PHẦN 1. Mở đầu
Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học hiện đại, công nghệ tạo dịng vơ tính (cloning) cũng đang phát triển nhanh chóng và ngày càng có vị thế quan trọng trong nghiên cứu y sinh và trong sản xuất nơng nghiệp. Tuy cịn nhiều tranh cãi xoay quanh vấn đề đạo đức đã phần nào hạn chế những nghiên cứu nhưng do lợi ích to lớn mà cơng nghệ này đem lại vì vậy người ta vẫn đã và đang tạo nên lượng lớn động vật nhân bản trong đó có heo. Mục đích tạo con vật mang những biến đổi di truyền chuyên biệt. Hiện nay, cơng tác nhân dịng và tạo heo chuyển gene là nỗ lực có ý nghĩa quan trọng.
Heo là một động vật có ý nghĩa quan trọng trong các nghiên cứu y sinh vì chúng là mơ hình cực tốt cho các nghiên cứu về bệnh tim mạch, các bệnh về da, nghiên cứu độc chất học, tổng hợp lipoprotein và bệnh vi sinh lây lan trong đường ruột. Nhờ những động vật mơ hình này mà chúng ta ngày càng tiếp cận thử nghiệm, giải quyết những căn bệnh hiểm nghèo như ung thư, tiểu đường… (tạo mơ hình động vật mang khối u của người hay bệnh tiểu đường nhờ được chuyển gen quy định các bệnh này). Chúng cũng thường được xem như một nguồn cung cấp cơ quan tiềm năng trong việc ghép dị chủng (xenotransplantation). Sự phát triển và cải tiến hệ thống nhân dịng phơi heo hứa hẹn sẽ mang lại những ứng dụng to lớn cho lĩnh vực y sinh học. Q trình cloning có thể dẫn đến sự phát triển, sự tạo mô cho các bệnh về chứng xơ hóa, lỗng xương, hay bệnh tiểu đường.
Nhân dịng heo còn đem lại sự cải thiện lớn trong sản xuất thịt và khả năng cung cấp nguồn thực phẩm lớn cho số dân ngày càng tăng trên thế giới. Việc thêm vào hay loại bỏ những gen đặc hiệu qui định sản lượng, tính kháng bệnh hay các đặc tính về sản xuất có thể giúp ngành sản xuất thịt heo thêm hiệu quả.
Nói chung heo là lồi được chọn cho nghiên cứu nhiều bệnh ở người và thịt heo đóng vai trị quan trọng trong thực phẩm nên việc cải thiện hệ thống nhân dòng bằng chuyển nhân trên heo là cần thiết.
PHẦN 2. Nội dung
2.1. Những nghiên cứu bước đầu
Bài báo đầu tiên về cloning trên heo được xuất bản năm 1985 bởi Robl và First tại hội nghị toàn cầu lần thứ 3 về sản xuất heo giống được tổ chức ở Columbia, Missouri. Tác giả cơng bố nucleic có thể được chuyển giữa những tế bào phôi ở hai giai đoạn phát triển. Bài báo này chỉ ra rằng tiến trình chuyển nhân có thể được hồn thiện và biểu hiện nhân chuyển trong heo thể hiện như thế nào.
Sau đó những thí nghiệm chuyển nhân trên những nhân cho ở giai đoạn 4 tế bào trên heo đã thành công (Prather và ctv, 1989).
81 Dựa trên nền tảng này, nhiều nghiên cứu tiếp theo đã đánh giá trước những thay đổi trong cấu trúc và chức năng nhân sau khi chuyển nhân cũng như nỗ lực tạo heo con. Đáng chú ý là những thay đổi trong nucleic khi chúng được chuyển vào trong trứng, sau đó chúng phát triển in vitro và cuối cùng tạo ra heo con (tái lập trình và sự phát triển in vitro).
2.2. Những sự kiện phân tử của tái lập trình nhân trên heo
2.2.1. Định nghĩa chung
Tái lập trình là quá trình mà DNA và các protein kết hợp trong nhân cấy từ tế bào sinh dưỡng được điều chỉnh lại - tái lập trình lại để sẵn sàng hợp nhất với bào tương của trứng nhận. Sự hợp nhất đồng bộ này là yếu tố tiên quyết và cần cho sự phát triển của phôi (Solter D, 2000).
2.2.2. Tái lập trình nhân trên heo
2.2.2.1. Sự phồng lên của nhân chuyển
Phơi heo là một mơ hình quan trọng cho nhiều nghiên cứu mơ tả tái lập trình nhân xảy ra sau chuyển nhân. Giả thuyết rằng, nhân cho được tái lập trình lại sau khi chuyển vào tế bào chất của trứng nhận. Đầu tiên chúng phải tái lập lại mơ hình để tương tự như mơ hình của tiền nhân. Thơng thường, tiền nhân có nhiệm vụ kích hoạt sao mã. Tại một giai đoạn tế bào đặc biệt, phôi bắt đầu sản xuất một số lượng lớn dấu hiệu của mRNA. Ở heo, giai đoạn này xảy ra trong q trình phơi ở thời kỳ 4 tế bào (Jarrell và ctv, 1991; Schoenbeckb và ctv, 1992). Giai đoạn tế bào này tương thích với số lượng lớn thay đổi hình dạng của nhân. Do đó, sự kiện đầu tiên là tập trung vào sự thay đổi sau khi chuyển. Để tìm hiểu người ta xác định sự khác nhau về hình dạng giữa nhân được chuyển và một tiền nhân phải được chuẩn (Prather và Schatten, 1992).
Sự khác biệt rõ ràng nhất về hình thái học giữa tiền nhân và nhân từ các loại tế bào khác là kích thước của tiền nhân. Trong trứng thụ tinh, tiền nhân lớn và lớn hơn rất nhiều so với tế bào sinh dưỡng. Trong q trình phân chia, kích thước của nhân thu nhỏ như là kích thước của tế bào thu nhỏ. Ở heo, kích thước của nhân ở phôi 2 tế bào khoảng trên 18 µm và nó sẽ thu nhỏ cịn 14,3 và 13,0 µm lần lượt đối với nhân từ phơi 8 và 16 tế bào (Practher và cộng sự, 1990). Khi nhân từ phôi 8 và 16 tế bào được chuyển đến trứng giai đoạn metaphase II khơng nhân (sau đó hoạt động), nhân phồng lên đến 27,3 hoặc 27,2 µm. Thú vị hơn, mức độ căng phồng này khác nhau ở mỗi loại trứng, một số lượng lớn tế bào chất vẫn khơng kìm hãm sự phát triển của “tiền nhân”. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng sự phồng lên là một đặc tính quan trọng của quá trình tái tạo (Lui và cộng sự, 1995) bởi vì nó biểu thị cho q trình trao đổi protein xảy ra khi nhân được cho chuyển vào trong tế bào chất của trứng.
Nhân phồng lên là dấu hiệu của quá trình trao đổi protein xảy ra sau khi chuyển nhân. Một loại protein đặc biệt được biết đến để biến đổi thành phần trong quá trình phân chia sớm là lớp mỏng ngoài nhân và cũng chứng minh sự trao đổi protein. Trong động vật có vú, có 2 loại protein có chức năng phổ biến là loại A và A/C. Loại A và C
82 là loại chính, ngoại trừ 82 amino acid trong đoạn đuôi của lớp A. Lớp mỏng của nhân nằm trung gian giữa các protein dạng sợi tạo nên vỏ bao hình trịn chất nhiễm sắc bên trong nhân. Những protein này phân cắt thành nhiều đơn phân trong kì trung gian và phân cắt trong trứng. Trong quá trình thụ tinh, lớp mỏng tế bào chất chuyển thành dạng tiền nhân sớm nhất. Thành phần của lớp mỏng nhân thay đổi sau những chuyển đổi đặc biệt dẫn tới sự điều hịa phát triển của phơi. Trong khi lớp mỏng loại B vẫn cịn loại A/C khơng xuất hiện. Lớp mỏng loại A/C sẽ tái hiện lại sau đó trong q trình phát triển của mơ. Vì vậy, nếu một nhân được lấy ra và chuyển vào một trứng thì thành phần của lớp mỏng nhân có thể được thay thế như tiền nhân không? Khi nhân có nguồn từ việc chuyển một nhân đặc biệt sang một trứng chúng đòi hỏi một lớp mỏng tiền nhân, trong trường hợp này là A/C (Prather et al., 1989). Những nghiên cứu xa hơn như ở chuột, người ta chỉ ra rằng lớp mỏng A/C là không cần bởi loại tiền nhân sinh vật cho, nếu trứng tiếp nhận được thụ tinh và kích hoạt lại (Prather và ctv, 1991).
2.2.2.2. Sự tổng hợp mRNA
Hạch nhân là nơi tổng hợp rRNA. Bằng việc sử dụng kính hiển vi điện tử, một phần của nhân đã được xác định trong giai đoạn tiền nhân. Nhân có hình dạng phức tạp với bề mặt nhẵn và không mắt lưới. Trong khi đó tế bào trải qua quá trình tổng hợp rRNA và đối với heo là ở giai đoạn 4 tế bào. Nhân có khơng bào hoặc dạng lưới với bề mặt hình hạt và nhám. Vì thế câu hỏi đặt ra là: “nếu có một nhân được tái thiết lập sau khi chuyển vào trứng, thì hình thái của nhân và tiền nhân có giống nhau khơng?”. Thật ra, khi nhân ở dạng hạch nhân khi đó chúng là một nhân đã hoạt hóa được chuyển vào trong trứng đã loại bỏ nhân và được hoạt hóa lại hình thái nhân. Hình thái nhân được biến đổi, chẳng hạn như từ hạch nhân thành tiền nhân, rắn chắc, khơng hạt và khơng có lưới hoặc khơng bào. Điều này chỉ ra rằng sự tổng hợp rRNA đã bị ngừng lại. Những thay đổi này khơng hồn tồn nếu trứng đã được thụ tinh hoặc tái hoạt hóa.
Phương pháp khác để đánh giá mức độ tái lập trình là đánh giá cấu trúc ở vị trí khác trong nhân. Điều này gián tiếp cho thấy hoạt động tổng hợp RNA. Small nuclear ribonuclear proteins (snRNPs) chịu trách nhiệm q trình xử lí tiền mRNA trước khi RNA rời nhân vào tế bào chất. Lõi B/D của protein này có thể được xác định bởi kháng thể đơn dòng Y12. Kháng thể này khơng ở trong nhân giữa thời kì có sự phá vỡ thể mầm (germ vesicles breakdown) và giai đoạn phôi heo 4 tế bào (Pranther & Rickords, 1992). Sự xuất hiện của kháng nguyên Y12 nhạy với α–amanitin sensitive - chất ức chế sao mã ngăn cản tổng hợp mRNA mới. Câu hỏi đặt ra là: “nếu một nhân đã được tái thiết lập sẵn sàng sau khi chuyển nhân vào trứng có hay khơng sự phân bố và xuất hiện của kháng nguyên Y12 tương tự như ở tiền nhân?”. Khi nhân đã sẵn chứa kháng nguyên Y12 được chuyển vào trong một trứng loại nhân và trứng đã được hoạt hóa, sau đó chúng mất khả năng tái phản ứng với kháng nguyên Y12 (Pranther & Rickords, 1992). Điều này gián tiếp chỉ ra rằng khơng có tiến trình xử lí mRNA cũng
như khơng có q trình tổng hợp mRNA. Do đó tương tự như kích thước, thành phần của lớp mỏng nhân và hình thái nhân, nhân chuyển có thể phản ứng với kháng thể Y12 cũng như bình thường hoạt động này diễn ra ở tiền nhân.
83 Phương pháp cuối cùng để đánh giá sự tổng hợp mRNA là xem xét sự hợp nhất của [2H] uridin trong tế bào trước khi chuyển nhân và sau đó đánh sự thay đổi trong sự hợp nhất sau khi chuyển nhân. Có rất ít sự tổng hợp tổng hợp RNA ở tiền nhân – giai đoạn phôi và tổng hợp RNA thiết yếu và đuợc tăng cường, hợp nhất trong giai đoạn 8 tế bào. Vậy câu hỏi đặt ra là: “nếu một nhân sẵn sàng tái thiết lập sau khi chuyển vào trứng, thì phải chăng có hay khơng sự hợp nhất của uridin vào tiền nhân?”. Hyttel và ctv (1993) tiến hành nhiều thử nghiệm trên trứng và phôi trưởng thành in vitro và tìm thấy rằng mặc dù có một sự giảm [2H] uridin hợp nhất sau khi chuyển nhân, nhưng sự hợp nhất vẫn xảy ra. Nghiên cứu này cho rằng việc tái thiết lập mơ hình cũng như tái lập trình nhân có lẽ khơng diễn ra hồn tồn.
Các thử nghiệm trên được tiếp tục để tìm kiếm một gene chuyên biệt hơn hình thái và các họ RNA. Winger và ctv (2000) đánh giá thông tin của một số lượng lớn những enzyme điều hịa chủ yếu trên phơi bị. Họ nhận ra rằng lactate dehyrogenase, citrate synthase và phosphofructokinase hiện diện trong quá trình tái lập trình nhân và được điều hòa một cách chính xác. Theo Park và ctv (2001) nhận thấy rằng chỉ một nửa nhân được tái lập trình khi đo sự biểu hiện của enhanced green fluorescent protein (EGFP). Những nghiên cứu xa hơn được tiến hành với những chiến lược phân tách nguyên sợi bào (fibroblasts) để EGFP biểu hiện trong phơi chuyển nhân có thể tạo thành dạng thể khảm. Park và ctv, 2002 cho rằng việc tái lập trình trong phơi bào khơng đồng nhất, bởi vì ít có nghiên cứu nào trên heo về vấn đề này trong tái lập trình nhân nên chúng ta sẽ sử dụng các thí nghiệm trên các loại gia súc khác như bò. Theo nghiên cứu của Desousa và ctv (1999) có 95% RNA phiên mã trong nhân được di chuyển ở giai đoạn phôi bào giống với phôi đối chứng được tạo ra in vitro. Tuy nhiên, điều đó cũng có nghĩa là 5% bản sao khác với đối chứng. Daniels và ctv (2000) đã xác định được một phần trong 5% sự khác biệt đó. Họ cho rằng interleukin 6 (IL6), yếu tố phát triển nguyên sợi bào 4 (FGF4) và FGFr2 không biểu hiện đúng mức trong nhân chuyển, trong một vài trường hợp nó khơng hồn thành.
84
2.2.2.3. Một số gene tham gia quá trình tái lập trình
Ghép dị chủng đang ngày càng phát triển mở rộng. Tuy nhiên hiệu quả chuyển nhân từ tế bào somatic rất thấp phần lớn bị chết, một số thì tạo thành những dạng khác thường. Người ta giải thích hiện tượng trên là do q trình tái lập trình nhân của phơi chuyển nhân từ tế bào somatic không diễn ra đầy đủ. Để kiểm tra điều này Lee và ctv (2006) đã thử nghiệm so sánh khả năng tái lập trình của phơi heo chuyển nhân từ tế bào nguyên sợi bào và từ tế bào mầm với các gene Oct-4 và các gene cùng họ (Ndp5211, Dppa2, Dppa3, and Dppa5) đây là những gene quan trọng trong quá trình tái lập trình, gene Hand1 and GATA-4 quan trọng cho quá trình phát triển nhau được sử dụng như một marker RT-PCR. Gene Oct-4 là một nhóm thuộc yếu tố điều hòa phiên mã. Được xác định đầu tiên trên tế bào gốc phôi chuột và tế bào mầm. Mức độ biểu hiện của Oct-4 (được đo bằng RealTime-PCR) là rất cần thiết (P < 0,05) trong những cloned blastocyst nhận từ nguyến sợi bào và rất nhiều cloned đã thất bại trong việc kích hoạt lại ít nhất một trong các gene nghiên cứu, trong khi đó hầu hết các cloned từ tế bào mầm kiểm sốt chính xác sự biểu hiện của các gene này. Kết luận, cho thấy rằng tái lập trình khi nhân cho từ nguyên sợi bào rất khác thường và sự tái lập trình này rất quan trọng có thể đó là một lí do dẫn đến sự chết sớm và tạo ra những dị thường khi nhân cho từ một tế bào đã biệt hóa.
85
Hình 2.21. Con đường tương tác của các yếu tố liên quan trong quá trình tái lập trình nhân (Lee và ctv, 2006)
Một nghiên cứu khác cho thấy có 3 gene điều hòa Oct4, Sox2 và Nanog phiên mã quan trọng. Bổ trợ cho hoạt động của các gene trên những protein thuộc nhóm Polycomb là những yếu tố kìm hãm phiên mã, chức năng của nó là duy trì sự đồng nhất của tế bào trong suốt thời kỳ phát triển khi đang diễn ra tái lập trình ngồi nhân của cấu trúc nhiễm sắc thể. Chẳng hạn như chúng có khả năng kìm hãm gene phát triển ES trong tế bào. Ba gene Oct4, Sox2 và Nanog là những gene chìa khóa cho việc
86 kiểm sốt cấu trúc nhiễm sắc thể cũng như duy trì sự phát triển mang tính vạn năng của tế bào. Trong đó, Otc4 và Nanog là những yếu tố then chốt nhất. Oct4 là protein liên kết với DNA có vai trị kích hoạt hoặc ngăn cản sự phiên mã của gene, đặc biệt trong giai đoạn phát triển đầu của phơi và biệt hóa tế bào.
Mặc dù đã có nhiều heo con được sản xuất bằng chuyển nhân từ các tế bào sinh dưỡng khác nhưng đa số chúng đều chết ở giai đoạn thai kỳ đặc biệt ở giai đoạn phát triển nhau khi có sự biệt hóa, định vị nhau chính lúc này xuất hiện một vài sự phát triển khác thường. Một nguyên nhân cho sự phát triển khác thường này là sự tái lập trình ngồi nhân của geneome nhân cho từ tế bào sinh dưỡng. Nhân cho phải tương thích với sự phát triển của phơi. Tuy nhiên sự tái lập trình ngồi nhân dẫn đến một số trong các gene Oct-4 và các gene cùng họ được biểu hiện còn một số cịn lại thì khơng được biểu hiện. Sự phát triển qua các giai đoạn cùng sự biểu hiện khác thường cho thấy những giới hạn về khả năng, tiềm năng phát triển đến cơ thể hồn chỉnh. Thêm vào đó một vài sự kiện bị bỏ qua hạn chế hình thành mặt hình thái của những phơi blastocyst thông thường do sự biểu hiện sai của một số gene.
2.3. Hoạt hóa trứng
2.3.1. Chu kỳ tế bào