Phân tích chỉ tiêu Aspergillus trong sản xuất nước tương

Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, gia vị sử dụng nhiều chế biến thực phẩm bữa ăn hàng ngày người Việt Trong có nhiều sản phẩm gia vị làm từ phương pháp lên men truyền thống nước mắm, nước tương,… Nước chấm từ thực vật ngồi vai trị cung cấp mùi vị, cịn cung cấp cho thể người lượng protein định số khoáng chất cần thiết cho thể Nước tương lên men loại nước chấm giàu chất dinh dưỡng, có hương vị thơm ngon Từ xưa người biết cách sản xuất nước tương cách lên men truyền thống từ đậu nành Tuy nhiên phương pháp cho suất thấp, thời gian lên men kéo dài chất lượng không ổn định, đơi lúc cịn nhiễm loại nấm mốc Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin gây ung thư (Nguyễn Đức Lượng, 2002) Mặt khác phổ biến thị trường nước chấm sản xuất phương pháp hóa giải, hàm lượng dinh dưỡng thấp, chứa chất bảo quản chứa hàm lượng cao chất 3-MCPD, 1.3-DCP, độc tố Aflatoxin… chất gây ung thư Để khắc phục nhược điểm người ta tìm chủng Aspergillus oryzae có hoạt tính cao enzyme Amylase Proteinase thích hợp cho việc làm tương Mặc dù, nấm sợi Aspergillus orysae có hình thái, màu sắc gần giống với nấm sợi Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae không sản sinh độc tố gây ung thư nấm sợi Aspergillus flavus (Nguyễn Lân Dũng, 2007) Loài nấm mốc Aspergillus oryzae tạo nên hướng cho công nghệ làm tương tương lai GVHD: Phạm Minh Nhựt Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương MỤC LỤC Chương I: Tổng quan I.1 Giới thiệu Aspergillus oryzae I.2 Lịch sử phát I.3 Phân loại I.4 Đặc điểm Chương II: Quy trình phân tích tiêu vi sinh II.1 Sơ đồ quy trình phân tích II.2 Thuyết minh quy trình phân tích 10 II.2.1 Nguồn mẫu 10 II.2.2 Phân lập 10 II.2.3 Xác định vi sinh vật 11 II.2.4 Khảo sát đặc tính có lợi Aspergillus oryzae 14 II.2.5 Định danh Aspergillus oryzae kỹ thuật sinh học phân tử 15 Chương III: Ứng dụng Aspergillus oryzae sản xuất nước tương 16 Chương IV: Kết luận đề nghị 20 Tài liệu tham khảo 21 GVHD: Phạm Minh Nhựt Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương Chương I: Tổng quan I.1 Giới thiệu Aspergillus oryzae Giống nấm Aspergillus lên đến 200 lồi, có khoảng 20 lồi gây hại cho người Aspergillus thuộc nhóm vi nấm, khơng có chất diệp lục chúng tự tổng hợp chất dinh dưỡng cho thân mà phải lấy từ chất hữu có sẵn mơi trường để sinh trưởng phát triển Một số giống Aspergillus sử dụng công nghệ lên men, sản xuất enzyme (amylase, protease, pectinase,…) acid hữu (acid citric, acid glucomic,…) có Aspergillus oryzae Chủng Aspergillus oryzae loại nấm sợi quan trọng công nghiệp, cách hàng trăm năm dùng để lên men rượu sake, pate đậu phộng, nước tương Nhật Người ta nhận A.oryzae lên men tương ngon so với số chủng khác chúng có khả biến đổi tinh bột gạo nếp thành đường làm tương có vị Hiện nay, A.oryzae ứng dụng rộng rãi công nghệ lên men truyền thống nhiều nước châu Á Trung Quốc, Nhật Bản, Philippin, Indonesia Việt Nam Cho đến thời điểm chủng nấm mốc A.oryzae sử dụng rộng rãi công nghiệp sản xuất enzyme (α-amylase, glucoamylase) ngành chế biến thực phẩm I.2 Lịch sử phát hiện: Năm 1729, Pier Antonio Micheli nhà thực vật học người Ý khai sinh nấm học qua tài liệu công bố “giống lạ” theo Nguyễn Văn Bá (2009) GVHD: Phạm Minh Nhựt Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương Từ năm 1794-1874, Elias Fries người có cơng nghiên cứu sâu nấm mốc theo Nguyễn Văn Bá (2009) Elizabeth Tootyll cho nấm mốc có khoảng 5100 giống 50000 lồi mơ tả, nhiên ước tính có 100000 đến 250000 lồi nấm diện trái đất theo Nguyễn Văn Bá (2009) Aspergillus trở thành chi tiếng nghiên cứu nhiều theo Nguyễn Thị Thanh Kiều (2011) Năm 1950, A.oryzae phân lập lần đầu Jokichi Takamine nhà khoa học Nhật Bản gọi RIB40 ATCC 42149 theo wikipedia (2014) Năm 2001, gen di truyền A.oryzae phân tích giải mã Hệ gen gồm nhiễm sắc thể với 12 ngàn gene 37 triệu cặp base theo Machida et al (2005) Đến nay, loài A.oryzae ứng dụng nhiều lĩnh vực quốc Hình 1: Bộ gen di truyền A.oryzae gia khác nhau, đặc biệt nước châu Á I.3 Phân loại: GVHD: Phạm Minh Nhựt Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương Loài Aspergillus oryzae thuộc: Lãnh Giới (Domain) Eukarya Giới (Kingdom) Fungi Ngành (Phylum) Ascomycota Lớp (Class) Eurotiomycetes Bộ (Order) Eurotiales Họ (Family) Trichocomaceae Chi (Genus) Aspergillus Loài (Species) Aspergillus oryzae Ngồi A.oryzae chi Aspergillus cịn có số loài đặc trưng như: A.flavus, A.parasiticus, A.niger, A fumigatus, A.versicolor Hình 2: Hình thái khuẩn lạc số lồi thuộc chi Aspergillus GVHD: Phạm Minh Nhựt Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương I.4 Đặc điểm: I.4.1 Đặc điểm hình thái A.oryzae nấm mốc hay cịn gọi nấm sợi, có bào tử, vi sinh vật hồn tồn hiếu khí, khơng có khả di động, tổng hợp chất hữu từ CO2 mà phải sử dụng trực tiếp chất hữu có sẵn mơi trường để phát triển đảm bảo hoạt động bình thường GVHD: Phạm Minh Nhựt Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương Cơ thể sinh trưởng A.oryzae hệ bao gồm sợi mỏng chiều ngang 5-7µm, phân nhánh nhiều, có vách ngang sợi hình thành nhiều bao tế bào Hình 3: Hình thái học Aspergillus oryzae (nấm đa bào) A.oryzae sinh sản bào tử đính (conidia) hình thức sinh sản vơ tính Bào tử đính phát triển từ thành tế bào dày, bên hệ sợi nấm gọi tế bào chân đế Nó tạo thành sợi cuống dài kết thúc cấu trúc phồng hình củ hành gọi bọng (túi) Xung quanh bọng hay hai cuống để đính bào tử gọi cuống đính bào tử hay thể bình Từ cuống ngồi cùng, bào tử sinh đính vào nhau, nên gọi bào tử đính Đính bào tử A.oryzae có màu vàng lục hay màu vàng hoa cau, màu đặc trưng nấm mốc (Nguyễn Đức Lượng et al., 2003) Chú thích hình: Foot cell Tế bào chân đế Stipe Cuống Phialides Bọng (túi) GVHD: Phạm Minh Nhựt Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương Metulac Thể bình (cuống đính bào tử) Conidia Đính bào tử I.4.2 Đặc điểm sinh lý Nấm Aspergillus oryzae có đặc điểm sinh lý sau: Độ ẩm mơi trường tối ưu cho hình thành bào tử: 45% Nhiệt độ thích hợp cho hình thành phát triển bào tử: 27-32oC Độ ẩm môi trường tối ưu cho hình thành enzyme: 55-58% Độ ẩm khơng khí: 85-95% pH mơi trường: pH 5.5-6.5 I.4.3 Đặc điểm sinh hóa A.oryzae có enzyme thủy phân nội bào ngoại bào amylase, glucoamylase, protease, pectinasa, xylanase, hemycenlulase, Trong hệ enzyme amylase tổng hợp từ A.oryzae có hoạt lực cao so với số chủng nấm mốc vi khuẩn khác Ngoài A.oryzae có khả tổng hợp ba loại enzyme protease (acid, kiềm trung tính) Các protease acid, trung tính ứng dụng để sản xuất bia công nghiệp bánh kẹo Protease kiềm ứng dụng công nghệ thuộc da Bào tử A.oryzae có màu vàng hoa cau, không chứa độc tố aflatoxin A.oryzae tiết môi trường enzyme thủy phân cellulase, pectinase, xylanase hemicellulase sống mơi trường có nguồn chất cảm ứng cellulose, pectin, xilan hemicellulose Vì thế, A.oryzae ứng dụng rộng rãi sản xuất, chế biến thực phẩm công nghiệp sản xuất enzyme GVHD: Phạm Minh Nhựt 10 Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương Chương II: Quy trình phân tích tiêu vi sinh Cấy chuyển nhiều lần mẫu cịn dịng khuẩn lạc hồn Lấy 10g mẫu cho vào 90ml nước cất vô trùng, sau đồng mẫu, ta tồn chủng nồng độ pha loãng 10-1 Cấy khuẩn lạc khác vào đĩa petri chứa môi trường Czapek Tiếp tục pha lỗng nồng độ pha lỗng thích hợp Ủ nhiệt độ 25oC ngày Hút 0.1ml mẫu cấy trang vào môi trường PGA Khuẩn lạc đặc trưng A.oryzae mơi trường Czapek: có màu vàng Ủ nhiệt độ 32oC từ 5-7 ngày lục, dạng bột rời, tâm lồi, rìa thấp dần, ngồi lớp tơ trắng Quan sát phát triển nấm mốc cấy chuyển tiếp khuẩn lạc Kiểmvề trahình khảthái sinh aflatoxin khác vào cácđộc đĩatốmôi trường PGA Ủ nhiệt độ 27-32oC ngày II.1 Sơ đồ quy trình phân tích II.2 Thuyết minh quy trình phân tích II.2.1 Nguồn mẫu Nguồn mẫu: lấy 50g mẫu đậu phộng giữ lâu kho  cho vào túi nylon vô trùng  bỏ vào thùng đá chuyển phịng thí nghiệm, giữ lạnh 4oC Các mẫu cần phân lập không giữ 24 Lý thu mẫu: mẫu đậu phộng để lâu ngày dễ sản sinh số loại nấm Bên cạnh đó, cịn nguồn giàu enzyme amylase nguồn mẫu thích hợp cho việc phân lập chủng nấm mốc, đặc biệt Aspergillus GVHD: Phạm Minh Nhựt 11 Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương II.2.2 Phân lập a) Chuẩn bị mẫu: Cân xác 10g mẫu đậu phộng cho vào bao PE vơ trùng, sau cho 90ml nước cất để pha loãng mẫu Tiến hành đồng mẫu máy dập mẫu (stomacher) Tất thao tác phải thực điều kiện vơ trùng Khi đó, ta dung dịch có nồng độ pha loãng 10-1 Dịch pha loãng pha loãng theo dãy thập phân cách dùng micropipette vô trùng, hút 1ml dung dịch 10-1 cho vào 9ml nước cất vơ trùng  đồng nhất, ta có nồng độ pha loãng 10-2 Tiếp tục thực đến đạt độ pha loãng cần thiết b) Cấy mẫu: Dùng micropipette hút 0.1 ml dung dịch mẫu pha lỗng cho vào mơi trường PGA Dùng que cấy tam giác trang bề mặt khơ Ủ nhiệt độ phịng (30oC) vịng từ 5-7 ngày c) Phân lập làm thuần: Quan sát phát triển nấm mốc (hình dạng khuẩn lạc) Cấy chuyển khuẩn lạc khác hình thái vào đĩa môi trường PGA khác Ủ nhiệt độ 2732oC ngày Cấy chuyển tiếp nhiều lần thu đĩa petri dịng khuẩn lạc hồn tồn chủng Cấy dòng khuẩn lạc từ đĩa petri khác vào đĩa petri khác có chứa mơi trường Czapek, ủ 25oC ngày Nhiệt độ thích hợp cho hình thành phát triển A.oryzae 27-32oC GVHD: Phạm Minh Nhựt 12 Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương Khi cấy vào môi trường Czapek nhiệt độ nấm mốc tỏa lên tới 40oC Vì cần hạ nhiệt độ xuống 25oC để giữ nhiệt độ thích hợp cho nấm mốc A.oryzae phát triển d) Quan sát: Quan sát khuẩn lạc từ đĩa chứa môi trường Czapek Tìm khuẩn lạc đặc trưng A.oryzae môi trường Czapek II.2.3 Xác định vi sinh vật a) Quan sát khuẩn lạc (đại thể): Kích thước: khuẩn lạc có kích thước khoảng 5-6cm Hình dạng: khuẩn lạc tâm lồi, dạng bột rời, rìa thấp dần, ngồi lớp tơ Màu sắc: khuẩn lạc ban đầu có màu vàng lục, sợi tơ có màu trắng Sau thời gian khuẩn a) b) Hình 4: Khuẩn lạc Aspergillus oryzae có màu vàng lục (a) sau ngày Màu vàng lục nâu (b) sau ngày nuôi cấy môi trường Czapek lạc chuyển thành màu vàng lục nâu, sợi tơ hình thành bào tử có màu nâu b) Quan sát bào tử (vi thể): GVHD: Phạm Minh Nhựt 13 Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương Các bước tiến hành làm tiêu bản: Cách 1: Làm tiêu nấm mốc không nhuộm màu: ➢ Nhỏ giọt lactophenol lên lame ➢ Dùng que cấy lấy khuẩn lạc nấm mốc dàn mỏng ➢ Đậy lamelle quan sát vật kính X10 X40 Cách 2: Làm tiêu bàn nấm mốc nhuộm màu: ➢ Nhò giọt dung dịch xanh cotton lên lame ➢ Lấy sợi nấm dàn lame ➢ Đậy lamelle quan sát vật kính X40 Hình dạng sợi nấm quan sát kính hiển vi: Đầu: Lúc đầu có dạng hình cầu, sau thời gian bị tách thành chuỗi bào tử dài Cuống Bề mặt cuống có gai mịn Bọng Dạng hình cầu Thể bình Có thể bình tầng thể bình hai tầng Thể bình tầng: có dạng hình chai Thể bình hai tầng: lớp 1: dạng hình trụ; lớp 2: dạng hình chai GVHD: Phạm Minh Nhựt 14 Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương Dạng hình cầu, bề mặt có gai mịn, có kích thước lớn, màu vàng Bào tử b) a) Hình 5: A.oryzae lúc đầu có bơng hình cầu (a), sau thời gian bị tách thành chuỗi bào tử dài (b) Hình 6: Cấu tạo bơng lớn với thể bình hai tầng bọng có hình cầu Hình 7: Cấu tạo bơng nhỏ với thể bình tầng nâu, sau thời gian ni gai trở nên xù xì, vách dày c) Thử nghiệm sinh độc tố aflatoxin: Có thể xác định độc tố aflatoxin phương pháp: phương pháp sắc ký phương pháp hóa miễn dịch: Các phương pháp sắc ký dùng phân tích aflatoxin gồm: TLC, HPLC, GCMS, LC, LC-MS Và có nhiều kỹ thuật phát triển từ phương pháp LC/APCI-MS/MS, HPLC-FLD, LC/APPI-MS, GVHD: Phạm Minh Nhựt 15 Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương Có phương pháp hóa miễn dịch để xác định aflatoxin thử nghiệm miễn dịch phóng xạ (RIA), thử nghiệm hấp thu miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) thử nghiệm cột lực miễn dịch Phát độc tố phương pháp sắc kí cột (sắc kí cột mini) Phương pháp sắc kí cột mini Romes (1975) sau Davis et al., (1980), Holaday Lansden (1975) cải tiến nhằm phát nhanh aflatoxin mẫu Mục đích: xem vi sinh vật có khả sản sinh độc tố aflatoxin hay không Cách tiến hành: Lấy sinh khối từ mơi trường Czapek hịa vào lượng nhỏ benzen hỗn hợp dịch Cho hỗn hợp vào cột Pha tĩnh sử dụng cột sắc kí chứa bột nhơm trung tính, florisil đáy cột, canxi sunfat đầu đáy cột silicagel làm chất hấp thụ Sau cho hỗn hợp thơi cột (pha động) chloform aceton (9:1) để giữ aflatoxin chất khác khỏi cột Quan sát ánh sáng UV (365nm) để xác định màu huỳnh quang xanh, kết luận dương tính với aflatoxin Đối với Aspergillus oryzae: không sản sinh độc tố aflatoxin nên không phát huỳnh quang  âm tính (-) III.2.4 Khảo sát đặc tính có lợi Aspergillus oryzae Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có khả thủy phân liên kết β-glucoside, endo-β-1.4- glucanase ứng dụng nhiều lĩnh vực: _ Trong công nghệ sản xuất giấy bột giấy: loại enzyme bổ sung khâu nghiền bột, tẩy trắng xeo giấy có vai trị quan trọng, gỗ xử lý với endoglucanase hỗn hợp enzyme hemicellulase, pectinase làm tăng khả GVHD: Phạm Minh Nhựt 16 Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương khuếch tán hóa chất vào phía gỗ hiệu khử lignin Trong cơng nghệ tái chế giấy, endoglucanase hemicellulase dùng để tấy trắng mực in giấy Kỹ thuật mở triển vọng đầy hứa hẹn ngành công nghiệp giấy bột giấy (Đặng Thị Thu et al., 2004) _ Trong công nghiệp chế biến thực phẩm: enzyme glucanase pectinase phá hủy hoàn toàn màng tế bào, làm giảm độ nhớt tăng độ đồng thể loại nước có thịt tốt _ Trong công nghệ sản xuất bia: chế phẩm enzyme amylase, protease glucanase sử dụng để ngăn chặn tạo thành diacetyl, giúp rút ngắn thời gian để ủ bia _ Trong sản xuất cà phê Việt Nam: sử dụng kết hợp phức hệ enzyme cellulase pectinase để xử lý bóc vỏ cà phê tăng khả ly trích dịch cơng nghệ sản xuất cà phê _ Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi: bổ sung enzyme β-glucanase trực tiếp vào thức ăn cho phép tăng hấp thu chuyển hóa thức ăn động vật _ Trong cơng nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ: bổ sung enzyme phá hủy thành tế bào cellulase, hemicellulase giúp tăng lượng đường tạo dẫn tới tăng hiệu suất thu hồi rượu lên 1.5% (Đặng Thị Thu et al., 2004) _ Trong công nghệ sử lý nước thải sản xuất phân bón vi sinh: sản xuất enzyme cellulase thủy phân cellulose rác thải Vì vậy, nước thải nhà máy giấy, sở chế biến gỗ, xưởng mộc bổ sung chế phẩm chứa phức hệ cellulase đem lại hiệu cao (Trần Đình Toại Trần Thị Hồng, 2007) GVHD: Phạm Minh Nhựt 17 Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương III.2.5 Định danh Aspergillus oryzae kỹ thuật sinh học phân tử Để định danh chủng nấm mốc mà ta nuôi cấy kỹ thuật sinh học phân tử người ta thường dựa đoạn gene 28S rRNA mẫu nấm, thực theo giai đoạn sau: _ Đầu tiên, lấy DNA mẫu nấm mốc tách chiết đệm TENS đem kết tủa iso-propanol Tủa DNA pha với đệm TE cho chạy điện di gel agarose 0.8% cho thấy DNA tinh đủ để tiến hành đọc trình tự Vệt nucleic acid nhuộm ethydium bromide cho vệt màu đỏ da cam chiếu UV (260nm) Hình 8: phân tách DNA điện di agarose Sau điện di vạch có kích thước khoảng 614 bp xuất (hình 8) _ Giai đoạn thứ 2: Đoạn DNA vừa tách nhân lên kỹ thuật PCR với cặp mồi AOIII.1.29 Những đoạn DNA dùng để giải trình tự Nucleotide phương pháp Sanger cải tiến _ Giai đoạn thứ 3: Từ trình tự Nucleotide vừa giải liệu gene chủng A.oryzea so sánh với trình tự gene 28S rRNA chủng nấm công bố ngân hàng gene cơng cụ BLAST Từ tính tốn tương đồng xét quan hệ họ hàng thông qua phân loại loài nhờ phần mềm DNAstar GVHD: Phạm Minh Nhựt 18 Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương _ Cuối cùng, kết hợp kết xét nghiệm sinh học phân tử vừa thực với kết quan sát hình thái học mẫu nấm mốc thực từ trước ta định danh xác tên lồi nấm mốc ta phân lập Chương III: Ứng dụng Aspergillus oryzae sản xuất nước tương Sơ đồ quy trình chế biến nước tương từ nấm A.oryzae Gạo nếp Đậu nành Ngâm nước (từ 8-12giờ) Làm Sấy to=180-200oC Mốc giống Hấp A oryzae Làm nguội Cấy giống Tạp chất Nuôi mốc (từ 3638giờ, to=30oC) ( từ 45-60phút) Nghiền thành bột Thuỷ phân( tỷ lệ nước 1:5, đun sôi từ 45-60 phút) Để nguội t0 = 30-350C đậu nành:gạo nếp tỷ lệ (9:1) Phối trộn Nước GVHD: Phạm Minh Nhựt 19 lượng nước = (60-70%) / tổng ng.liệu Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương Ủ t = 3-7 ngày t0= 37-450C mốc vàng hoa cau Nước Thủy phân t0= 40-500C bổ sung 40-50% Lọc thô Phụ gia t0= 90-1000C t = 3-4 ngày Bã Phối chế Thanh trùng t = 20 phút Để nguội Chất bảo quản Chai, nút Lắng Cặn Rửa Lọc tinh Thanh trùng Làm nguội Chiết chai Nước tương GVHD: Phạm Minh Nhựt 20 Bã Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương Quy trình chế biến nước tương từ nấm A.oryzae gồm giai đoạn chính: Giai đoạn 1: Quy trình ni mốc gồm bước: tạo mơi trường nuôi mốc, cấy giống, nuôi mốc phối trộn Tạo môi trường nuôi mốc với nguyên liệu gạo nếp, sau ngâm nước từ 8-12 hấp từ 3-4 áp suất thường từ 1-2 với áp suất cao, với nhiệt độ lớn hơn 100oC Sau làm nguội 30-32oC, nhiệt độ để nấm mốc phát triển cấy nấm mốc vào Cấy nấm mốc vào nuôi khoảng thời gian từ 36-38 giờ, sau ta cịn thuỷ phân nên ni thời gian này, hoạt động amylase protease cực đại Cuối thực phối trộn để chuản bị cho trình ủ thuỷ phân Phối trộn đậu nành qua xử lý sơ gạo nếp có nấm mốc theo tỷ lệ (9:1) Sau thêm 6070% nước so với tổng nguyên liệu (trộn nước có tác dụng làm cho ngun liệu có độ ẩm thích hợp cho phát triển nấm mốc) Giai đoạn 2: Xử lí nguyên liệu gồm bước: làm sạch, sấy, nghiềng, để nguội Đậu nành làm để loại bỏ tạp chất có hạt hay bám bề mặt vỏ Sau đó, đậu nành làm nước sấy nhiệt độ từ 180-200oC thời gian từ 45-60 phút nhằm hạn chế hư hỏng đậu môi trường ẩm Nghiền đậu thật nhuyễn để chuẩn bị cho việc hoà tan đậu nước Tiếp tục trộn nước với tỷ lệ 1:5, đun sôi thời gian 45-60 phút để đậu thật mềm Cuối làm nguội 30-35oC, mục đích tạo nhiệt độ thích hợp cho nấm mốc phát triển phối trộn GVHD: Phạm Minh Nhựt 21 Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương Giai đoạn 3: Quá trình lên men gồm bước: ủ thuỷ phân Quá trình ủ nhằm tăng sinh khối nấm chuẩn bị cho q trình thuỷ phân Ủ có tầm quan trọng việc nuôi mốc (nếu xử lý nguyên liệu tốt, nuôi mốc kỹ thuật mà lên men không bảo đảm nước chấm khơng đạt u cầu  hiệu suất thu hồi thấp  giá thành cao) Nhiệt độ ủ quan trọng tạo điều kiện cho enzyme mốc xúc tác trình thủy phân tinh bột, protein thành đường acid amin Nhiệt độ ủ nên giữ 37- 450C suốt trình lên men Thời gian ủ 3-7 ngày Q trình thuỷ phân nhằm tạo pH thích hợp cho enzyme protease amylase nấm mốc hoạt động Biến đổi thành phần nguyên liệu theo hướng tạo sản phẩm nước tương Lượng nước cho vào tạo môi trường cho trình phân giải protein thành acid amin Thường lượng nước trộn vào 40 – 50% so với nguyên liệu tương đương Nguyên liệu sau ủ xong (lên mốc vàng hoa cau), làm tơi, để ủ đống tới nhiệt độ đạt 37-450C bắt đầu cho nước vào Khi cho nước vào nên dùng nước 600C để cho vào bể lên men, nguyên liệu có nhiệt độ 530C Khi trộn nước phải trộn nhanh cho vào bể lên men, mặt ngun liệu rải lớp muối kín đề phịng tạp khuẩn xâm nhập Đậy nắp để nước không bay nhiệt độ không bị giảm Giai đoạn 4: Giai đoạn sau lên men gồm: lọc, phối chế, trùng, để nguội, lắng lọc tinh Quá trình lọc thơ với mục đích loại bỏ bã, chuẩn bị cho trình Giai đoạn phối chế bổ sung phụ gia hương liệu vào để tăng hương vị nước tương phù hợp với thị hiếu người tiêu dùng GVHD: Phạm Minh Nhựt 22 Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương Thanh trùng nhằm tiêu diệt vi sinh vật cịn sót lại, kéo dài thời gian bảo quản Thanh trùng cách dùng nồi Khi trùng phải dùng nhiệt độ vừa phải 90-1000C khoảng 20 phút để không ảnh hưởng chất lượng nước tương Với loại nước tương nồng độ thấp, để tránh bị váng chua, q trình bảo quản trùng cách đun sơi Thanh trùng gần kết thúc cho natri benzoat vào để chống váng mốc Hàm lượng natri benzoat thêm vào khoảng 0,07- 0,1% so với lượng nước tương Lắng nhằm tách cặn mịn, khó lắng khỏi dung dịch, tiếp tục tạo hương làm tiền đề cho giai đoạn thành phẩm Và cuối lọc tinh nhằm tách triệt để cặn có kích thước nhỏ khỏi dung dịch để rót vào chai Giai đoạn 5: Tạo chế phẩm nước tương gồm: chiết chai dán nhãn Vô chai: chai nút rửa nước  rửa lại cồn 98o để  đem trùng 10-20 phút để loại bỏ bụi bẩn vi sinh vật bám chai  sản phẩm rót vào chai theo dung tích qui định Dán nhãn: nhãn in theo mẫu qui cách, có đầy đủ thơng tin cần thiết cho người tiêu dùng Chương IV: Kết luận đề nghị Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có enzyme thủy phân nội bào ngoại bào amylase, glucoamylase, protease, pectinasa, xylanase, hemycenlulase, ứng dụng nhiều lĩnh vực Đặc biệt số enzyme protease amylase tạo nhiều ứng dụng chủ yếu sản xuất nước tương GVHD: Phạm Minh Nhựt 23 Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương Aspergillus oryzae làm cho nước tương vị mặn lại có chút vị ngọt, điều tạo nên hương vị đặc trưng cho loại nước chấm Cần phân lập Aspergillus oryzae nguồn mẫu khác Qua so sánh hàm lượng enzyme từ lồi Aspergillus oryzae sống mơi trường khác Và tùy theo mục đích sử dụng tìm chủng Aspergillus oryzae thích hợp GVHD: Phạm Minh Nhựt 24 Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương Tài liệu tham khảo Tài liệu Tiếng Việt: Nguyễn Văn Bá (2009), Đại cương nấm mốc, OpenStax_CNX, 23 July 2009, link:http://cnx.org/content/m30247/1.1/ Nguyễn Lân Dũng (2007), Cách làm tương men, Nhịp cầu bạn đọc, 24 June 2007, link: http://vietsciences.free.fr/nhipcaubandoc/thacmachoiai/cachlamtuongmen.htm Lê Hồn (2012), Quy trình chế biến tương, link: http://kiemtailieu.com/ky-thuatcong-nghe/tai-lieu/quy-trinh-che-bien-tuong/11.html Nguyễn Hồi Hương (2009), Bài giảng thực hành cơng nghệ lên men, Đại học công nghệ TP.HCM Nguyễn Thị Thanh Kiều (2011), Thư viện giảng điện tử, 16 October 2011, link: http://baigiang.violet.vn/present/same/entry_id/6408054 Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ vi sinh vật thực phẩm lên men truyền thống NXB Đại Học Quốc Gia TP.HCM Nguyễn Thu Mai (2007), Phân lập định danh số loài Aspergillus hạt đậu phộng, Đại học Cần Thơ Phạm Minh Nhựt (2014) Bài Giảng thực hành phương pháp phân tích vi sinh, Đại học công nghệ TP.HCM Phạm Minh Nhựt (2013) Các phương pháp phân tích vi sinh, Đại học cơng nghệ TP.HCM GVHD: Phạm Minh Nhựt 25 Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương Võ Văn Quốc (2013) , Các phương pháp sản xuất nước tương thiết kế phân xưởng sản xuất 20000lit/ngày, Tailieu.ebook, 24 April 2013, link: http://doc.edu.vn/tailieu/luan-van-cac-phuong-phap-san-xuat-nuoc-tuong-va-thiet-ke-phan-xuong-sanxuat-20000-litngay-10550/ Võ Văn Thanh (2013), Xác định aflatoxin nông sản thực phẩm, Tailieu.ebook, 22 April 2013, link: http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-xac-dinh-aflatoxin-trong-nongsan-thuc-pham-10157/ Tài liệu Tiếng Anh: Machida M (2005), Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae, Nature, 438: 1157-1161 Wikipedia (2014), Aspergillus oryzae, March 2014, link: http://en.wikipedia.org/wiki/Aspergillus_oryzae GVHD: Phạm Minh Nhựt 26 ... ứng dụng rộng rãi sản xuất, chế biến thực phẩm công nghiệp sản xuất enzyme GVHD: Phạm Minh Nhựt 10 Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương Chương II: Quy trình phân tích tiêu vi sinh Cấy... amylase tạo nhiều ứng dụng chủ yếu sản xuất nước tương GVHD: Phạm Minh Nhựt 23 Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương Aspergillus oryzae làm cho nước tương vị mặn lại có chút vị ngọt,... pháp phân tích vi sinh, Đại học cơng nghệ TP.HCM GVHD: Phạm Minh Nhựt 25 Phân tích tiêu Aspergillus sản xuất nước tương Võ Văn Quốc (2013) , Các phương pháp sản xuất nước tương thiết kế phân