Sự biệt hóa của các tế bào bao gồm những sự thay đổi lượng lớn của các yếu tố ngoại di truyền, hạn chế cấu trúc đặc biệt tiếp cận trong bộ gen. Kết hợp với những thay đổi trong mơ hình của nhân tố phiên mã với sự điều chỉnh lại nhiều yếu tố được biểu hiện rất hạn chế trong giai đoạn đa năng. Kết quả là làm thay đổi biểu hiện gene tổng thể. Đến nay, khơng có bằng chứng nào chứng minh tái lập trình nhân tế bào sinh dưỡng có thể thực hiện thành công dựa vào một vài yếu tố quan trọng mà là sự kết hợp của nhiều yếu tố.
2.2.1. Tái lập trình nhân bằng chuyển nhân
a. Chuyển nhân (transfer nuclear)
Chuyển nhân là quá trình đưa nhân của tế bào cho đã trưởng thành vào tế bào nhận (trứng chưa thụ tinh đã được loại bỏ nhân). Sau đó, trứng được kích thích phát triển thành phơi, mỗi phơi tạo dịng khi tới một giai đoạn thích hợp được chuyển vào tử cung của động vật mang thai hộ và tiếp tục sinh trưởng, phát triển cho đến lúc được sinh ra.
Thơng thường, một nỗn trưởng thành hay một trứng chưa thụ tinh được sử dụng làm tế bào nhận. Tế bào nhận ở giai đoạn trung kỳ II (metaphase II) lúc này nhiễm sắc thể đang được nén chặt và tập trung ở mặt xích đạo của thoi vơ sắc sẽ được loại bỏ nhân.
Tế bào cho nhân của động vật cần nhân bản, gồm hai loại:
+ Tế bào vạn năng (pluripotent cell), là tế bào ở giai đoạn phôi nang hoặc phôi dâu.
63 + Tế bào sinh dưỡng (somatic cell). Tế bào sinh dưỡng là bất cứ tế bào nào hình thành nên cơ quan, bao gồm tế bào biệt hóa và tế bào gốc (organ stem cell).
b. Quy trình chuyển nhân cơ bản
Chuẩn bị tế bào chất nhận
Các trứng chưa thụ tinh được sử dụng như tế bào nhận nhân mới, sau khi loại bỏ nhân của chúng.
Trong một số nghiên cứu, nhân của trứng chỉ được loại bỏ sau khi đã chuyển nhân ngoại lai vào (Munsine và ctv, 2000).
Sử dụng trứng ở giai đoạn MII có thể cải thiện sự tái lập trình nhân do có sự hiện diện của MPF (maturation promoting factor). MPF gồm có 2 phần: phần lớn là cycline B và phần nhỏ là cdk (cyclin dependent kinase). Cycline B thường được dự trữ ở trong mRNA ở tế bào chất của nỗn, chúng được tích tụ trong giai đoạn S và bị phân hủy khi tế bào bắt đầu phân chia. Cdk hoạt hóa q trình phân chia bằng cách phosphoryl hóa nhiều loại protein giúp nhiễm sắc thể đóng xoắn, màng nhân tiêu biến và thoi phân bào được thành lập. Theo Miyoshi và ctv (2001), MPF có tính hoạt hóa sẽ cảm ứng phá vỡ màng nhân, cô đặc NST, tạo điều kiện tiếp xúc cho toàn bộ NST với các nhân tố cần thiết cho sự phát triển có sẵn trong trứng.
Chuẩn bị tế bào cho nhân
Tế bào cho nhân có thể được nuôi in vitro. Các tế bào cho có thể lấy từ nhiều
nguồn khác nhau với các mức biệt hóa khác nhau: tế bào tuyến vú trong nhân bản cừu Dolly, tế bào mô cơ (Vignon và ctv, 1995), tế bào đuôi (Wakayama và Yanagimachi, 1999), tế bào thần kinh vỏ não (Yamazaki và ctv, 2001); tế bào mơ tinh hồn (Inoue và ctv, 2003), tế bào gốc da (Heyman và ctv, 2002), tế bào mô sẹo (Inoue và ctv, 2003), tế bào gốc (Saito và ctv, 2003), tế bào máu (Panelli và ctv, 2004).
Sự phù hợp giữa chu kì của tế bào cho nhân và trạng thái tế bào chất của trứng luôn ảnh hưởng lớn đến sự thành công trong tạo dịng vơ tính.
Chuyển nhân
Phương pháp thơng thường để chuyển nhân của tế bào cho vào trứng nhận là dung hợp màng hai tế bào trên. Ba kỹ thuật phổ biến: Kích thích bằng xung điện, xử lý hóa chất (polyethylen glycol – PEG) và dùng virus Sendai.
Thành phần môi trường dung hợp cho chuyển nhân: Mannitol 0,3M, MgSO4 0,1 mM, CaCl2 0,05 mM.
Nhiệt độ có ảnh hưởng đến quá trình dung hợp, do đó phải duy trì nhiệt độ ổn định.
Khi dung hợp bằng điện, phức hợp trứng – tế bào được đặt trong môi trường nhược trương nhẹ. Phát xung điện một chiều với điện áp cao sẽ làm phá vỡ cấu trúc phospholipid trên màng, tạo những lỗ hổng. Trong quá trình hàn gắn, các màng sẽ dung hợp với nhau. Tỷ lệ thành cơng với dung hợp điện ở bị từ 36 – 89%, heo là 59%, cừu là 63 – 85% (Wilmut và ctv, 1997; Well và ctv, 1998).
64 Dung hợp bằng virus Sendai đã bị bất hoạt thường có hiệu quả thấp (43 – 69%) nên ít được sử dụng. Nếu sử dụng kết hợp xung điện và virus Sendai thì kết quả cao hơn.
Kỹ thuật mới bỏ qua bước dung hợp hay tách nhân tế bào, được đưa ra bởi Jang- Won Lee (2003) là sử dụng tế bào cho nguyên vẹn tiêm thẳng vào trứng đã loại nhân. Quy trình này được áp dụng để tạo dịng heo với nhân cho là tế bào cumulus và đạt tỉ lệ thành công cao.
Tế bào được chuyển vào trong khoảng khơng quanh hồng thể của trứng. Trước khi đâm thủng màng zona pellucina, tế bào được định vị gần với đầu pipet để làm giảm lượng môi trường đi vào trong trứng. Sử dụng bộ phận vi tiêm để đẩy tế bào ra khỏi pipet vào khoang trứng khi đã đặt chúng tiếp xúc với màng trứng ở vị trí hồng thể và sau đó rút pipet ra. Sau khi dung hợp, tiến hành hoạt hóa trứng và ni phơi.
Hoạt hóa phơi
Phơi một tế bào được hoạt hóa bằng các tín hiệu hóa học hay xung điện để khởi động quá trình phát triển tiếp theo.
Nuôi và cấy phôi
Phôi sau khi hoạt hóa được ni in vitro trong mơi trường với thời gian thích hợp. Sau khi phơi phát triển tới giai đoạn phơi nang (blastocyst) thì cho cấy truyền.
2.2.2. Tái lập trình nhân bằng dung hợp tế bào
a. Dung hợp tế bào (cell fusion) trứng với tế bào 2n
Hình 2.12. Qui trình tạo cừu Dolly
65 Tiến hành dung hợp tế bào biệt hóa và tế bào tồn năng có thể hình thành một tế bào vạn năng có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào nhưng khơng có khả năng phát triển thành phơi. Việc tái lập trình của tế bào dung hợp này có thể khơng ổn định và khó kiểm sốt.
b. Các bước tái lập trình nhân
Trong các kết quả kiểu hình lai tế bào gốc đa năng thường chiếm ưu thế hơn so với các soma đối tác. Các chứng cứ sau đây chứng minh điều này:
(i) Sự bất hoạt NST X là cần thiết để cân bằng với lượng gen liên kết với NST X giữa con cái XX và con đực XY. Ở chuột một NST khơng hoạt động ở con cái sẽ sớm được kích hoạt khi chúng tham gia vào sự phát triển của tuyến sinh dục. Sự kích hoạt lại NST X được coi là một phương diện trong việc tái lập trình lại gen tổng thể có liên quan đến tính tồn năng và đa năng.
(ii) Trong chuột chuyển gen Oct4-GFP (green fluorescent protein), GFP biểu hiện trong các tế bào gốc đa năng nhưng không phải trong các thymocyte. Sự dung hợp thymocyte với ES (không gắn GFP) các tế bào được kích hoạt GFP thể hiện trong các thể lai (hybrid) (Tada và ctv, 2001).
(iii) Sự dung hợp giữa murine P19 và tế bào lympho T ở người, thể lai biểu hiện Oct4 và Sox2 chuyên biệt là tăng biểu hiện trong khi một tế bào bạch huyết CD45 đánh dấu là giảm biểu hiện.
(iv) Khi dung hợp tế bào fibroblast có Rex-1 GFP với các tế bào ES khơng mang GFP. Các fibroblast khơng có bất cứ biểu hiện nào của GFP, nhưng ở các thể lai có sự biểu hiện của Rex-1 GFP và tính vạn năng được thể hiện như yếu tố phiên mã Oct4, alkaline phosphatase hoạt động, hoạt hóa telomerase và các kháng nguyên bề mặt như SSEA4, TRA 1-61, TRA 1-81. Hơn nữa khi kiểm tra các fibroblast và thể lai, sự biểu hiện gen sinh dưỡng đã giảm trong thể lai.
Những kết quả trên đã đặt ra câu hỏi: liệu nhân tế bào soma đã tái lập trình đầy đủ và có khả năng duy trì tính vạn năng khi khơng có bộ gen của tế bào ES (hoặc EC). Điều quan trọng là làm thế nào để loại bỏ NST tế bào ES sau khi nhân tế bào soma đã tái lập trình hồn tồn (Cowan và ctv, 2005).
Hình 2.13. Mơ hình loại bỏ NST (gen MHC) bằng CEC (Matsumura và ctv, 2007).
Để giải quyết những vấn đề trên Matsumura và cộng sự đã thiết kế một casette loại bỏ NST (CEC- chromosomal elimination casette). MHC (major histocompatibility
66 complex) có ở tế bào gốc để sản xuất các mô thay thế. Đa số các gen MHC lớp I và II tập trung trên NST số 6 và 17 ở chuột. Việc loại bỏ gen MHC có nguồn gốc từ tế bào ES trong thể lai có thể cho một MHC chuyên biệt cho tế bào lai. Phương pháp CEC (chromosome elimination cassette) giúp loại bỏ các NST chứa gen MHC của tế bào ES thay thế bằng các gen MHC có nguồn gốc từ tế bào soma bàng cách sử dụng một microcellmediated chuyên biệt trong kỹ thuật chuyển NST (Tomizuka và ctv, 1997).
2.2.3. Tái lập trình nhân bằng dịch chiết tế bào
a. Dịch chiết tế bào (cell extract)
Những tế bào thấm được có thể thu nhận dịch chiết của những tế bào vạn năng. Tế bào được xử lý với những chất đành dấu vạn năng tái biểu hiện và tái biệt hóa thành những dịng khác nhau.
Phương pháp này có những biểu hiện hạn chế của tế bào ban đầu và việc tái lập trình chỉ xảy ra ở mức độ giới hạn thấp.
b. Các bước tái lập trình nhân
Dịch chiết tế bào đã được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu nhân tế bào như sự nhân đơi DNA, NST và tính năng động của màng nhân (Martins và ctv, 2000; Poccia và Collas, 1996).
Các ứng dụng dịch chiết tế bào để nghiên cứu tái lập trình nhân được nhóm Collas dùng chiết xuất tế bào T và tế bào thần kinh, các tế bào thận HEK293T của người có thể được tái lập trình để tạo các gene chuyên biệt của tế bào T và các gene tế bào thần kinh. Quy trình được áp dụng đối với tế bào lympho người, tuy nhiên, các tế bào mới có tuổi thọ giới hạn và khơng biểu hiện kháng nguyên bề mặt của các tế bào gốc vạn năng cho thấy việc tái lập trình khơng hồn tồn.
Trong một nghiên cứu tính đa năng chiết xuất ES và EC được sử dụng để tái lập trình tế bào 293T (Taranger và ctv, 2005). Tế bào 293T được tiếp xúc với chiết xuất tế bào EC: i) Các promoter của các gene đa năng như Oct4, Nanog được demethylate; ii) NST tại Oct4 và Nanog sửa đổi để hỗ trợ sao chép; iii) Biểu hiện gene Oct4, Nanog tăng mạnh; iv) khả năng biệt hóa đối với dòng tế bào thần kinh, tế bào mỡ (adipogenic), nguyên bào xương (osteogenic) và nội mô được tăng cao. Tóm lại, tế bào chất của tế bào vạn năng có khả năng tái lập trình tế bào soma.
2.2.4. Cấy ghép tế bào
Sự biểu hiện ngồi nhân của các gen kiểm sốt q trình tái lập trình có vai trị như đối với những tế bào vạn năng giúp quá trình xảy ra và hình thành những tế bào vạn năng mới. Tuy nhiên, việc tái kích hoạt những gen được chuyển có thể là xuất hiện các oncogen làm chết cá thể con vì ung thư.
67
Hình 2.14. Tái lập trình nhân (Gurdon và Melton, 2008).
Mũi tên thẳng đại diện cho quá trình bình thường của sự biệt hóa tế bào trong q trình phát triển từ một trứng được thụ tinh đến những tế bào trưởng thành và mô.
Mũi tên cong đại diện cho tái lập trình nhân (A) bằng cách chuyển nhân vào trứng, (B) tạo tế bào iPs, (C) Chuyển đổi trở lại ra theo một hướng khác, (D) Chuyển đổi trực tiếp. Phần dưới của hình lập trình tạo tế bào gốc phơi (ES) có thể tổng hợp thành một thể phôi (EB- embryoid body), nuôi cấy biệt hóa khác (Diff), hoặc cấy vào một túi phôi. Và tạo thành những loại tế bào trưởng thành (Gurdon và Melton, 2008).
2.2.5. Tái lập trình nhân bởi các phân tử nhỏ
Một vài chứng cứ cho thấy rằng sự biểu hiện quá mức hoặc mất chức năng của một gene đơn có thể tạo điều kiện thay đổi tế bào soma. Trong hệ thống thần kinh, các tế bào tiền thân oligodentrocyte có thể được tái lập trình thành tế bào gốc thần kinh đa năng khi nuôi trong huyết thanh thai bê và FGF (Fibroblast growth factor) (Baba và ctv, 2005).
68 Khi tái lập trình tế bào fibroblast của chuột thành tế bào ES cần kết hợp 4 gene Oct4, Sox2, C-Myc và Klf, và cần loại bỏ gene Nanog. Cũng như các tế bào ES, các tế bào được tái lập trình hình thành các phần phôi khi được ni cấy và hình thành teratoma (là một dạng u phát triển từ tế bào mầm) khi tiêm vào chuột.
Hình 2.16. Tái lập trình bởi các yếu tố xác định
Phơi và fibroblast ở chuột được đánh dấu β-geo điều khiển bởi một ES-promoter chuyên biệt (Fbx15) được tải nạp bằng retrovirus, mã hóa các gene Oct4, Sox2, C- Myc và Klf4. Những yếu tố này tái lập trình các fibroblast tế bào cảm ứng vạn năng (iPS) và có nhiều thuộc tính tương tự như tế bào ES (Rodolfa và Eggan, 2006).
Mặc dù các tế bào cảm ứng biệt hóa thành 3 lớp phơi khẳng định tính đa năng của chúng nhưng khi tiêm vào blastocyst kết quả khơng thành cơng. Do đó các tế bào khơng tái lập trình đầy đủ. Ngoài ra, chưa biết được bốn yếu tố trên có đủ tái lập trình ở tế bào người hay cần thêm những yếu tố khác.
2.3. Các yếu tố kiểm sốt q trình tái lập trình nhân
Nghiên cứu của Takahashi và Yamanaka cho thấy có sự liên quan giữa hoạt động của gene Oct-4, Nanog và Sox2 trong blastocyst được tạo dòng từ tế bào sinh dưỡng và sự phát triển bất thường của dòng. Ngược lại, những dòng từ nguồn ES (embryo sterm), EG (embryo germ), EC (embryo carcinoma) thì biểu hiện gene Oct-4 và hiệu quả tạo dòng tăng hơn.
Hình 2.15. Tái lập trình bởi các phân tử nhỏ. Reversine, phân tử nhỏ trung gian biệt hóa dịng tế bào myoblast C2C12 ở chuột thành các tế bào gốc đa năng. Những tế bào này sau đó được biệt hóa thành tế bào mỡ hoặc nguyên bào xương (Ding và Schultz, 2004).
69 Rất nhiều yếu tố điều hịa của tiến trình này được ghi nhận bao gồm cả các yếu tố môi trường ngoại bào cũng như các yếu tố trong nhân và ngoài nhân. Ngày nay, người ta đã bắt đầu từng bước hiểu về cơ chế trong nhân và ngồi nhân giúp duy trì tình trạng chưa biệt hóa của những tế bào gốc phôi trong khi cho phép những tế bào này duy trì sự cân bằng với những tế bào khác trong sự phát triển của tế bào sinh dưỡng.
2.3.1. Các yếu tố ngoài tế bào
Các yếu tố ngoài tế bào tham gia điều hịa q trình tái lập trình nhân bao gồm phức hợp các yếu tố hoạt động theo những con đường hoạt hóa riêng, đan xen nhau, chủ yếu từ những tín hiệu truyền tin qua màng.
a. LIF (leukemia inhibitort factor): là một protein thuộc họ cytokine, cho phép
phôi duy trì tính tồn năng. LIF là protein hòa tan, được tiết vào trong serum, trong điều kiện ni cấy có bổ sung LIF trong serum cũng cho kết quả tương tự.
Cơ chế hoạt động của LIF là liên kết với LIFR-gp130 heterodimer tại bề mặt tế bào và hoạt hóa tín hiệu truyền tin STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3). Sau khi được hoạt hóa, STAT3 sẽ tự phosphoryl hóa và dimmer hóa chính nó trước khi chuyển vị vào bên trong nhân và tại đây nó hoạt động như một yếu tố phiên mã. Hiện nay, đích cuối của STAT3 ở vùng downstream vẫn chỉ biết một phần là c-Myc.
Ngồi việc hoạt hóa STAT3, LIF cũng cảm ứng tín hiệu khác như hoạt hóa ERK (extracellular receptor kinase) (Burdon và ctv, 1999). Khi ERK hoạt hóa sẽ kích thích sự biệt hóa, do đó, sự cân bằng giữa trạng thái hoạt hóa STAT3 và ERK sẽ quyết định tế bào ES hoặc phân chia bình thường hoặc biệt hóa. Vì vậy, các tín hiệu kiểm sốt sự hoạt hóa ERK đóng vai trị quan trọng nhằm duy trì trạng thái khơng biệt hóa.
b. BMP4 (Bone Morphogenetic Protein-4): là protein thuộc họ TGFβ
(transforming growth factor beta ligands), BMP4 có khả năng liên kết với thụ thể kinase của serine hoặc threonine. Vùng downstream của BMP4 là protein SMAD. BMP4 có chức năng kiểm sốt biệt hóa tế bào hơn là kích hoạt tự sinh.
BMP4 có vai trị trong sự tự làm mới của mES thơng qua hoạt hóa các protein SMAD. Chúng sẽ hoạt hóa gen Id, là nhân tố bHLH âm. Các mES có Id được hoạt hóa có thể phát triển trong mơi trường khơng huyết thanh và khơng có BMP4. Huyết thanh cũng cho thấy sự biểu hiện của gen Id thông qua nhiều con đường và mES phát triển
trong sự hiện diện của huyết thanh, khơng bổ sung BMP4 thì các gen Id biểu hiện.