CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT ỨNG DỤNG

UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT ỨNG DỤNG TS Nguyễn Thanh Bình 1 LỜI NÓI ĐẦU Hiện nay công nghệ sinh học đóng một vai trò khá lớn trong việc kết hợp các quy tr.

UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT ỨNG DỤNG TS Nguyễn Thanh Bình LỜI NĨI ĐẦU Hiện cơng nghệ sinh học đóng vai trị lớn việc kết hợp quy trình thiết bị kỹ thuật mức độ tế bào vi sinh vật, tế bào động thực vật để sản xuất quy mô công nghiệp sản phẩm sinh học có chất lượng cao, phục vụ cho lợi ích, nhu cầu người, phát triển kinh tế - xã hội đồng thời góp phần vào bảo vệ môi trường sống Sự thay đổi điều kiện sống qua biến đổi khí hậu tồn cầu, gia tăng dân số thách thức khoa học công nghệ, công nghệ sinh học ứng dụng, để giải việc tăng nguồn lương thực có nguồn gốc từ động thực vật, giải vấn đề y tế, đồng thời giảm tác động tiêu cực đến môi trường hoạt động nông nghiệp gây Nội dung sách tổng hợp từ nhiều nguồn sách, tạp chí khoa học có uy tín giới, số cơng trình nghiên cứu tác giả sách cơng bố nước Quyển sách cung cấp kiến thức kỹ thuật sinh học, khả ứng dụng, kỹ thuật tác động tế bào thành phần tế bào phục vụ thực tiển quy trình sản xuất Đồng thời giới thiệu số phương pháp giải vấn đề tạo giống động vật, chữa bệnh, giải thức ăn sinh học chăn nuôi tác động đến kỹ thuật sinh học mức độ tế bào mà Việt Nam thiếu tài liệu chuyên ngành tiếng việt Xin trân trọng giới thiệu bạn đọc hy vọng nguồn tài liệu tham khảo, học tập, nghiên cứu ứng dụng sản xuất Trân trọng cám ơn Quý giáo sư, đồng nghiệp, chuyên gia lĩnh vực nghiên cứu; GS TS Masahi Miyake- Nguyên Hiệu trưởng Trường Đào tạo Sau đại học Đại học Kobe - Nhật Bản tạo điều kiện, động viên, cung cấp tài liệu để tác giả hoàn thành sách Tác giả TS Nguyễn Thanh Bình MỤC LỤC CHƯƠNG I: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RECOMBINANT DNA VÀ TẠO DÒNG GENE ĐỂ ĐIỀU CHẾ CÁC SẢN PHẨM SINH HỌC PHẦN Giới thiệu PHẦN Tổng quan 1.1 Lịch sử đời kỹ thuật DNA tái tổ hợp 1.2 Kỹ thuật DNA tái tổ hợp (Recombinant DNA) tạo dòng (Gene cloning) 10 1.2.1 Kỹ thuật DNA tái tổ hợp 10 1.2.2 Tạo dòng gene 10 1.2.3 Các bước thực 11 1.2.4 Các enzyme chủ yếu dùng kỹ thuật DNA tái tổ hợp 12 1.2.4.1 Các enzyme giới hạn 12 1.2.4.2 Các enzyme polymerase 13 1.2.4.3 Các enzyme nối (Ligase) 13 1.2.4.4 Các nuclease 14 1.2.5 Các vector sử dụng DNA tái tổ hợp 14 1.2.5.1 Các vector plasmid 15 1.2.5.2 Các vector phage 16 1.2.5.3 Cosmid vector 16 1.2.5.4 Các vector khác 17 1.2.6 Các loại tế bào chủ 17 1.2.6.1 Tế bào chủ nhân sơ 17 1.2.6.2 Tế bào chủ nhân chuẩn 18 1.2.7 Tạo, tách chọn lọc dòng rDNA 19 1.2.7.1 Tạo plasmid tái tổ hợp 19 1.2.7.2 Tách dòng DNA tái tổ hợp 19 1.2.7.3 Chọn lọc dòng DNA đặc hiệu biểu gene 20 1.3 Một số ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp cloning gene điều chế sản phẩm y sinh học 20 1.3.1 Human alpha antitrypsin 20 1.3.1.1 Sơ lược bệnh thiếu men Alpha -1- Antitrypsin (AAT) 20 1.3.1.2 Sản xuất AAT cách sử dụng cừu biến đổi gene 21 1.3.2 rBST (recombinant Bovine somatotrobin)/ rBGH (recombinant bovine growth hormone) 22 1.3.2.1 Giới thiệu rBGH/rBST 23 1.3.2.2 Ứng dụng công nghệ sinh học sản xuất rBST 23 1.3.2.4 Ảnh hưởng rBST đến khả sản xuất sữa bò 24 1.3.2.5 Lợi ích rủi ro sử dụng BST 25 PHẦN Kết luận 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO 27 CHƯƠNG II: MÔ DA DÙNG TRONG DỊNG HĨA 29 Phần A: MƠ DA DÙNG TRONG DỊNG HĨA 29 PHẦN Giới thiệu 29 PHẦN Nội dung 29 2.1 Các lớp tế bào da 29 2.1.1 Lớp biểu bì 30 2.1.1.1 Lớp đáy (stratum basale) hay lớp mầm (stratum germinativum) 30 2.1.1.2 Lớp gai (stratum spinosum) 31 2.1.1.3 Lớp hạt (Stratum granulosum) 31 2.1.1.4 Lớp bóng (Stratum lucidum) 31 2.1.1.5 Lớp sừng (Stratum corneum) 31 2.1.2 Lớp bì 32 2.1.3 Lớp hạ bì 32 2.2 Tế bào gốc da 32 2.2.1 Tế bào gốc da lớp biểu bì 33 2.2.1.1 Các yếu tố định phân chia tế bào gốc biểu bì 36 2.2.2 Nang lơng tóc 40 2.2.2.1 Sự hình thành nang lông 40 2.2.2.2 Chu kỳ lơng tóc tế bào gốc nang lông 41 2.2.2.3 Các yếu tố định phân chia tế bào gốc nang 42 2.2.3 Tuyến nhờn (SG) 45 2.3 Vai trò tế bào gốc da 46 PHẦN Kết luận 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 Phần B: DỊNG HĨA BỊ 50 PHẦN Mở đầu 50 PHẦN Nội dung 50 2.1 Những nghiên cứu dịng hóa bò 50 2.2 Kỹ thuật dịng hóa 52 2.2.1 Bước 1: Chuẩn bị tế bào chất nhận 52 2.2.2 Bước 2: Xử lý tế bào cho 53 2.2.3 Bước 3: Tái kết cấu 54 2.2.4 Bước 4: Ni cấy in vitro nỗn tái kết cấu 54 2.2.5 Bước 5: Cấy phôi vào tử cung "mẹ nuôi" phát triển thành bào thai 55 2.3 Dòng hóa từ tế bào thai 55 2.3.1 Tế bào phôi lấy từ thai 55 2.3.2 Tế bào sinh dưỡng lấy từ thai 55 2.4 Dịng hóa từ tế bào sinh dưỡng trưởng thành 55 2.4.1 Chiến lược chuyển nhân tế bào sinh dưỡng chu kỳ tế bào 55 2.4.2 Đồng pha tế bào cho 56 2.4.3 Các loại tế bào sinh dưỡng sử dụng 56 2.5 Hiệu dịng hóa bị 56 2.5.1 Dịng hóa từ phơi 56 2.5.1.1 Phát triển in vitro 56 2.5.1.2 Phát triển in vivo 57 2.5.1.3 Hiệu chung 57 2.5.1.4 Những yếu tố giới hạn 57 2.5.2 Hiệu dịng hóa từ tế bào sinh dưỡng 58 2.5.2.1 Phát triển in vitro 58 2.5.2.2 Phát triển trước sanh 58 2.5.2.3 Sức sống bị dịng hóa 59 PHẦN Kết luận 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 Phần C: TÁI LẬP TRÌNH NHÂN 62 2.1 Khái niệm tái lập trình nhân 62 2.2.Tái lập trình nhân tế bào sinh dưỡng 62 2.2.1.Tái lập trình nhân chuyển nhân 62 2.2.2.Tái lập trình nhân dung hợp tế bào 64 2.2.3.Tái lập trình nhân dịch chiết tế bào 66 2.2.4.Cấy ghép tế bào 66 2.2.5.Tái lập trình nhân phân tử nhỏ 67 2.3.Các yếu tố kiểm sốt q trình tái lập trình nhân 68 2.3.1.Các yếu tố tế bào 69 2.3.2.Các nhân tố bên 71 2.4.Giới hạn sinh học kỹ thuật tái lập trình nhân 74 2.4.1.Sự bất hoạt NST X 74 2.4.2.Dị ty thể (Mitochondrial heteroplasmy) 75 2.4.3.Sự ngắn dần telomere 75 2.4.4.Sự đột biến 76 2.4.5.Thất bại trình in dấu gene 76 2.4.6.Sai sót mặt kỹ thuật 76 2.5.Khiếm khuyết động vật tạo dịng vơ tính 77 Kết luận 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 Phần D: ỨNG DỤNG CHUYỂN NHÂN Ở HEO 80 PHẦN Mở đầu 80 PHẦN Nội dung 80 2.1 Những nghiên cứu bước đầu 80 2.2 Những kiện phân tử tái lập trình nhân heo 81 2.2.1 Định nghĩa chung 81 2.2.2 Tái lập trình nhân heo 81 2.2.2.1 Sự phồng lên nhân chuyển 81 2.2.2.2 Sự tổng hợp mRNA 82 2.2.2.3 Một số gene tham gia trình tái lập trình 84 2.3 Hoạt hóa trứng 86 2.3.1 Chu kỳ tế bào 86 2.3.2 Cơ chế hoạt hóa trứng 86 2.4 Sự phát triển in vitro phôi chuyển nhân 87 2.5 Vấn đề sản xuất heo chuyển nhân 88 2.6 Ứng dụng tạo đời kỹ thuật chuyển nhân 89 PHẦN Kết luận 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO 92 CHƯƠNG III: LẬP TRÌNH CỦA DI TRUYỀN NGOÀI NHÂN DNA (EPIGENETIC) 93 3.1.Định nghĩa epigenetic 93 3.2.Cơ sở phân tử epigenetic 93 3.3.Các yếu tố epigenetic ảnh hưởng đến biểu gene 95 3.4.Các vấn đề cần quan tâm 97 TÀI LIỆU THAM KHẢO 98 CHƯƠNG IV: XÁC ĐỊNH TÍNH ĐA NĂNG CỦA TẾ BÀO 99 4.1 Khái niệm 99 4.2 Phân loại tế bào gốc 99 4.3 Đặc điểm sinh học 101 4.3.1 Tính vạn 101 4.3.2 Tính tự làm 101 4.3.3 Tính mềm dẻo 101 4.4 Những ứng dụng tính đa tế bào 101 4.4.1 Trong nghiên cứu 101 4.4.2 Ghép tế bào gốc trị liệu (stem cell therapy) 102 4.5 Phương pháp thu nhận tế bào gốc 103 TÀI LIỆU THAM KHẢO 104 CHƯƠNG V: CƠ CHẾ DI TRUYỀN PHÂN TỬ TRONG VIỆC TẠO CÁC LOẠI TẾ BÀO CHUYÊN BIỆT 106 5.1 Protein điều hòa 106 5.2 Methyl hóa DNA 109 5.3 Đoạn DNA giàu CG (vùng CpG (CG) đảo CpG) 113 5.4 Sự in dấu di truyền biểu gene theo nguồn gốc 114 5.5 Kiểm soát sau phiên mã (post-transcription control) 116 5.5.1 Biến đổi sau phiên mã đầu 5’ 3’ tiền mRNA (pre-mRNA) 116 5.5.2 Quá trình trưởng thành tiền mRNA 118 5.5.3 Sự vận chuyển mRNA trưởng thành khỏi nhân – Đời sống mRNA, phân hủy mRNA 120 TÀI LIỆU THAM KHẢO 122 CHƯƠNG VI: KỸ THUẬT SINH HỌC TRONG CẢI TIẾN TỶ LỆ SINH SẢN VÀ CHẤT LƯỢNG THƯƠNG PHẨM 123 6.1 Cấy truyền phôi bảo quản phôi 123 6.1.1 Lịch sử phát triển công nghệ cấy truyền phôi (CTP) 123 6.1.2 Cấy truyền phôi (Embryo Transfer - ET) 124 6.1.3 Kỹ thuật cấy truyền phơi bị 125 6.1.4 Bảo quản phôi 126 6.1.5 Ý nghĩa công nghệ bảo quản chuyển cấy phôi 127 6.1.6 Ứng dụng chuyển cấy bảo quản phôi chăn nuôi 128 6.2 Công nghệ thụ tinh nhân tạo (Artificial Insemination - AI) 128 6.3 Kỹ thuật PCR xác định giới tính phôi 129 6.3.1 PCR 129 6.3.2 Nguyên tắc PCR 130 6.3.3 Kỹ thuật xác định giới tính phơi bị PCR 130 6.3.4 Ý nghĩa xác định giới tính chăn ni 131 6.4 Đánh giá chất lượng tinh trùng kỹ thuật Hypoosmotic swelling test (HOST) 133 6.4.1 Định nghĩa 133 6.4.2 Phương pháp 133 6.4.3 Ứng dụng 133 TÀI LIỆU THAM KHẢO 135 CHƯƠNG VII: KỸ THUẬT TẠO THÚ BIẾN ĐỔI GENE VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN PHẨM THUỐC VÀ Y SINH HỌC 136 7.1 Khái niệm chung 136 7.1.1 Sinh vật biến đổi gene 136 7.1.2 Sự phát triển khoa học chuyển gene động vật 137 7.2 Công nghệ tạo động vật chuyển gene 137 7.2.1 Tách chiết, phân lập gene mong muốn tạo tổ hợp gene biểu tế bào động vật 138 7.2.1.1 Tách chiết, phân lập gene mong muốn 138 7.2.1.2 Tạo tổ hợp gene chuyển biểu tế bào động vật 139 7.2.2 Tạo sở vật liệu biến nạp gene 139 7.2.3 Chuyển gene vào động vật 140 7.2.3.1 Phương pháp vi tiêm 140 7.2.3.2 Phương pháp xung điện 141 7.2.3.3 Phương pháp tiêm trực tiếp 142 7.2.3.4 Phương pháp lây nhiễm retrovirus 142 7.2.3.5 Sử dụng súng bắn gene 142 7.2.3.6 Sử dụng tế bào gốc phôi 143 7.2.3.7 Đóng gói DNA ngoại lai liposome chuyển vào tế bào hay phôi 144 7.2.4 Nuôi cấy phôi ống nghiệm 144 7.2.5 Kiểm tra động vật sinh từ phôi chuyển gene 144 7.2.5.1 Phương pháp thẩm tách DNA 145 7.2.5.2 Phương pháp PCR 145 7.2.6 Tạo nguồn động vật chuyển gene cách liên tục 145 7.3 Một số thành tựu lĩnh vực tạo động vật chuyển gene 146 7.3.1 Chuột chuyển gene 146 7.3.2 Heo chuyển gene 146 7.3.3 Gà chuyển gene 147 7.3.4 Dê biến đổi gene 148 7.3.5 Chống sốt rét muỗi biến đổi gene 148 7.3.6 Điều trị thành công liệu pháp gene cho người mù 148 Kết luận 148 TÀI LIỆU THAM KHẢO 149 PHẦN THAM KHẢO 150 CHƯƠNG I: L-LYSINE TRONG TỔ HỢP KHẨU PHẦN THỨC ĂN 150 PHẦN Mở đầu 150 PHẦN Tổng quan L-lysine 150 1.1 Giới thiệu chung 150 1.2 Vai trò lysine 151 1.3 Cơ chế hoạt động lysine 151 1.4 Các trường hợp cần bổ sung lysine phần thức ăn 152 1.4.1 Trên người: Thực phẩm chức năng, điều trị bệnh 152 1.4.2 Vật nuôi: Bổ sung vào thức ăn cho gia súc, gia cầm 153 1.5 Sản xuất lysine 155 1.5.1 Lịch sử trình sản xuất lysine 155 1.5.2 Phương pháp sản xuất L-lysine 155 PHẦN Kết luận 159 TÀI LIỆU THAM KHẢO 160 CHƯƠNG II: DÒNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS TẠO CHẤT BỔ SUNG TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI VÀ BACTERIOCIN KHÁNG KHUẨN 161 2.1 Biến đổi dòng vi khuẩn 161 2.2 Bacteriocin 161 2.2.1 Khái niệm Bacteriocin 161 2.2.2 Hoạt động Bacteriocin 162 2.2.3 Cơ chế hoạt động 162 2.2.4 Ứng dụng 162 2.2.4.1 Bảo quản lương thực – thực phẩm 162 2.2.4.2 Bacteriocin chăn nuôi 166 2.2.4.3 Một số sản phẩm thị trường 166 2.3 Đặc điểm chung vi khuẩn lactic 169 2.4 Lên men lactic 170 2.5 Ứng dụng lactobacillus 172 2.5.1 Sản xuất probiotic 172 2.5.2 Sản xuất ACIDIFIER 176 KẾT LUẬN 178 TÀI LIỆU THAM KHẢO 178 CHƯƠNG III: CHUẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM VÚ Ở BÒ SỮA 179 3.1 Bệnh leukocyte bò sữa Holstein Friesian 179 3.1.1 Khái niệm bệnh leukocyte 179 3.1.2 Kỹ thuật sinh học chẩn đoán bệnh leukocyte 180 3.1.2.1 Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) 180 3.1.2.2 Kỹ thuật lai phân tử Southern blot 185 3.2 Bệnh viêm vú bò sữa 187 3.2.1 Khái niệm bệnh viêm vú 187 3.2.2 Kỹ thuật sinh học chẩn đoán bệnh viêm vú 188 3.2.2.1 Phương pháp thử viêm vú CMT (California Mastitis Test) 188 3.2.2.2 Máy đếm tế bào (flow cytometer) 190 3.2.2.3 Kỹ thuật ELISA (Enzymee-linked immunosorbent assay) 192 3.2.2.4 Một số phương pháp khác chẩn đốn viêm vú tiềm ẩn bị sữa 196 Kết luận 196 TÀI LIỆU THAM KHẢO 197 CHƯƠNG I ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RECOMBINANT DNA VÀ TẠO DÒNG GENE ĐỂ ĐIỀU CHẾ CÁC SẢN PHẨM SINH HỌC PHẦN Giới thiệu Những cố gắng không ngừng người việc nâng cao sức khỏe, có đóng góp tiến khoa học đại Trong bao gồm lĩnh vực cơng nghệ gene công nghệ chuyển gene phát liệu pháp gene dựa việc sản xuất protein tái tổ hợp (sữa bò chuyển gene cung cấp nguồn protein an tồn, có giá trị cao chế phẩm khác điều trị bệnh cho người sản xuất men Alpha antitrypsin từ cừu biến đổi gene ) Kể từ năm 1970, nhà khoa học chuyển gene lạ vào vi khuẩn bắt biểu gene Tuy nhiên, có protein phục vụ cho nhu cầu người ngày đòi hỏi phức tạp thể vi khuẩn không biểu cần đến động vật chuyển gene Sản phẩm thành công người sản xuất sản phẩm sinh học thông qua chuyển gene Insulin hoocmon sinh trưởng vào vi khuẩn E coli PHẦN Tổng quan 1.1 Lịch sử đời kỹ thuật DNA tái tổ hợp Năm 1972, phân tử DNA tái tổ hợp tạo trường Đại học Stanford (Mỹ) nhà khoa học Paul Berg cộng thực cách sử dụng đặc tính cắt enzyme giới hạn (Restriction enzyme) khả nối mạch DNA với enzyme nối ligase Nhờ kỹ thuật vật chất di truyền thường hay vài gene lắp ghép vào phân tử DNA có nguồn gốc khác (Ví dụ: lắp ghép gene động vật, thực vật vào plasmid vi khuẩn vào phage  ) để hình thành DNA tái tổ hợp Khi thể DNA tái tổ hợp tạo thành chuyển từ thể (cơ thể cho) sang thể tế bào khác (cơ thể nhận tế bào nhận) Điều quan trọng gene tái tổ hợp trì chức cũ thể, tế bào nhận Năm 1973, nhà khoa học nối nhiều đoạn DNA vào plasmid tách từ vi khuẩn Escherichia coli (E coli) Plasmid hoạt động, tự chép đưa vào tế bào vi khuẩn E coli, từ tạo công nghệ quan trọng công nghệ di truyền tách dòng gene Thành tựu kỹ thuật DNA tái tổ hợp việc sản xuất kích thích tố sinh trưởng người (hGH-human growth hoocmon) nhờ vi sinh vật nhận E coli Các nhà khoa học đưa gene mã hóa hGH vào E coli E coli có DNA tái tổ hợp sản sinh lượng lớn kích thích tố sinh trưởng người sử dụng vào thực tiễn y học Tiếp đó, vào năm đầu thập kỷ 80 kỷ XX, nhờ kỹ thuật DNA tái tổ hợp, người ta sản xuất interferol, sản xuất protein chống đông máu… TÀI LIỆU THAM KHẢO Azuara V., 2006 Profiling of DNA replication timing in unsynchronized cell populations Nat Protoc 1(4):2171-7 Baba, Y., Garrett, K P and Kincade, P W.,2005 Constitutively Active [beta]Catenin Confers Multilineage Differentiation Potential on Lymphoid and Myeloid Progenitors Immunity 23: 599-609 Bartolomei, M.S., Zemei, S and Tilghman,S.M (1991) Parental imprinting of the mouse H19 gene Nature, 351: 153–155 Bortvin A, Eggan K, Skaletsky H, Akutsu H, Berry DL, Yanagimachi R, Page DC, Jaenisch R, 2003 Incomplete reactivation of Oct4-related genes in mouse embryos cloned from somatic nuclei Development 130(8):1673-80 Ding, S and Schultz, P G., 2004 A role for chemistry in stem cell biology Nat Biotech 22: 833-840 Gurdon J.B and Melton D.A., 2008 Nuclear Reprogramming in Cells Science 322: 1811-1815 Konrad Hochedlinger and Kathrin Plath, 2009 Epigenetic reprogramming and induced pluripotency Development 136: 509-523 Martin, G.R., 1981 Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells Proc Natl Acad Sci USA 78: 7634-7638 Martins, S B., Eide, T., Steen, R L., Jahnsen, T., Skalhegg, B S and Collas, P., 2000 HA95 is a protein of the chromatin and nuclear matrix regulating nuclear envelope dynamics J Cell Sci 113(21): 3703-13 10 Matsumura, H., Tada, M., Otsuji, T., Yasuchika, K., Nakatsuji, N., Surani, A and Tada, T., 2007 Targeted chromosome elimination from ES-somatic hybrid cells Nat Meth 4: 23-25 11 Nagy A., Rossant J., Nagy R., Abramow-Newerly W., Roder J.C., 1993 Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells Proc Natl Acad Sci USA 90: 8424-8428 12 Nguyễn Anh Trí & Lê Xuân Hải, Tế bào gốc nhân Viện Huyết học-Truyền máu Trung ương www.nihbt.org.vn 13 Nguyễn Mộng Hùng, 2004 Công nghệ tế bào phôi động vật Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội 14 Phan Kim Ngọc - Phạm Văn Phúc, 2010 Công nghệ sinh học người động vật Nhà xuất Giáo dục Việt Nam 15 Russo V.E.A., Martienssen R.A., Riggs A.D., 1996 Epigenetic mechanisms of gene regulation Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY 78 16 Suresh Kumar Swaminathan, 2007 Screening for nuclear reprogramming factors and analysis of DNA demethylation during in vitro myoblasts ifferentiation Dissertation doctor of natural sciences, Combined Faculties for The Natural Sciences and For Mathematics of The Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germany 17 Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S C and Surani, M A., 1997 Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybridcells Embo J 16: 6510-6520 18 Taranger, C K., Noer, A., Sorensen, A L., Hakelien, A.-M., Boquest, A C and Collas, P., 2005 Induction of Dedifferentiation, Genomewide Transcriptional Programming, and Epigenetic Reprogramming by Extracts of Carcinoma and Embryonic Stem Cells Mol Biol Cell 16: 5719-5735 19 Waddington C H.,1957 The Strategy of the Genes London: Geo Allen and Unwin 20 Wiles M V, 1993 Embryonic stem cell differentiation in vitro Meth Enzymol 225900-918 79 Phần D: ỨNG DỤNG CHUYỂN NHÂN Ở HEO PHẦN Mở đầu Cùng với phát triển công nghệ sinh học đại, cơng nghệ tạo dịng vơ tính (cloning) phát triển nhanh chóng ngày có vị quan trọng nghiên cứu y sinh sản xuất nơng nghiệp Tuy cịn nhiều tranh cãi xoay quanh vấn đề đạo đức phần hạn chế nghiên cứu lợi ích to lớn mà cơng nghệ đem lại người ta tạo nên lượng lớn động vật nhân có heo Mục đích tạo vật mang biến đổi di truyền chuyên biệt Hiện nay, cơng tác nhân dịng tạo heo chuyển gene nỗ lực có ý nghĩa quan trọng Heo động vật có ý nghĩa quan trọng nghiên cứu y sinh chúng mơ hình cực tốt cho nghiên cứu bệnh tim mạch, bệnh da, nghiên cứu độc chất học, tổng hợp lipoprotein bệnh vi sinh lây lan đường ruột Nhờ động vật mơ hình mà ngày tiếp cận thử nghiệm, giải bệnh hiểm nghèo ung thư, tiểu đường… (tạo mô hình động vật mang khối u người hay bệnh tiểu đường nhờ chuyển gen quy định bệnh này) Chúng thường xem nguồn cung cấp quan tiềm việc ghép dị chủng (xenotransplantation) Sự phát triển cải tiến hệ thống nhân dịng phơi heo hứa hẹn mang lại ứng dụng to lớn cho lĩnh vực y sinh học Quá trình cloning dẫn đến phát triển, tạo mơ cho bệnh chứng xơ hóa, lỗng xương, hay bệnh tiểu đường Nhân dòng heo đem lại cải thiện lớn sản xuất thịt khả cung cấp nguồn thực phẩm lớn cho số dân ngày tăng giới Việc thêm vào hay loại bỏ gen đặc hiệu qui định sản lượng, tính kháng bệnh hay đặc tính sản xuất giúp ngành sản xuất thịt heo thêm hiệu Nói chung heo lồi chọn cho nghiên cứu nhiều bệnh người thịt heo đóng vai trò quan trọng thực phẩm nên việc cải thiện hệ thống nhân dòng chuyển nhân heo cần thiết PHẦN Nội dung 2.1 Những nghiên cứu bước đầu Bài báo cloning heo xuất năm 1985 Robl First hội nghị toàn cầu lần thứ sản xuất heo giống tổ chức Columbia, Missouri Tác giả cơng bố nucleic chuyển tế bào phôi hai giai đoạn phát triển Bài báo tiến trình chuyển nhân hoàn thiện biểu nhân chuyển heo thể Sau thí nghiệm chuyển nhân nhân cho giai đoạn tế bào heo thành công (Prather ctv, 1989) 80 Dựa tảng này, nhiều nghiên cứu đánh giá trước thay đổi cấu trúc chức nhân sau chuyển nhân nỗ lực tạo heo Đáng ý thay đổi nucleic chúng chuyển vào trứng, sau chúng phát triển in vitro cuối tạo heo (tái lập trình phát triển in vitro) 2.2 Những kiện phân tử tái lập trình nhân heo 2.2.1 Định nghĩa chung Tái lập trình trình mà DNA protein kết hợp nhân cấy từ tế bào sinh dưỡng điều chỉnh lại - tái lập trình lại để sẵn sàng hợp với bào tương trứng nhận Sự hợp đồng yếu tố tiên cần cho phát triển phôi (Solter D, 2000) 2.2.2 Tái lập trình nhân heo 2.2.2.1 Sự phồng lên nhân chuyển Phơi heo mơ hình quan trọng cho nhiều nghiên cứu mơ tả tái lập trình nhân xảy sau chuyển nhân Giả thuyết rằng, nhân cho tái lập trình lại sau chuyển vào tế bào chất trứng nhận Đầu tiên chúng phải tái lập lại mơ hình để tương tự mơ hình tiền nhân Thơng thường, tiền nhân có nhiệm vụ kích hoạt mã Tại giai đoạn tế bào đặc biệt, phôi bắt đầu sản xuất số lượng lớn dấu hiệu mRNA Ở heo, giai đoạn xảy q trình phơi thời kỳ tế bào (Jarrell ctv, 1991; Schoenbeckb ctv, 1992) Giai đoạn tế bào tương thích với số lượng lớn thay đổi hình dạng nhân Do đó, kiện tập trung vào thay đổi sau chuyển Để tìm hiểu người ta xác định khác hình dạng nhân chuyển tiền nhân phải chuẩn (Prather Schatten, 1992) Sự khác biệt rõ ràng hình thái học tiền nhân nhân từ loại tế bào khác kích thước tiền nhân Trong trứng thụ tinh, tiền nhân lớn lớn nhiều so với tế bào sinh dưỡng Trong trình phân chia, kích thước nhân thu nhỏ kích thước tế bào thu nhỏ Ở heo, kích thước nhân phơi tế bào khoảng 18 µm thu nhỏ cịn 14,3 13,0 µm nhân từ phôi 16 tế bào (Practher cộng sự, 1990) Khi nhân từ phôi 16 tế bào chuyển đến trứng giai đoạn metaphase II khơng nhân (sau hoạt động), nhân phồng lên đến 27,3 27,2 µm Thú vị hơn, mức độ căng phồng khác loại trứng, số lượng lớn tế bào chất khơng kìm hãm phát triển “tiền nhân” Một số nghiên cứu phồng lên đặc tính quan trọng q trình tái tạo (Lui cộng sự, 1995) biểu thị cho trình trao đổi protein xảy nhân cho chuyển vào tế bào chất trứng Nhân phồng lên dấu hiệu trình trao đổi protein xảy sau chuyển nhân Một loại protein đặc biệt biết đến để biến đổi thành phần trình phân chia sớm lớp mỏng nhân chứng minh trao đổi protein Trong động vật có vú, có loại protein có chức phổ biến loại A A/C Loại A C 81 loại chính, ngoại trừ 82 amino acid đoạn đuôi lớp A Lớp mỏng nhân nằm trung gian protein dạng sợi tạo nên vỏ bao hình trịn chất nhiễm sắc bên nhân Những protein phân cắt thành nhiều đơn phân kì trung gian phân cắt trứng Trong trình thụ tinh, lớp mỏng tế bào chất chuyển thành dạng tiền nhân sớm Thành phần lớp mỏng nhân thay đổi sau chuyển đổi đặc biệt dẫn tới điều hịa phát triển phơi Trong lớp mỏng loại B loại A/C không xuất Lớp mỏng loại A/C tái lại sau q trình phát triển mơ Vì vậy, nhân lấy chuyển vào trứng thành phần lớp mỏng nhân thay tiền nhân khơng? Khi nhân có nguồn từ việc chuyển nhân đặc biệt sang trứng chúng đòi hỏi lớp mỏng tiền nhân, trường hợp A/C (Prather et al., 1989) Những nghiên cứu xa chuột, người ta lớp mỏng A/C không cần loại tiền nhân sinh vật cho, trứng tiếp nhận thụ tinh kích hoạt lại (Prather ctv, 1991) 2.2.2.2 Sự tổng hợp mRNA Hạch nhân nơi tổng hợp rRNA Bằng việc sử dụng kính hiển vi điện tử, phần nhân xác định giai đoạn tiền nhân Nhân có hình dạng phức tạp với bề mặt nhẵn không mắt lưới Trong tế bào trải qua q trình tổng hợp rRNA heo giai đoạn tế bào Nhân có khơng bào dạng lưới với bề mặt hình hạt nhám Vì câu hỏi đặt là: “nếu có nhân tái thiết lập sau chuyển vào trứng, hình thái nhân tiền nhân có giống khơng?” Thật ra, nhân dạng hạch nhân chúng nhân hoạt hóa chuyển vào trứng loại bỏ nhân hoạt hóa lại hình thái nhân Hình thái nhân biến đổi, chẳng hạn từ hạch nhân thành tiền nhân, rắn chắc, khơng hạt khơng có lưới khơng bào Điều tổng hợp rRNA bị ngừng lại Những thay đổi khơng hồn tồn trứng thụ tinh tái hoạt hóa Phương pháp khác để đánh giá mức độ tái lập trình đánh giá cấu trúc vị trí khác nhân Điều gián tiếp cho thấy hoạt động tổng hợp RNA Small nuclear ribonuclear proteins (snRNPs) chịu trách nhiệm q trình xử lí tiền mRNA trước RNA rời nhân vào tế bào chất Lõi B/D protein xác định kháng thể đơn dịng Y12 Kháng thể không nhân thời kì có phá vỡ thể mầm (germ vesicles breakdown) giai đoạn phôi heo tế bào (Pranther & Rickords, 1992) Sự xuất kháng nguyên Y12 nhạy với α–amanitin sensitive chất ức chế mã ngăn cản tổng hợp mRNA Câu hỏi đặt là: “nếu nhân tái thiết lập sẵn sàng sau chuyển nhân vào trứng có hay khơng phân bố xuất kháng nguyên Y12 tương tự tiền nhân?” Khi nhân sẵn chứa kháng nguyên Y12 chuyển vào trứng loại nhân trứng hoạt hóa, sau chúng khả tái phản ứng với kháng nguyên Y12 (Pranther & Rickords, 1992) Điều gián tiếp khơng có tiến trình xử lí mRNA khơng có q trình tổng hợp mRNA Do tương tự kích thước, thành phần lớp mỏng nhân hình thái nhân, nhân chuyển phản ứng với kháng thể Y12 bình thường hoạt động diễn tiền nhân 82 Phương pháp cuối để đánh giá tổng hợp mRNA xem xét hợp [2H] uridin tế bào trước chuyển nhân sau đánh thay đổi hợp sau chuyển nhân Có tổng hợp tổng hợp RNA tiền nhân – giai đoạn phôi tổng hợp RNA thiết yếu đuợc tăng cường, hợp giai đoạn tế bào Vậy câu hỏi đặt là: “nếu nhân sẵn sàng tái thiết lập sau chuyển vào trứng, phải có hay khơng hợp uridin vào tiền nhân?” Hyttel ctv (1993) tiến hành nhiều thử nghiệm trứng phôi trưởng thành in vitro tìm thấy có giảm [2H] uridin hợp sau chuyển nhân, hợp xảy Nghiên cứu cho việc tái thiết lập mơ tái lập trình nhân có lẽ khơng diễn hồn tồn Các thử nghiệm tiếp tục để tìm kiếm gene chuyên biệt hình thái họ RNA Winger ctv (2000) đánh giá thông tin số lượng lớn enzyme điều hòa chủ yếu phơi bị Họ nhận lactate dehyrogenase, citrate synthase phosphofructokinase diện trình tái lập trình nhân điều hịa cách xác Theo Park ctv (2001) nhận thấy nửa nhân tái lập trình đo biểu enhanced green fluorescent protein (EGFP) Những nghiên cứu xa tiến hành với chiến lược phân tách nguyên sợi bào (fibroblasts) để EGFP biểu phơi chuyển nhân tạo thành dạng thể khảm Park ctv, 2002 cho việc tái lập trình phơi bào khơng đồng nhất, có nghiên cứu heo vấn đề tái lập trình nhân nên sử dụng thí nghiệm loại gia súc khác bò Theo nghiên cứu Desousa ctv (1999) có 95% RNA phiên mã nhân di chuyển giai đoạn phôi bào giống với phôi đối chứng tạo in vitro Tuy nhiên, điều có nghĩa 5% khác với đối chứng Daniels ctv (2000) xác định phần 5% khác biệt Họ cho interleukin (IL6), yếu tố phát triển nguyên sợi bào (FGF4) FGFr2 không biểu mức nhân chuyển, vài trường hợp khơng hồn thành 83 Hình 2.20 Chức hoạt động snRNPs (Lee E, Lee S H ctv, 2006) 2.2.2.3 Một số gene tham gia trình tái lập trình Ghép dị chủng ngày phát triển mở rộng Tuy nhiên hiệu chuyển nhân từ tế bào somatic thấp phần lớn bị chết, số tạo thành dạng khác thường Người ta giải thích tượng q trình tái lập trình nhân phơi chuyển nhân từ tế bào somatic không diễn đầy đủ Để kiểm tra điều Lee ctv (2006) thử nghiệm so sánh khả tái lập trình phôi heo chuyển nhân từ tế bào nguyên sợi bào từ tế bào mầm với gene Oct-4 gene họ (Ndp5211, Dppa2, Dppa3, and Dppa5) gene quan trọng trình tái lập trình, gene Hand1 and GATA-4 quan trọng cho trình phát triển sử dụng marker RT-PCR Gene Oct-4 nhóm thuộc yếu tố điều hòa phiên mã Được xác định tế bào gốc phôi chuột tế bào mầm Mức độ biểu Oct-4 (được đo RealTime-PCR) cần thiết (P < 0,05) cloned blastocyst nhận từ nguyến sợi bào nhiều cloned thất bại việc kích hoạt lại gene nghiên cứu, hầu hết cloned từ tế bào mầm kiểm sốt xác biểu gene Kết luận, cho thấy tái lập trình nhân cho từ nguyên sợi bào khác thường tái lập trình quan trọng lí dẫn đến chết sớm tạo dị thường nhân cho từ tế bào biệt hóa 84 Hình 2.21 Con đường tương tác yếu tố liên quan trình tái lập trình nhân (Lee ctv, 2006) Một nghiên cứu khác cho thấy có gene điều hịa Oct4, Sox2 Nanog phiên mã quan trọng Bổ trợ cho hoạt động gene protein thuộc nhóm Polycomb yếu tố kìm hãm phiên mã, chức trì đồng tế bào suốt thời kỳ phát triển diễn tái lập trình ngồi nhân cấu trúc nhiễm sắc thể Chẳng hạn chúng có khả kìm hãm gene phát triển ES tế bào Ba gene Oct4, Sox2 Nanog gene chìa khóa cho việc 85 kiểm soát cấu trúc nhiễm sắc thể trì phát triển mang tính vạn tế bào Trong đó, Otc4 Nanog yếu tố then chốt Oct4 protein liên kết với DNA có vai trị kích hoạt ngăn cản phiên mã gene, đặc biệt giai đoạn phát triển đầu phơi biệt hóa tế bào Mặc dù có nhiều heo sản xuất chuyển nhân từ tế bào sinh dưỡng khác đa số chúng chết giai đoạn thai kỳ đặc biệt giai đoạn phát triển có biệt hóa, định vị lúc xuất vài phát triển khác thường Một nguyên nhân cho phát triển khác thường tái lập trình ngồi nhân geneome nhân cho từ tế bào sinh dưỡng Nhân cho phải tương thích với phát triển phơi Tuy nhiên tái lập trình nhân dẫn đến số gene Oct-4 gene họ biểu số cịn lại khơng biểu Sự phát triển qua giai đoạn biểu khác thường cho thấy giới hạn khả năng, tiềm phát triển đến thể hoàn chỉnh Thêm vào vài kiện bị bỏ qua hạn chế hình thành mặt hình thái phơi blastocyst thơng thường biểu sai số gene 2.3 Hoạt hóa trứng 2.3.1 Chu kỳ tế bào Nếu tế bào cho giai đoạn sau chu kì (S hay G2) chuyển vào trứng, nhân tế bào cho hồn tất vịng tổng hợp DNA khác sau chuyển Điều có ảnh hưởng xấu lên tiềm phát triển phôi Nếu tế bào cho pha S hay G2 trứng nhận phải tiền hoạt hóa cho phù hợp với phát triển 2.3.2 Cơ chế hoạt hóa trứng Sau nhân cho chuyển vào tế bào chất trứng, trứng phải kích thích để khởi động lại trình phân chia Theo ý tưởng này, chế hồn tồn tương tự hoạt hóa tinh trùng thụ tinh (Machaty ctv, 1999) đời Những lý thuyết (đang tranh cãi) chế hoạt hóa trứng bao gồm: - Khi tinh trùng tiếp xúc với bề mặt trứng, chúng chuyển tín hiệu qua màng tế bào để cung cấp tín hiệu cho phát triển - Việc tinh trùng vào đến tế bào chất trứng tín hiệu để chúng bắt đầu phát triển Một vài nghiên cứu tương tự tín hiệu bao gồm integrindisintegrin (Campbell ctv, 2000) yếu tố tinh trùng (Machaty ctv, 2000) tinh trùng sử dụng nhiều chế để truyền tín hiệu cho trứng bắt đầu phát triển Có số lượng lớn phương pháp hoạt hóa sinh sản đơn tính, nhiều trường hợp chúng sử dụng việc liên kết hay nhiều đường hoạt hóa Sự hoạt hóa có liên hệ đặc biệt với nhân chuyển vào Tao ctv (2000) loại calcium khỏi môi trường sau hoạt hóa đơn tính nhận thấy tỷ lệ phôi blastocyst giảm lại tăng tỷ lệ phôi giai đoạn phôi dâu “morula 86 stage” Trong báo cáo khác Tao ctv (2000) ông sử dụng tế bào huyền phù phương pháp xử lý thimerosal/dithiothreitol tạo phơi đến giai đoạn blastocyst Grupen ctv (1999) tiến hành xung điện lần hai, 30 phút sau lần thứ trứng trưởng thành, kết phôi phát triển tốt đến giai đoạn blastocyst (51%) so với nghiên cứu khác tiến hành xung điện lần (34%), xung điện lần thứ lại gây bất lợi cho phát triển Tuy nhiên trứng trưởng thành in vitro lần xung điện cho kết phát triển tốt (31%) thực lần xung điện (16%) Koo ctv (2000) nghiên cứu khả phát triển phôi heo sau chuyển nhân tế bào sinh dưỡng Nguyên sợi bào heo lấy từ thai 40 ngày Trứng nuôi cấy in vitro loại nhân kích thích xung điện để hịa nhập với nhân tế bào sinh dưỡng Khi kích hoạt trứng dịng điện 120V/mm thu tỷ lệ phát triển phơi giai đoạn blastocyst 11,6 ± 1,6%, kết cao xử lý 150 V/mm, điều có nghĩa số blastocyst thu thí nghiệm Tỷ lệ phơi phát triển đến blastocyst kích thích xung điện thời gian khác khác (2, 4, giờ) tỷ lệ phát triển 11,6 ± 2,9, 6,6 ± 2,3 8,1 ± 3,3% Song song đó, năm 2001, Park ctv nghiên cứu trứng trưởng thành từ 42 - 44 giai đoạn metaphase II chuyển nhân nguyên sợi bào đem xử lý xung điện Với cường độ xử lý 1,2 kV/cm 30 μsec cho kết số phôi phát triển đến giai đoạn blastocyst 18,1 ± 3,1%, 1,3 kV/cm lần (16,4 ± 1,1%), 1,2 kV/cm lần 11,4 ± 2,0%, 1,3kV/cm lần (3,5% ± 1,7%) Điều có nghĩa việc xử lý xung điện lần không cho kết tốt xử lý lần 2.4 Sự phát triển in vitro phôi chuyển nhân  Các giai đoạn phát triển Theo Kidson (2005), sản xuất phơi in vitro địi hỏi phải quan tâm đến biến đổi phát triển trứng phơi như: chín trứng, chuyển nhân, hình thành khối đặc, hình thành blastocyst, hết phát triển phôi thể Năm 2001, Kühholzer Prather thấy giai đoạn tái lập trình nhân chuyển hầu hết gene biểu hiện, cấu trúc thay đổi, ngắn dần telomeres, tượng tạo dị ty thể Lai ctv (2001), ghi nhận nhân giai đoạn G2/M G0/G1 chuyển vào trứng trưởng thành in vitro sau 1-2 màng nhân vỡ ra, nhiễm sắc thể đặc lại, sau 1-1,5 sau hoạt hóa tổ chức vi sợi hình thành bao quanh nhiễm sắc chất Sự cô đặc nhiễm sắc thể dễ dàng nhìn thấy sau 2-4 sau hoạt hóa Hầu hết 80,6% nỗn giai đoạn G2/M tái tổ chức lại, thể cực thứ bị đẩy ngồi Song song đó, Kang Y.K cộng (2001) nhận thấy có tượng demethyl hóa xảy phơi heo chuyển nhân Đây tượng cải biên, tái thiết lập cấu trúc nhiễm sắc thể methyl hóa DNA histone số vị trí Hiện tượng kèm với acetyl hóa, phosphoryl hóa ubiquitine hóa histone Sự methyl hóa DNA liên quan đến việc gắn nhóm methyl vào vị trí 5’ cytosine xảy vùng DNA giàu 87 GC Thay histone (liên kết cứng nhiễm sắc chất tế bào biệt hóa), histone (liên kết lỏng lẻo tế bào gốc vạn năng) Ở có methyl hóa lysine 27 histone Phơi chuyển nhân phải demethyl hóa đặc trưng có mức độ methyl hóa nhân để trì tính vạn thiếu demethyl phân chia phôi sớm bị sai lệch  Các công bố phát triển phơi chuyển nhân Đã có nhiều công bố phát triển đến giai đoạn blastocyst phôi chuyển nhân Chen ctv (1999) tạo blastocyst chuyển nhân từ dòng tế bào sterm cell Trái lại Tao ctv (1999) sử dụng phương pháp vi tiêm nhân nguyên sợi bào thai kỳ vào trứng trưởng thành in vitro kết thu 5% blastocyst Verma ctv 2000 tạo phôi giai đoạn blastocyst 1-7% Koo ctv (2000) lại tạo 6-11% Số lượng acid nucleic tăng lên giai đoạn blastocyst sau hoạt hóa từ 2-6h sau chuyển nhân Theo công bố Kuhholzer ctv (2000) sản phẩm phơi blastocyst chuyển nhân có nguồn gốc từ nguyên sợi bào thai kỳ chuyển vào trứng trưởng thành in vitro, trứng hoạt hóa thimerosal/dithiothreitol Trong hầu hết trường hợp tỷ lệ phát triển đến giai đoạn blastocyst thấp Theo Uhm ctv (2000) nguyên sợi bào thai kỳ trực tiếp phát triển đến giai đoạn phôi dâu hay blastocyst với tỷ lệ cao (24%) so với tế bào cumulus (8%) Koo ctv (2001) cho phơi phát triển đến blastocyst có biểu GFP 2.5 Vấn đề sản xuất heo chuyển nhân Khi đề cập đến động vật chuyển nhân người ta quan tâm đến kiểu hình bất thường đời Kiểu hình thường thấy không đồng trọng lượng sinh Kiểu hình khác thường có tính đặc hiệu lồi, ví dụ co gân (contracted tendons) heo Những heo chuyển gene nhóm nghiên cứu (Prather ctv, 2004) tạo chuyển trứng, IVF IVC đến giai đoạn blastocyst bị co gân Con heo sau có 24 khơng bị co gân mẹ Khi mẹ nhân dòng, sinh bị co gân Hai heo chuyển nhân (NT7 NT10) bắt nguồn từ nguyên bào sợi da tai heo chuyển nhân (Park ctv, 2002) NT7 có chân bất thường: móng chân trái trước lớn bất thường (mũi tên ngắn) chân phải trước có móng (mũi tên dài) 88 Hình 2.22 Hai heo chuyển nhân (Park ctv, 2002) Năm 2002, Carter ctv công bố tượng giảm khả sống xuất mẫm cảm với bệnh vấn đề tim heo chuyển gene nhân dòng Người ta cho kiểu hình khơng truyền cho hệ sau kiểu methyl hóa DNA geneome tái thiết lập (reestablish) suốt trình hình thành giao tử bị biến đổi suốt giai đoạn nuôi cấy tế bào cho hay phơi Vai trị methyl hóa DNA việc điều hịa biểu gene mơ tả kĩ chí tác động đến đặc tính kiểu màu lơng Sự methyl hóa DNA khác thường thể rõ vài bất thường phôi hay sinh từ chuyển nhân Một ví dụ heo tượng lưỡi dài (enlarged tongue hay macroglossia) Sự khử methyl hóa chủ động xảy geneome bố hợp tử, tiếp đến khử methyl hóa bị động đặc hiệu gene suốt phân cắt sớm methyl hóa de novo tế bào ICM blastocyst Các phơi nhân dịng thất bại phục hồi lại kiểu khử methyl hóa bình thường methyl hóa đặc hiệu gene bình thường quan sát suốt thời kì hình thành phơi Những nghiên cứu xa cần hồn thành để hiểu kiểu methyl hóa bình thường thiết lập cách kiểu phục hồi suốt IVC sau chuyển nhân 2.6 Ứng dụng tạo đời kỹ thuật chuyển nhân Trong năm 2000 có phịng thí nghiệm cơng bố có heo sinh từ kỹ thuật chuyển nhân Họ sử dụng kỹ thuật khác để hồn thiện quy trình chuyển nhân Năm 2000, cơng bố hàng loạt cơng trình nghiên cứu trứng trưởng thành in vitro Betthauser ctv; Polejaeva ctv; Onishi ctv Trong nghiên cứu Onishi ông sử dụng phương pháp vi tiêm, hai nghiên cứu cịn lại sử dụng tế bào huyền phù cơng cụ chuyển nhân, riêng nghiên cứu Polejaeva sử dụng loại tế bào trứng (tế bào trứng loại nhân giai đoạn metaphase II tế bào trứng giai đoạn tiền nhân loại nhân Phương pháp hoạt hóa trứng ban đầu phương pháp xung điện, vài nghiên cứu sau sử dụng phương thể mang ion dimethyaminopurine DMAP 89 Hình 2.23 Tạo heo chuyển gene nhân dịng kỹ thuật SCNT với tế bào cho nhân lấy từ phương pháp chuyển gene sử dụng ICSI (Kurome ctv, 2006) Theo hình 2.24 Tế bào cho nhân lấy từ heo chuyển gene bị viêm khớp (có sử dụng ICSI) Các tế bào thị trường sáng (a) kính hiển vi huỳnh quang (b) cho thấy khơng có dấu hiệu khảm chuyển gene Các blastocysts nhân dòng (c) bào thai heo chuyển gene-nhân dòng (d) tạo nên SCNT tế bào cho nhân hình a b Một heo chuyển gene-nhân dòng sống (e) Park ctv (2001) việc chuyển nhân vào trứng loại nhân tạo dịng heo có mức độ thể protein EGFP cách rõ ràng Nhân chuyển thường sử dụng từ tế bào giai đoạn G2/M, nguyên sợi bào heo ngày tuổi (park ctv, 2000) thú trưởng thành (Bondioli ctv, 2001) tạo điều kiện cho tái lập trình diễn tạo dòng heo chuyển nhân Theo Lai ctv (2002b) gene mã hóa α-(1,3)-galactosyltransferase bị đóng thể heo con, cách sử dụng nguyên sợi bào kỹ thuật chuyển nhân cho khả tạo heo chuyển nhân cao Ngoài việc gene bị đóng dịng heo tạo sử dụng cho việc chuyển endogeneous retrovirus lên dòng tế bào người in vitro Do dàn heo có giá trị phương pháp ghép dị chủng Park ctv, 2001, cho thấy việc chuyển nhân chuyển gene vào trứng loại nhân dẫn đến việc tạo heo chuyển gene biểu protein phát huỳnh quang xanh GFP Thú vị, nhân G2/M dùng nhân cho cho đời vơ tính; nguyên bào sợi bắt nguồn từ heo sinh (neonate) chuyển gene ngày tuổi heo trưởng thành tái lập trình để tạo đời chuyển gene vơ tính 90 PHẦN Kết luận Sự phát triển phôi in vitro sau chuyển nhân bắt đầu sau hoạt hóa Sau 1-2 màng nhân vỡ nhiễm sắc thể đặc lại Sau 1-1.5 sau hoạt hóa tổ chức vi sợi hình thành bao quanh nhiễm sắc chất Sau 2-4 có cô đặc nhiễm sắc thể, thể cực thứ bị đẩy Lúc lúc tượng dimethyl hóa xảy phơi heo chuyển nhân, tái thiết lập cấu trúc nhiễm sắc thể Hiện tượng kèm với acetyl hóa, phosphoryl hóa ubiquitine hóa histone Sau tế bào phân chia hình thành blastocyst Các phương pháp hoạt hóa nhân chính: loại calcium khỏi môi trường, phương pháp xử lý thimerosal/dithiothreitol, tiến hành xung điện Tạo dòng nhiều vấn đề như: tỷ lệ thành công thấp, đời sinh giảm sức sống, có kiểu hình bất thường do: Kiểu methyl hóa DNA geneome, tái thiết lập, bị biến đổi suốt giai đoạn nuôi cấy tế bào cho hay phôi Trải qua thập kỷ kỷ nguyên động vật chuyển nhân, cloning, chuyển gene Sự phát triển giai đoạn tế bào sử dụng nhân cho từ nguyên sợi bào thai đến tế bào trưởng thành Tương lai phát triển động vật chuyển gene cung cấp ứng dụng y sinh học mà cho lĩnh vực nông nghiệp 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO Lee E, Lee S H., Kim S., Jeong Y W., Kim J H, Koo O J., Park S M., Hashem M.A, Hossein M.S., Son H Y., Lee C K., Hwang W S., Kang S K., Lee B C., 2006 Analysis of nuclear reprogramming in cloned miniature pig embryos by expression of Oct-4 and Oct-4 related genees Elsevier 348: 1419–1428 Cibelli J., Lanza R P., Campbell K H S and West M D., 2002 Principles of cloning Academic Press, Amsterdam, Holland P 367 -374 Kidson A., 2005 In vitro embryo development in the pig Veterinary sciences tomorrow Lai L., Tao T., MachátyZ., Kühholzer B., Sun Q.Y., Park K.W., Bill N., Prather R.S., 2001 Feasibility of Producing Porcine Nuclear Transfer Embryos by Using G2/M-Stage Fetal Fibroblasts as Donors Biology of Reproduction 65: 15581564 Prather R S., Sutovsky P., and Green J A, 2004 Nuclear Remodeling and Reprogramming in Transgeneic Pig Production Exp Biol Med 229:1120–1126 Ryan C., Duane D.s, Mark W., Bruce S., Deryl T., 2006 Expression of early transcription factors Oct-4, Sox-2 and Nanog by porcine umbilical cord (PUC) matrix cells Reprod Biol Endocrinol 4: 92 ... đích sử dụng mà chọn tế bào chủ thích hợp Các tế bào chủ chia làm hai hệ thống chính, tế bào chủ nhân sơ tế bào chủ nhân chuẩn 1.2.6.1 Tế bào chủ nhân sơ Một loại tế bào chủ lý tưởng tế bào cần... vật 18 Các tế bào động vật nuôi phức tạp, điều kiện cần thiết cho biểu protein có hoạt tính sinh học, người ta sử dụng tế bào chủ động vật Các loại tế bào chủ động vật bao gồm:  Tế bào thận khỉ... dần tế bào già bên bong ra, tế bào sừng (chứa nhiều sừng) Tế bào sừng tế bào có nguồn gốc từ ngoại phơi bì phân bố khắp biểu bì (chiếm 95% tổng số tế bào lớp biểu bì), có hoạt động phân bào tế bào