến râu, cơ, mơ liên kết gan tuỵ Bên cạnh cịn có tượng hoại tử tuyến râu mô liên kết gan tụy 5.2 Đề xuất Nghiên cứu chi tiết thay đổi cấu trúc vi thể quan hoại tử mức độ nhiễm bệnh IHHNV Quan sát biến đổi mô học tôm nhiễm IHHNV giai đoạn khác Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 22 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Quang Tề 2003 Bệnh Học Thuỷ Sản Nhà xuất Nơng nghiệp, Thành Phố Hồ Chí Minh Bùi Quang Tề 2006 Bệnh Học Thuỷ Sản Nhà xuất Nơng nghiệp, Thành Phố Hồ Chí Minh Bùi Thị Bích Hằng Timothy W Fleg 2007 Nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng virus gây bệnh hoại tử quan tạo máu vỏ (IHHNV) tôm Penaeid Tạp chí khoa học 2008(1): 170- 175 Bell, T A and Lightner, D V 1984 IHHNV: Infectivity and Phathogenicity studies in Penaeus stylirotris and Penaeus vannamei Aquaculture 38: 185- 194 Bell & Donald V Lightner 1988 A handbook of normal Penaeid Shrimp Histology Published By The World Aquaculture Society Trung tâm6.Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Bonami, J R., Trumper, B., Mari, J., Brehelin, M and Lightner, D V 1990 Purification and characterization of the infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus of Penaeid shrimp Journal of general Virology 71: 2657- 2664 Carpenter, N and Brock, J A (1992) Growth and survival of virusinfected and SPF Penaeus vannamei on a shrimp farm in Hawaii Aquaculture 285- 293 Chayaburakul, K., Lightner, D V., Sriurairattana, S., Tang, K F and Withyachumnarnkul, B 2005 Different Reponses To Infectious Hypodermal And Haematopoietic Necrosis Virus In Penaeus monodon and Penaeus vannamei Diseases of Aquatic Organisms 67:191-200 Chia Y Hsieh, Po C Chuang, Li C Chen, Chien.Tu, Maw S Chien, Kwo C.Huang, Hui F Kao, Ming C Tung, Shinn S Tsai 2006 Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) infections in giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii Aquaculture (Amsterdam) 258: – 22 23 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 10 Flegel, T W 1997 Special topic review: Major Viral Diseases Of The Black Tiger Prawn (P Monodon) In Thai Lan World J Microbiol Biotech , 13: 433- 442 11 Jimenez, R., Barniol, R., De Baniol, L and Machuca, M 1999 Infection of IHHNV in two species of cultured penaeid shrimp Litopenaeus vannamei and Liopenaeus stylirostris in Ecuador 30: 695- 705 12 Kalagayan, G, Godin, D, Kanna, R, Hagio, G, Sweeney, J, Wyban, J and Brock, J 1991 IHHNV As An Etiological Factor In Runt- deformity Syndrome Of Juvenile P Vannamei Cultured In Hawaii Journal of the Word Aquaculture Society 22:235-243 13 Kathy F J Tang, Bonnie T Poulos, Jun Wang, Rita M Redman, Hsiu-Hui Shih, Donald V Lightner 2003 Geographic Variations Among Infectious Hypodermal And Hematopoietic Necrosis Virus (IHHNV) Isolates And Characteristics Of Their Infection Vol 53: 91 – 99 14 Lightner, D V, Redman, T A 1983 Detection of IHHN virus in Penaeus stylirostris and Penaeus vannamei imported into Hawaii Aquaculture 14: Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 212- 225 15 Lightner, A V., Redman, E M and Bell, T A 1983 Infectious Hypodermal And Haematopoietic Necrosis, a newly recognized virus of Penaeid shrimp Aquaculture 42: 62- 70 16 Lightner, D V., Bell, T A., Redman, R M., Mohney., and Poernomo, A 1992 A review of some major diseases of economic significance in penaeid pawns of the Americas and Indopacific In: M Shariff, R.P Subasinghe and J.R Arthur (eds.) Diseases in Asian Aquaculture I Fish Health Section, Asian Fisheries Society Manila, Philippines, p 57-80 17 Lightner, D V 1996 A hanbook of pathology and diagnostic procedures for diseases of penaeid shrimp World Aquaculture Society, Baton Rouge 18 Lightner, D V 1999 The Penaeid Shrimp Viral Pandemics due to IHHNV, WSSV, TSV, and YHV History in the Americas and Current Status 24 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com in the Americas, available diagnostic methods and management strategies Journal of Applied Aquaculture 9: 27-52 19 Lê An 2007 Tôm Thẻ Chân Trắng, Những Vấn Đề Cần Quan Tâm http://www.fistenet.gov.vn Truy Cập ngày 24 05 2008 20 Lê Khanh 2006 Hiện Trạng Nuôi Tôm Ở Việt Nam – Cơ Hội Và Những Thách Thức http://www.fistenet.gov.vn Truy cập ngày 24 05 2008 21 Maria Soledad Morales-Covarrubias And Cristina Chavez-Sanchez.1999 Histopathological Studies on Wild Broodstock of White Shrimp Penaeus vannamei in the Platanitos Area, Adjacent to San Blas, Nayarit, Mexico Journal of Aquatic Animal Health 30: 192 – 200 22 Melena, J., Bayot , B., Betancourt, I., Amano, Y., Panchana, F.,Alday, V., S Stern, S., Bonami, J R 2005 Pre-exposure to infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus or to inactivated white spot syndrome virus (WSSV) confers protection against WSSV in Penaeus vannamei (Boone) Journal of fish disease 32: 226- 356 Trung tâmpost-larvae Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 23 Nguyễn Văn Hảo 1999 Nghiên Cứu Bệnh Trên Tôm Sú Nuôi Tại Trà Vinh Bằng Phương Pháp Mô Học Và PCR 24 Nuna, L M, Poulos, B T and Lightner D V 2000 Use Polymerase Chain Reaction For The Detection Of Infectious Hypodermal And Haematopoietic Necrosis Virus In Penaeid Shrimp Dis Aquat Org 27, 59–66 25 Nguyễn Thị Ngọc 2007 Nuôi Tôm Bền Vững, Xu Hướng Hiện Nay http://www.hcmbiotech.com.vn Truy cập ngày 12 03 2008 26 Owens, L., I.G Anderson, M Kenway, L Trott and J.A.H Benzie 1992 Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) in a hybrid penaeid prawn from tropical Australia Diseases of Aquatic Organisms 14: 219-228 27 Owens, L., Krabsetsve, K., Bradford R C 2004 Rediscovery of the Australian Strain Of Infectious Hypodermal And Haematopoietic Necrosis Virus Diseases of Aquatic Organisms 61: 153 – 158 25 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 28 Primavera, J H and Quinitio, E T 2000 Runt- deformity sydrome in cultured giant tiger prawn Penaeus monodon Marine Freshwater Behaviour Physiology 33: 173-185 29 Phạm Trần Nguyên Thảo 2003 Ứng Dụng Kỹ Thuật Mơ Học Trong Chẩn Đốn Bệnh Đốm Trắng Tôm Sú (Penaeus monodon) Phạm Văn Công 2007 Hiện Trạng Nghề Nuôi Tôm Ở Việt Nam http://www.fistenet.gov.vn Truy cập ngày 12 03 2008 30 Shike, H., Dhar, A K., Burns, J C., Shimizu, C., Jousset, F X., Klimple, K R and Bergoin, M 2000 Infectious Hypodermal And Haematopoietic Necrosis Virus of Shrimp is related to mosquito Brevidensoviruses 31 Tratschin, J D., Miller, I L and Cater, B J 1984 Genetic analysis of adeno- associated virus: Properties of deletion mutants constructed in vitro and evidence for an adeno- associated virus replication function 51: 611-619 32 Tang, K.F.J., and D.V Lightner 2003 Low sequence variation among Infectious Hypodermal Necrosis Trung tâmisolates Học ofliệu ĐH Cần Thơ and @Hematopoietic Tài liệu học tập Virus nghiên cứu (IHHNV) originating from Hawaii and the Americas Dis Aquat Org 49: 9397 33 Tạ Quang Ngọc 2007 Thành Tựu Khoa Học Và Công Nghệ Ngành Thủy Sản Sau 20 Năm Đổi Mới Và Định Hướng Phát Triển Trong Thời Gian Tới Tạp Chí Thủy Sản Số 6, 44: 2- 34 Vũ Đỗ Hòa 2001 Ứng Dụng Phương Pháp Mô Bệnh Học Trong Việc Xác Định Cường Độ Cảm Nhiễm Bệnh MBV Trên Tôm Sú 35 Vega- Villasante, F and Puente, M E 1995 A review of viral diseases of cultured shrimp Comparative Biochemistry and Physiology 17: 271- 282 36 Trần Thị Tuyết Hoa 2004 Giáo Trình Sinh Học Phân Tử 37 Wang, C S., K F Tang, G H Kou & S N Chen 1997 Light and electron microscopic evidence of white spot disease in the giant tiger shrimp, 26 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Penaeus monodon (Fabricius), and the kuruma shrimp, Penaeus japonicus (Bate), cultured in Taiwan Journal of fish Diseases 20: 323- 331 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 27 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ...TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THUỲ NGÂN TÌM HIỂU ĐẶC ĐIỂM MƠ BỆNH HỌC Ở TƠM SÚ (P. monodon) BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU VÀ CƠ QUAN LẬP BIỂU MÔ (IHHNV – Infectious Hypodermal... tơm sú bệnh hoại tử quan tạo máu quan lập biểu mô (IHHNV)” thực Mục tiêu: Mô tả đặc điểm mô bệnh học tôm sú nhiễm IHHNV Việt Nam Nội dung: Xét nghiệm IHHNV tơm sú giống PCR nhằm tìm mẫu bị bệnh. .. cá, tôm, nhuyễn thể (Lightner and Bell, 1988) Để ứng dụng mơ bệnh học vào việc chẩn đốn tác nhân gây bệnh IHHNV tơm sú tìm hiểu đặc điểm mô học virus đề tài ? ?Tìm hiểu đặc điểm mơ bệnh học tơm sú