Khi đưa nhân của tế bào sinh dưỡng vào trong trứng, thao tác thực hiện cần phải nhanh để nhân ấy hoàn toàn đáp ứng lại tế bào chất của trứng. Nếu nhân không đủ thời gian hồn tất q trình lập trình nhân, các sản phẩm cần thiết cho q trình sẽ khơng có mặt đúng nơi, đúng lúc cho tiến trình phát triển phơi (Solter D, 2000). Khi đó, q trình tái lập trình nhân khơng hồn tất hay khơng đúng sẽ tạo ra các sản phẩm khơng thích hợp và khơng kết hợp được với nhau.
Đáng chú ý là những lỗi của quá trình tái lập trình liên quan đến bất kỳ gene nào. Sự biểu hiện những sai sót của gene trong phơi sau khi chuyển nhân tuy đã dược phát hiện nhưng đến nay vẫn chưa có cách nào hạn chế hay loại trừ chúng (Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2010).
2.4.1. Sự bất hoạt NST X
NST X bất hoạt (Xi) khác biệt so với các NST X bình thường khác và những thể nhiễm sắc của chúng ở sự tạp sắc của nó và sự sao chép trong giai đoạn “silent”. Những đặc điểm của giai đoạn tạp sắc bởi NST Xi bao gồm tăng số lượng đại phân tử histone H2a, acetyl quá mức H4 và tăng methyl hóa DNA ở những trình tự promoter.
Tuy nhiên cũng chưa rõ rằng sự bất hoạt X có thể là ngẫu nhiên như ở những động vật bình thường hay là khơng ngẫu nhiên như ở lá nuôi phôi (TE-trophectoderm). Vấn đề nằm ở giai đoạn tạp sắc của Xi trong nhân cho sẽ xác định trạng thái của NST này trong tất cả các tế bào của clone, kết quả của sự bất hoạt không ngẫu nhiên. Dấu hiệu epigenetic hiện diện trên những NST X trong suốt sự phát triển của phơi động vật cho có thể đã bị loại bỏ sau khi chuyển nhân và việc được tái lập một cách ngẫu nhiên trên cả 2 NST tại thời điểm bất hoạt.
Sử dụng những NST X được đánh dấu di truyền đã được miêu tả ở trên cho thấy sự bất hoạt NST X diễn ra một cách ngẫu nhiên trên epiblast của chuột clone. Các số liệu cho thấy những dấu hiệu epigenetic mô tả Xa và Xi trong tế bào soma đã bị loại bỏ và tái lập trên NST X trong quá trình clone, kết quả là tạo NST X bất hoạt ngẫu
75 nhiên trên động vật clone. Cụ thể, những đánh dấu epigenetic trên Xi và Xa trên tế bào cho không bị loại bỏ trên dịng TE của clone và từ đó dẫn đến Xa của tế bào cho được kích hoạt và Xi cho bị bất hoạt. Do đó, sự bất hoạt X trên TE hiện diện trên những động vật clone nhiều hơn so với trên cơ thể phát triển bình thường.
Thực tế trong tế bào soma, NST X cũng được kích hoạt trên những tế bào ES cái, điều này cho thấy sự thiếu hụt một dấu hiệu giống epigenetic trên NST. Khi tế bào ES được sử dụng để cho nhân, sự bất hoạt ngẫu nhiên NST X được quan sát trên cả epiblast lẫn TE của những phơi clone. Đó là một cơ chế bảo đảm sự bất hoạt ngẫu nhiên NST X trên dòng TE khi vắng mặt một epigenetic trên NST cho.
Những nghiên cứu trên chỉ ra rằng những thông tin epigenetic trái ngược hiện diện trên NST X của tế bào soma cho không bị loại bỏ ngay lập tức sau sự chuyển nhân mà bị gián đoạn trên dịng TE kết quả trong sự bất hoạt khơng ngẫu nhiên. Sau khi TE cố định, những dấu hiệu epigenetic phân biệt 2 NST X cho bị loại bỏ và tái lập ngẫu nhiên trên dòng epiblast, dẫn đến sự bất hoạt ngẫu nhiên trên tế bào soma của những cá thể cái clone. Tóm lại, q trình bất hoạt X được thực thi một cách chính xác trên những phơi cái clone và một số lượng lớn tương đồng đó trên những cá thể cái tương đồng.
2.4.2. Dị ty thể (Mitochondrial heteroplasmy)
Dị ty thể là hiện tượng trộn lẫn các ty thể trong cùng một tế bào do thao tác chuyển noãn tương. Hiện tượng này có thể xảy ra trong tự nhiên (Wilson MR và ctv, 1997). Tuy nhiên, một lượng nhỏ ty thể này có thể bị “kìm hãm” bởi ty thể của nỗn và cũng có thể trong trường hợp nào đó nó bị nỗn lọai bỏ.
Theo kết quả nghiên cứu của Sutovsky, một hiện tượng có thể xảy ra trong kỹ thuật SCNT là: DNA nhân cho đối xử với DNA ty thể trứng như vật ngoại lai. Điều này gây hậu quả nghiêm trọng vì ty thể hầu như được di truyền từ mẹ (Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2010).
Sự chọn lọc tự nhiên trong cơ thể mẹ đã loại bỏ sự đối kháng giữa nhân và bộ gen của ty thể. Trong sinh sản hữu tính, DNA nhân của cha có thể là một vật lạ đối với bộ gen ty thể mẹ. Tuy nhiên, những sản phẩm DNA mẹ có thể hịa giải cho tất cả sự đối kháng giữa các sản phẩm mã hóa bởi DNA nhân cha và ty thể mẹ. Trái lại trong SCNT thì sự hịa giải này khơng tồn tại.
2.4.3. Sự ngắn dần của telomere
Telomere là phức hợp DNA-protein tại các đầu mút của các NST ở tế bào nhân thật, cần thiết cho sự toàn vẹn của NST và sự phát triển của tế bào bình thường (McEeachern và ctv, 2000; Blasco, 2002). Trong tế bào sinh dục, phần này được xây dựng lại bởi enzyme telomerase. Do đó, khả năng các động vật tạo dịng từ các tế bào sinh dưỡng sẽ có telomere ngắn lại.
Đặc điểm chung của hầu hết những tế bào soma qua nuôi cấy in vivo hay in vitro là đoạn telomere ngắn. Điều này làm cho tế bào mất đi một số khả năng bẩm sinh.
76 Enzyme telomerase điều hòa chiều dài của đoạn telomere. Sự ngắn lại của telomere trong tạo dịng khơng phải là vấn đề chính, bởi vì kích thước telomere hao hụt khơng đáng kể.
Trong thực nghiệm có thể làm giảm ảnh hưởng này bằng cách chọn kiểu tế bào cho nhân. Khơng có dấu hiệu ngắn dần hay lão hóa được quan sát ở chuột tạo dịng. Kết quả này cho thấy telomere tế bào trưởng thành có thể được xây dựng lại trong suốt quá trình phát triển phôi sớm của động vật tạo dòng, nhưng độ kéo dài khác nhau (Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2010).
2.4.4. Sự đột biến
Nguồn nhân để sử dụng cho tạo dòng cần được lựa chọn kỹ lưỡng. Nếu nguồn nhân lấy từ tế bào da tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng, DNA của chúng sẽ có nhiều đột biến điểm. Các tế bào phát triển trong đĩa nuôi cấy cũng có thể là nguồn cho nhân không tốt. Điều này do các tế bào phát triển trong môi trường ni cấy thường tích lũy các đột biến theo hướng tăng cường phát triển. Loại đột biến này thường kết hợp với sự phát triển của nguyên nhân gây ung thư (Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2010).
2.4.5. Thất bại trong quá trình in dấu bộ gene
Những lỗi in dấu sai trong suốt quá trình thao tác di truyền gây nên sự phát triển quá nhanh hay quá chậm của bào thai và nhau thai ở chuột đã được nghiên cứu. Hơn nữa, nhiều khiếm khuyết đã được nhận biết ở các động vật khác nhau khiến các nhà khoa học cho rằng, đây chính là nguyên nhân phổ biến.
Những bất thường ở động vật tạo dịng có thể một phần do q trình ni phơi trong phịng thí nghiệm kết hợp với kỹ thuật SCNT. Và đó là hậu quả của quá trình cấy nhân.
Một vài bất thường của các gen đã in dấu ở động vật tạo dòng:
+ Những dấu in methyl hóa hay những dấu in khác có thể khơng được duy trì ở tất cả các tế bào trong suốt quá trình trưởng thành của cá thể. Nếu dùng nhân từ các tế bào này để tạo dịng, những lỗi đó có thể khơng được sửa chữa trong phôi.
+ Kiểu in dấu từ cha, mẹ của tế bào cho nhân có thể được duy trì hay sao chép đúng trong quá trình phiên mã ở giai đoạn phôi trước khi làm tổ. Sai sót này có thể được khuếch trương bởi sự nuôi phôi in vitro trước khi làm tổ.
+ Ngay khi những in dấu di truyền được sao chép tốt, nhưng sự tái thiết lập chương trình khơng hồn hảo cũng gây nên hiện tượng những gen in dấu khơng được đọc chính xác trong q trình phát sinh mơ phơi.
2.4.6. Sai sót về mặt kỹ thuật
Khi đặt nhân của tế bào soma vào trong vỏ trứng, thao tác thực hiện cần phải nhanh để nhân ấy hoàn toàn đáp ứng lại tế bào chất của trứng. Nếu nhân không đủ thời gian hồn tất q trình lập trình nhân, các sản phẩm cẩn thiết cho q trình khơng có mặt đúng nơi, đúng lúc cho tiến trình phát triển phơi (Solter D, 2000). Khi đó, quá
77 trình tái thiết lập trình nhân khơng hồn tất hay khơng đúng sẽ tạo ra các sản phẩm khơng thích hợp và không kết hợp được với nhau.