PHẦN 1 Mở đầu
2.2. Kỹ thuật dịng hóa
Dịng hóa bằng phương pháp chuyển nhân được thực hiện qua 5 bước: Chuẩn bị tế bào chất nhận; Chuẩn bị tế bào cho nhân; Tái kết cấu; Nuôi cấy in vitro nỗn tái kết cấu; Cấy phơi vào tử cung của "mẹ nuôi" để cho phát triển thành bào thai.
2.2.1. Bước 1: Chuẩn bị tế bào chất nhận
Noãn trưởng thành ở giai đoạn trung kỳ II (Metaphase II) được cho là một môi trường tế bào chất thuận lợi cho việc tái lập chương trình nhân ở bị nếu so với tế bào chất của hợp tử. Tuy nhiên, khó có thể có được lượng lớn nỗn trưởng thành ở bị in
vivo. Nhờ tiến bộ đạt được trong việc gây trưởng thành noãn trong ống nghiệm (in
vitro maturation, IVM) khi noãn ở giai đoạn nhân nguyên (germinal vehical stage) nên
để dịng hóa phơi bị người ta thường dùng noãn trưởng thành in vitro để chuẩn bị lượng lớn tế bào chất nhận (Leibfried-Rutledge và ctv, 1987).
Hiện nay thường sử dụng phương pháp tạo noãn trưởng thành trong ống nghiệm và đã tạo được noãn trung kỳ II từ buồng trứng. Từ nang nỗn có xoang với đường kính 2 – 8 mm, phức hợp trứng – tế bào ổ (cumulus – oocyte, COC) ở giai đoạn nhân nguyên được hút ra. Chọn COC nguyên vẹn với vài lớp tế bào ổ dày và nuôi cấy in vitro trong 22 – 24 giờ ở môi trường nuôi trưởng thành TCM 199 có bổ sung huyết
thanh phôi, FSH, LH và estridiol - 17β. Thông thường hơn 80% nỗn ni cấy có thể trưởng thành in vitro và đạt trung kỳ II (xuất hiện thể cực thứ nhất).
Hình 2.7. Nỗn trưởng thành ở giai đoạn trung kỳ II
(Nguồn: Leibfried-Rutledge và ctv, 1987)
Hình 2.8. Phức hợp trứng – Tế bào cumulus
53 Để chuẩn bị tế bào chất nhận, vật liệu di truyền từ noãn trưởng thành (nhiễm sắc thể và thể cực) phải được loại bỏ. Điều này có thể thực hiện:
Xử lý sơ bộ noãn với một loại thuốc để phong tỏa polymerase hóa của vi sợi (microfilament) và sau đó dùng cytochalasin thì màng nỗn đủ mềm, để hạn chế việc làm vỡ màng tế bào khi sử dụng micropipet để lấy nhân.
Noãn của lồi nhai lại có màu tối do tế bào chất chứa nhiều lipid nên khó xác định giai đoạn trung kỳ. Do đó để quan sát bằng cách đánh dấu nhiễm sắc thể với thuốc nhuộm DNA đặc biệt (Hoechst 33342) và xem dưới kính hiển vi có tia cực tím. Tuy nhiên nồng độ cao của thuốc nhuộm và kéo dài thời gian tiếp xúc với tia cực tím khi quan sát có thể ức chế sự phát triển sau đó của nỗn. Ngồi ra có thể dùng sắc huỳnh quang khác để đánh dấu trục ống hoặc DNA.
Sau khi xử lý sơ bộ với cytochalasin, nỗn khơng cịn dính với tế bào cumulus, được đặt vào kính hiển vi đảo pha có bộ vi thao tác và được giữ bởi pipet. Với một pipet nhọn đầu, tạo lỗ ở màng trong suốt và hút đi thể cực thứ nhất cùng với một ít tế bào chất gần đó có chứa đĩa trung kỳ. Nỗn bị bỏ nhân có thể được dùng để làm tế bào chất nhận trong chuyển nhân hoặc được hoạt hóa rồi mới chuyển nhân.
2.2.2. Bước 2: Xử lý tế bào cho
Trong dịng hóa phơi, tế bào cho thường được tách từ phôi dâu đặc. Phôi dâu này được xử lý in vivo hoặc in vitro. Ở giai đoạn này, phơi chứa 30 – 36 tế bào tồn năng chưa biệt hóa. Ngay trước khi chuyển nhân, màng trong suốt được bỏ đi bằng cách xử lý với pronase và phơi dâu được ủ với mơi trường khơng có calci trong 15 phút để dễ tách tế bào. Nếu khơng tách đủ tế bào phơi, có thể tách bằng phương pháp cơ học với pipet nhỏ.
Hình 2.9. Noãn loại bỏ nhân
(Nguồn: Barnes, F.L., J.M. Robl and N.L. First. 1987)
54 Trong dịng hóa tế bào sinh dưỡng từ thú trưởng thành, tế bào cho nhân thường được cấy in vitro qua vài lần trong vài tuần và kích cỡ tế bào khá nhỏ so với tế bào đã lấy từ phôi. Trước khi chuyển nhân, lớp tế bào liền nhau phải được xử lý bằng trypsin để tách tế bào. Bước này rất quan trọng và phải làm cẩn thận để duy trì màng tế bào vì cần cho sự hợp nhất giữa nhân với tế bào chất.
2.2.3. Bước 3: Tái kết cấu
Tế bào cho (tế bào của phôi hoặc tế bào sinh dưỡng) được hút từng cái vào micropipet và được chuyển vào dưới màng trong suốt của mỗi noãn đã bỏ nhân. Khi việc chuyển tế bào đã hồn tất, bộ nỗn – tế bào được hợp nhất giúp nhân của tế bào cho đi vào tế bào chất của noãn nhận – Dung hợp. Điều này thường được hoàn thành với kỹ thuật hợp nhất bằng điện - electrofution (Zimmerman và Vienken, 1982). Do đó, bộ nỗn – tế bào được chuyển vào dung dịch hợp nhất tế bào. Thông thường, dung dịch hợp nhất là một dung dịch không dẫn truyền nồng độ 0,3 M mannitol. Bộ phận hợp nhất gồm hai điện cực bằng sợi thép không gỉ cách nhau 0,2 – 1,0 mm trên một miếng thủy tinh và nối với phần kích thích bằng điện. Xếp các tế bào (noãn và tế bào cho) thẳng hàng sao cho các màng tế bào (cần hợp nhất) phải song song với điện cực để dung hợp tối đa. Dùng một pipet hoặc dùng từ trường xoay để xếp thẳng tế bào. Sự dung hợp bằng điện có thể thực hiện bằng xung điện một chiều, 1 kV/cm trong 50 micro giây và lập lại 2 lần thì cho kết quả cao khi dùng tế bào từ phôi.
Một cách khác để dung hợp tế bào là vi tiêm trực tiếp nhân tế bào cho vào tế bào chất của noãn nhận. Tế bào cho được hút vào một pipet có lỗ hẹp để vỡ màng tế bào. Với cùng một pipet, hút hết tế bào chất của noãn vào pipet và rồi nhân được đưa vào tế bào chất
2.2.4. Bước 4: Ni cấy in vitro nỗn tái kết cấu
Những môi trường chuyên biệt dùng cho ni cấy nỗn tái kết cấu đến thời kỳ phôi nang bao gồm mơi trường hóa học hoặc môi trường đồng nuôi cấy với tế bào vero. Phôi nang sau nuôi cấy đã được đánh giá bằng cách đếm số nhân của phơi và hình thái phơi.
Hình 2.11. Dung hợp tế bào bằng vi tiêm
(Nguồn: Collas, P. and F.L.
Barnes. 1994)
Hình 2.10. Phơi dâu
55
2.2.5. Bước 5: Cấy phôi vào tử cung của "mẹ nuôi" để cho phát triển thành bào thai
Khi phôi đạt đến giai đoạn phôi nang (64 – 128 tế bào), chúng ta tiến hành chuyển phôi nang vào tử cung mẹ nuôi. Điều kiện của mẹ ni là tử cung của nó phải đáp ứng đầy đủ các yếu tố cần thiết cho phơi phát triển. Nói cách khác là tử cung mẹ ni phải “đồng pha” với sự phát triển của phôi. Cần chú ý phôi phải được chuyển trước khi có hiện tượng “phơi thốt màng”, từ đó tạo điều kiện tốt nhất cho sự làm tổ của phơi trong tử cung mẹ ni.
2.3. Dịng hóa từ tế bào thai