2.3 .Các yếu tố kiểm soát quá trình tái lập trình nhân
2.3.2 .Các nhân tố bên trong
Ở những tế bào chưa được biệt hóa, có 3 gene điều hịa mã hóa cho yếu tố điều hịa phiên mã quan trọng mà không thể hiện bao gồm Oct4, Sox2 và Nanog.
Nhóm protein Polycomb (PcG) là những yếu tố kìm hãm phiên mã, duy trì sự đồng nhất tế bào trong suốt thời kỳ phát triển cuối thông qua những cải biên ngoài nhân (epigenetic modification) của cấu trúc NST. Protein PcG có chức năng kìm hãm phiên mã những gene phát triển trong tế bào ES, nó có thể xem như một promoter biệt hóa.
Nhiều gene đích Oct4, Soc2 và Nanog được xác định cũng là gene đích PcG, q trình cải biên NST có thể diễn ra liên quan đến sự điều hòa 3 gene này.
Cấu trúc NST liên quan với rất nhiều gene, lại liên quan đến domain bao gồm cả kìm hãm những điểm methyl hóa lysine số 27 của histone H3 và kích hoạt methyl hóa lysine số 4 của histone H3. Domain này biến mất trong những tế bào đã biệt hóa, quan trọng trong việc duy trì sự phát triển tính vạn năng của tế bào ES.
Do đó, yếu tố tồn năng Oct4, Sox2 và Nanog hoạt động phối hợp cùng PcG để làm im lặng những tác nhân điều hòa phát triển ở trạng thái đa năng. Trong khi những gene tương tự, mở những tác nhân điều hịa ngồi nhân hoạt động phiên mã chuẩn bị biệt hóa. Khi những yếu tố điều hịa phiên mã cho tính tồn năng và tự tái sinh trên tế bào ES được hiểu rõ ở mức độ phân tử thì khả năng tái lập trình nhân trên một loại tế bào thành tế bào khác bằng hoạt động của hệ thống những yếu tố điều hòa này.
Oct4, Sox2 và Nanog là những gen quan trọng cho q trình tồn năng. Trong đó Oct4 (còn được gọi là Pout5f1) và Nanog được xác định là những yếu tố then chốt.
a. Gen Oct4
Oct4 (octamer-binding transcription factor 4) còn được gọi là Pou5f1 (POU domain, class 5, transcription factor 1), là protein liên kết với DNA, là yếu tố kích hoạt hoặc ngăn cản sự phiên mã của vài gene, đặc biệt là những gene biểu hiện trong suốt giai đoạn đầu của phơi, do đó Oct4 có vai trị quan trọng trong giai đoạn đầu phát triển và biệt hóa tế bào (Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2010).
Oct4 điều hòa biểu hiện gene bằng cách tương tác với những yếu tố khác trong nhân, bao gồm yếu tố Sox2.
Ở phôi động vật hữu nhũ thì có 2 lớp tế bào trong giai đoạn phôi 64 tế bào, lớp ngồi là lá phơi (trophetoderm) phát triển thành nhau thai và các bộ phận khác nuôi thai, lớp trong phát triển thành phôi được gọi là ICM (inner cell mass). Những tế bào ICM có thể phân lập và ni cấy in vitro thành tế bào gốc phôi ES (embryo stem cell). ES là
72 những tế bào tồn năng có khả năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau tương ứng nhiều loại mô khác nhau của cơ thể. Và Oct4 chỉ biểu hiện trong những tế bào chưa được biệt hóa có nhiều tiềm năng phát triển như tế bào ES và tế bào EG (embryo germ). Oct4 duy trì tiềm năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau cho tế bào gốc phôi, tuy nhiên khi phôi làm tổ bào tử cung, Oct4 mất đi và các tế bào bắt đầu biệt hóa cho ra hơn 200 loại tế bào khác có trong cơ thể.
Sự biểu hiện của Oct4 gene được duy trì trong những tế bào gốc có thể tự tái sinh. Tuy nhiên, trong lớp nội bì và ngoại bì thì lượng Oct4 khá cao và ngược lại trong tế bào lá phôi. Bảng so sánh hàm lượng như sau (Hình 2.19).
Hình 2.18. Hàm lượng Oct3/4 trong các loại tế bào
(http://physrev.physiology.org/content/85/2/635/F5.expansion.html)
Nếu thiếu Oct4, phôi phát triển được tới giai đoạn blastocys nhưng bị lỗi sau khi cấy ghép. Phân tích sâu cho thấy blastocys chứa tế bào lá phôi nhưng thiếu tế bào ICM. Đa số các phơi được tạo dịng bị lỗi đều có sự biểu hiện của oct4 ở cả tế bào lá phôi và tế bào TCM hoặc là thiếu sự biểu hiện ở cả 2 lớp tế bào này.
Mức độ cân bằng giữa Oct4 và Cdx2 (caudal-type homeodomain) có tác động lẫn nhau. Oct4 liên quan đến hình thành ICM, nơi mà Cdx2 cần để phát triển lá nuôi phôi. Cịn lớp tế bào bên ngồi thì Oct4 biến mất đồng thời Cdx2 cũng có rất hạn chế.
b. Gene Sox2
Sox2 (SRY-type high mobility group box 2) là một protein thuộc họ gồm 20 protein có cấu trúc tương tự như motif liên kết DNA box HMG. Tuy nhiên, Sox2 có vai trò quan trọng trong tính vạn năng của tế bào. Yếu tố điều hòa Sox2 trong vùng promotor của gene cũng nằm gần vị trí liên kết của gene Oct3/4 và gene Nanog. Rất nhiều gene đặc hiệu cho tế bào ES được điều hòa phiên mã bằng liên kết với Sox2 và Oct3/4.
Gene Sox 2 là một gene khuyết intron nằm trên 1 gene gọi là Sox2OT (phiên mã trùng lắp Sox2 – Sox2 overlapping transcrip), có 317 amino acid, 34,4 kDa. Domain HMG chứa yếu tố phiên mã kiểm sốt tính tồn năng cũng như vạn năng của tế bào.
73 Domain HMG liên kết linh động với DNA mà khơng có trình tự đặc hiệu và có thể uốn cong DNA, hạn chế yếu tố điều hòa sau dịch mã gắn vào.
Phức hợp Sox2:Oct4 là quan trọng nhất trong hệ thống điều hòa gene. Sox2 và Oct4 thể hiện đồng thời rất sớm trong phôi, ngay từ giai đoạn phôi dâu. Chúng được tìm thấy trong ICM của blastocyst của phơi tiền cấy ghép, trong lá mặt (epiblast), mô được biệt hóa trong phơi và tế bào gốc sau cấy ghép blastocyst.
Sox2 và Oct4 cùng với c-Myc và Klf4 hoặc Nanog và Lin28 làm ngăn cản sự biệt hóa tế bào sinh dưỡng thành tế bào gốc tồn năng iPS (induced pluripotent stem cells).
c. Nanog
Tế bào thiếu Nanog sẽ biệt hóa tùy ý trong lớp nội bào nguyên thủy. Ngược lại, nếu biểu hiện quá sẽ kích thích sự tự tái sinh độc lập với yếu tố ngăn chặn Cytokine leukemia (cytokine leukemia inhibitory foctor LIF), Nanog được hoạt hóa bởi yếu tố phiên mã Stat3.
Mặc dù con dường LIF-Stat3 có thể bỏ qua trong tế bào hES, nhưng những phân tích chức năng cho thấy sự tương tự như vậy giữa Oct4 và Nanog trong những tế bào này. Do đó, Oct4, Sox2 và Nanog được xem là những biểu hiện sớm nhất của gene nhằm duy trì tính tồn năng. Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây cho thấy chúng có con đường riêng để điều hịa những mục tiêu chung khác trong genome. Sự cân bằng giữa những yếu tố điều hịa này có thể quyết định con đường biệt hóa hay phân chia của tế bào.
Sự cân bằng giữa Nanog và yếu tố phiên mã Gata4, Gata6 cũng cần thiết cho sự phát triển nội bì ngun thủy. Có Gata 4 hoặc Gata 6 thì có sự biệt hóa tế bào thành tế bào nội bì nguyên thủy, điều này đồng nghĩa với thiếu Nanog.
Hình 2.19. Các yếu tố phiên mã kiểm sốt sự phát triển phơi (http://physrev.physiology.org/content/85/2/635/F5.expansion.html)
d. Foxd3
Foxd3 thuộc họ gen đầu chẻ (forkhead family gene). Nó khơng biểu hiện trong nỗn chưa thụ tinh hay phơi giai đoạn một tế bào, nhưng sự phiên mã của Foxd3 được phát hiện trong blastocyst. Một số kết quả nghiên cứu cho thấy Foxd3 cần thiết cho sự phơi vị hóa.
74 Vai trò của Sox2 và Foxd3 không được kiểm tra trên hES. Sox2 biểu hiện trên các tế bào hES khơng biệt hóa. Trái lại, trong khi một số dòng tế bào hES người thì Foxd3 biểu hiện, một số khác thì khơng thể hiện. Do đó Foxd3 khơng cần thiết cho sự làm mới của tế bào (Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2010).
e. miRNA
MicroRNA (miRNA) là những nhân tố điều hòa liên quan đến sự duy trì tính đồng nhất của ES. Các phân tử RNA ngắn được biết liên quan đến sự điều hòa phiên mã. Hầu hết chúng ức chế dịch mã.
Nghiên cứu trên mES, các miRNA mới biểu hiện chun biệt trong các tế bào ES khơng biệt hóa, cũng như vài miRNA được xác định trước đó tồn tại nhiều trong các tế bào chưa biệt hóa so với các tế bào đã biệt hóa. Vì là một trong những yếu tố điều hòa sự phát triển nên miRNA được xem là những phân tử có vai trị trong việc duy trì tính vạn năng của tế bào ES (Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2010).