PHẦN 1 Mở đầu
2.5. Hiệu quả của dịng hóa bị
2.5.2.2. Phát triển trước khi sanh
Tỷ lệ phôi nang phát triển đến khi sanh chỉ được 10% sau khi cấy cho bò cái. Tỷ lệ này thấp hơn 4 lần so với chuyển cấy phôi IVF (Heyman và ctv, 1999). Tuy nhiên, sau khi chuyển phôi tái cấu trúc từ tế bào sinh dưỡng, tỷ lệ đậu thai được (50%) nhưng có nhiều phơi bị hư ở các giai đoạn khác nhau, dẫn đến tỷ lệ sẩy thai cao. Sẩy thai ở giai đoạn sau thường do thủng màng niệu nhau thai hoặc nhau thai phát triển bất thường. Nguyên nhân của những hiện tượng này chưa được hiểu rõ, có thể liên quan đến tái lập trình nhân, mơi trường ni hay thao tác chuyển nhân. Tuy nhiên, nguyên nhân tái lập trình nhân khơng hồn chỉnh sau khi chuyển nhiều hơn, vì nếu thiếu vài gene trong tái lập trình mà những gene đó tham gia vào q trình điều hịa nhau thì nhau có thể phát
59 triển bất thường. Các gene phát triển phôi cũng tham gia vào phân tiết các yếu tố tăng trưởng. Một số nghiên cứu cho thấy nồng độ IGF-1 trong máu bê dịng hóa thấp hơn so với bê đối chứng cùng tuổi. Ngoài ra, một số yếu tố khác cũng có thể ảnh hưởng khả năng tái lập trình chính xác của nhân tế bào sinh dưỡng sau khi chuyển nhân.
Bảng 2.3. Tỷ lệ phát triển phôi đến sau sanh với tế bào tế bào nguyên sơ của bò ở mơi trường đói hoặc khơng đói.
Mơi trường ni cấy Nguồn gốc tế bào Số phôi nang chuyển cấy Số thai vào ngày 30 (%) Số thú con (% so với phôi nang) Tế bào nguyên sơ trong mơi
trường đói Thai 16 2 17 3 (18,7) 0 2 (28,6) 2 (12,5) 2 (28,6) Thú trưởng thành 18 12 15 148 1 (5,5) 2 (16,7) 0 34 (22,3) 1 (5,5) 0 7 (4,7) Tế bào nguyên sơ trong mơi trường khơng đói Thai 43 30 16 5 (11,6) 2 (16,7) 9 2 (4.6) 0 0 Thú trưởng thành 11 14 15 24 1 (9,0) 4 (28,6) 3 (20,0) 9 (37,5) 0 1 (7,1) 0 1 (4,2) 2.5.2.3. Sức sống của bị dịng hóa
Số bê được tạo ra từ dịng hóa tế bào sinh dưỡng cịn ít, khoảng 200 con vào năm 2000; chủ yếu ở Bắc Mỹ, Nhật, châu Âu, Úc và New Zealand. Do đó, chưa có nhiều thơng tin về sức sống của bị dịng hóa. Theo khảo sát, một số bị đực dịng hóa vẫn có khả năng cho tinh. Một vài bệnh lý như hội chứng to vóc của đời con, rối loạn của bộ máy hô hấp hay xáo trộn miễn dịch vì nhược triển tuyến ức đã được nhận thấy ở bị dịng hóa. Nghiên cứu sâu về những bất thường ở bị dịng hóa tương đối khó vì khoảng cách thế hệ của bò dài.
PHẦN 3. Kết luận
Hiệu quả thực tế của dịng hóa phơi bị giới hạn do có ít nhân trong phơi dâu. Ở bị, dịng hóa tế bào sinh dưỡng đã được chứng minh là khả thi đối với vài loại tế bào lấy từ bò đực hay bị cái đang sống.
Những tính tốn cho thấy dịng hóa tế bào sinh dưỡng thay vì dịng hóa phơi từ bị ưu việt có thể cải thiện 20% tiến bộ di truyền hàng năm của chăn ni bị sữa.
60 Đối với những dịng bị nguy cơ, dịng hóa tế bào sinh dưỡng là phương cách hữu hiệu để nhân bản kiểu hình hiện có.
Dịng hóa có thể được dùng để nghiên cứu về bệnh lý, sinh sản và dinh dưỡng. Tuy nhiên, thật sự hiệu quả của phương pháp dịng hóa bị vẫn chưa cao và ổn định. Do đó, nhiều nghiên cứu vẫn đang và sẽ được thực hiện để tăng tính hiệu quả của phương pháp dịng hóa từ tế bào sinh dưỡng.
61
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Trần Thị Dân, 2005. Công nghệ sinh học trong chăn nuôi gia súc. Nxb Nông
Nghiệp, Tp. HCM
2. Bùi Trang Việt, 2005. Sinh học tế bào. NXB Đại học quốc gia Tp. HCM
Tiếng Anh
3. Barnes, F.L., J.M. Robl and N.L. First. 1987. Nuclear transplantation in mouse embryos: Assessment of nuclear function. Biol. Reprod. 36:1267-1274.
4. Cibelli, J.B., S.L. Stice, P.J. Golueke, J.J. Kane, J. Jerry, C. Blackwell, F.A. Ponce de Leon and J.M. Robl. 1998. Cloned transgeneic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts. Science 280:1256-1258.
5. Collas, P. and F.L. Barnes. 1994. Nuclear transplantation by microinjection of inner cell mass cells and granulosa cell nuclei. Molec. Reprod. Dev. 38:264-267.
6. Heyman Y .,Comizzoli P., Marquant-Le Guienne B., Renard J.P., 2000. Onset of the first S-phase is determined by a paternal effect during the G1-phase in bovine zygotes, Biol. Reprod. 62: 1677–1684.
7. Keefer, C.L., S.L. Stice and D.L. Matthews. 1994. Bovine inner cell mass cells as donor nuclei in the production of nuclear transfer embryos and calves. Biol. Reprod. 50:935-939.
8. McGrath, J. and D. Solter. 1983b. Nuclear transplantation in the mouse embryo by microsurgery and cell fusion. Science 220:1300-1302.
9. McGrath, J. and D. Solter. 1984. Inability of mouse blastomere nuclei transferred to enucleated zygotes to support development to term. Science 226:1317-1319.
10. Robl, J.M., R. Prather, F. Barnes, W. Eyestone, D. Northey, B. Gilligan and N.L. First. 1987. Nuclear transplantation in bovine embryos. J. Anim. Sci. 64:642-647. 11. Sims, M. and N.L. First. 1993. Production of calves by transfer of nuclei from cultured
inner cell mass cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 90:6143-6147.
12. Westhusin, M., M.J. Levanduski, R. Scarbprough, C.R. Looney and K.R. Bondioli. 1992. Viable embryos and normal calves after nuclear transfer into Hoechst stained enucleated demi-oocytes of cows. J. Reprod. Fertil. 95:475-480.
13. Willadsen, S.M., R.E. Janzen, R.J. McAlister, B.F. Shea, G. Hamilton and D. McDermand. 1991. The viability of late morulae and blastocysts produced by nuclear transplantation in cattle. Theriogeneology 35:161-170.
62
Phần C: TÁI LẬP TRÌNH NHÂN
2.1. Khái niệm tái lập trình nhân
Tái lập trình nhân là thuật ngữ mô tả kỹ thuật cho phép thay đổi tiềm năng phát triển hay định hướng của tế bào. Tái lập trình nhân là lấy nhân từ một tế bào đã xác định của cơ thể và chuyển nó vào một tế bào gốc đã được loại bỏ nhân, khi đó, tế bào chuyển nhân thu được có khả năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau (Gurdon và Melton, 2008).
Trong tạo dòng ở động vật hữu nhũ, noãn của động vật hữu nhũ tái lập lại biểu hiện gene của một tế bào sinh dưỡng thích hợp và cần thiết cho sự phát triển của một hợp tử. Những nghiên cứu trong những giai đoạn sớm nhất sẽ có ảnh hưởng tới sự phát triển hồn chỉnh của động vật tạo dịng.
Có 2 hướng tái lập trình nhân là chuyển nhân vào tế bào sinh dưỡng (somatic cell nuclear transfer - SCNT) và tạo từ tế bào iPS (induced pluripotent stem cells).
2.2. Tái lập trình nhân của tế bào sinh dưỡng
Sự biệt hóa của các tế bào bao gồm những sự thay đổi lượng lớn của các yếu tố ngoại di truyền, hạn chế cấu trúc đặc biệt tiếp cận trong bộ gen. Kết hợp với những thay đổi trong mơ hình của nhân tố phiên mã với sự điều chỉnh lại nhiều yếu tố được biểu hiện rất hạn chế trong giai đoạn đa năng. Kết quả là làm thay đổi biểu hiện gene tổng thể. Đến nay, khơng có bằng chứng nào chứng minh tái lập trình nhân tế bào sinh dưỡng có thể thực hiện thành công dựa vào một vài yếu tố quan trọng mà là sự kết hợp của nhiều yếu tố.
2.2.1. Tái lập trình nhân bằng chuyển nhân
a. Chuyển nhân (transfer nuclear)
Chuyển nhân là quá trình đưa nhân của tế bào cho đã trưởng thành vào tế bào nhận (trứng chưa thụ tinh đã được loại bỏ nhân). Sau đó, trứng được kích thích phát triển thành phơi, mỗi phơi tạo dịng khi tới một giai đoạn thích hợp được chuyển vào tử cung của động vật mang thai hộ và tiếp tục sinh trưởng, phát triển cho đến lúc được sinh ra.
Thơng thường, một nỗn trưởng thành hay một trứng chưa thụ tinh được sử dụng làm tế bào nhận. Tế bào nhận ở giai đoạn trung kỳ II (metaphase II) lúc này nhiễm sắc thể đang được nén chặt và tập trung ở mặt xích đạo của thoi vơ sắc sẽ được loại bỏ nhân.
Tế bào cho nhân của động vật cần nhân bản, gồm hai loại:
+ Tế bào vạn năng (pluripotent cell), là tế bào ở giai đoạn phôi nang hoặc phôi dâu.
63 + Tế bào sinh dưỡng (somatic cell). Tế bào sinh dưỡng là bất cứ tế bào nào hình thành nên cơ quan, bao gồm tế bào biệt hóa và tế bào gốc (organ stem cell).
b. Quy trình chuyển nhân cơ bản
Chuẩn bị tế bào chất nhận
Các trứng chưa thụ tinh được sử dụng như tế bào nhận nhân mới, sau khi loại bỏ nhân của chúng.
Trong một số nghiên cứu, nhân của trứng chỉ được loại bỏ sau khi đã chuyển nhân ngoại lai vào (Munsine và ctv, 2000).
Sử dụng trứng ở giai đoạn MII có thể cải thiện sự tái lập trình nhân do có sự hiện diện của MPF (maturation promoting factor). MPF gồm có 2 phần: phần lớn là cycline B và phần nhỏ là cdk (cyclin dependent kinase). Cycline B thường được dự trữ ở trong mRNA ở tế bào chất của nỗn, chúng được tích tụ trong giai đoạn S và bị phân hủy khi tế bào bắt đầu phân chia. Cdk hoạt hóa q trình phân chia bằng cách phosphoryl hóa nhiều loại protein giúp nhiễm sắc thể đóng xoắn, màng nhân tiêu biến và thoi phân bào được thành lập. Theo Miyoshi và ctv (2001), MPF có tính hoạt hóa sẽ cảm ứng phá vỡ màng nhân, cơ đặc NST, tạo điều kiện tiếp xúc cho toàn bộ NST với các nhân tố cần thiết cho sự phát triển có sẵn trong trứng.
Chuẩn bị tế bào cho nhân
Tế bào cho nhân có thể được nuôi in vitro. Các tế bào cho có thể lấy từ nhiều
nguồn khác nhau với các mức biệt hóa khác nhau: tế bào tuyến vú trong nhân bản cừu Dolly, tế bào mô cơ (Vignon và ctv, 1995), tế bào đuôi (Wakayama và Yanagimachi, 1999), tế bào thần kinh vỏ não (Yamazaki và ctv, 2001); tế bào mơ tinh hồn (Inoue và ctv, 2003), tế bào gốc da (Heyman và ctv, 2002), tế bào mô sẹo (Inoue và ctv, 2003), tế bào gốc (Saito và ctv, 2003), tế bào máu (Panelli và ctv, 2004).
Sự phù hợp giữa chu kì của tế bào cho nhân và trạng thái tế bào chất của trứng luôn ảnh hưởng lớn đến sự thành cơng trong tạo dịng vơ tính.
Chuyển nhân
Phương pháp thông thường để chuyển nhân của tế bào cho vào trứng nhận là dung hợp màng hai tế bào trên. Ba kỹ thuật phổ biến: Kích thích bằng xung điện, xử lý hóa chất (polyethylen glycol – PEG) và dùng virus Sendai.
Thành phần môi trường dung hợp cho chuyển nhân: Mannitol 0,3M, MgSO4 0,1 mM, CaCl2 0,05 mM.
Nhiệt độ có ảnh hưởng đến quá trình dung hợp, do đó phải duy trì nhiệt độ ổn định.
Khi dung hợp bằng điện, phức hợp trứng – tế bào được đặt trong môi trường nhược trương nhẹ. Phát xung điện một chiều với điện áp cao sẽ làm phá vỡ cấu trúc phospholipid trên màng, tạo những lỗ hổng. Trong quá trình hàn gắn, các màng sẽ dung hợp với nhau. Tỷ lệ thành công với dung hợp điện ở bò từ 36 – 89%, heo là 59%, cừu là 63 – 85% (Wilmut và ctv, 1997; Well và ctv, 1998).
64 Dung hợp bằng virus Sendai đã bị bất hoạt thường có hiệu quả thấp (43 – 69%) nên ít được sử dụng. Nếu sử dụng kết hợp xung điện và virus Sendai thì kết quả cao hơn.
Kỹ thuật mới bỏ qua bước dung hợp hay tách nhân tế bào, được đưa ra bởi Jang- Won Lee (2003) là sử dụng tế bào cho nguyên vẹn tiêm thẳng vào trứng đã loại nhân. Quy trình này được áp dụng để tạo dịng heo với nhân cho là tế bào cumulus và đạt tỉ lệ thành công cao.
Tế bào được chuyển vào trong khoảng khơng quanh hồng thể của trứng. Trước khi đâm thủng màng zona pellucina, tế bào được định vị gần với đầu pipet để làm giảm lượng môi trường đi vào trong trứng. Sử dụng bộ phận vi tiêm để đẩy tế bào ra khỏi pipet vào khoang trứng khi đã đặt chúng tiếp xúc với màng trứng ở vị trí hồng thể và sau đó rút pipet ra. Sau khi dung hợp, tiến hành hoạt hóa trứng và ni phơi.
Hoạt hóa phơi
Phơi một tế bào được hoạt hóa bằng các tín hiệu hóa học hay xung điện để khởi động q trình phát triển tiếp theo.
Ni và cấy phơi
Phơi sau khi hoạt hóa được ni in vitro trong mơi trường với thời gian thích hợp. Sau khi phôi phát triển tới giai đoạn phôi nang (blastocyst) thì cho cấy truyền.
2.2.2. Tái lập trình nhân bằng dung hợp tế bào
a. Dung hợp tế bào (cell fusion) trứng với tế bào 2n
Hình 2.12. Qui trình tạo cừu Dolly
65 Tiến hành dung hợp tế bào biệt hóa và tế bào tồn năng có thể hình thành một tế bào vạn năng có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào nhưng khơng có khả năng phát triển thành phơi. Việc tái lập trình của tế bào dung hợp này có thể khơng ổn định và khó kiểm sốt.
b. Các bước tái lập trình nhân
Trong các kết quả kiểu hình lai tế bào gốc đa năng thường chiếm ưu thế hơn so với các soma đối tác. Các chứng cứ sau đây chứng minh điều này:
(i) Sự bất hoạt NST X là cần thiết để cân bằng với lượng gen liên kết với NST X giữa con cái XX và con đực XY. Ở chuột một NST không hoạt động ở con cái sẽ sớm được kích hoạt khi chúng tham gia vào sự phát triển của tuyến sinh dục. Sự kích hoạt lại NST X được coi là một phương diện trong việc tái lập trình lại gen tổng thể có liên quan đến tính tồn năng và đa năng.
(ii) Trong chuột chuyển gen Oct4-GFP (green fluorescent protein), GFP biểu hiện trong các tế bào gốc đa năng nhưng không phải trong các thymocyte. Sự dung hợp thymocyte với ES (không gắn GFP) các tế bào được kích hoạt GFP thể hiện trong các thể lai (hybrid) (Tada và ctv, 2001).
(iii) Sự dung hợp giữa murine P19 và tế bào lympho T ở người, thể lai biểu hiện Oct4 và Sox2 chuyên biệt là tăng biểu hiện trong khi một tế bào bạch huyết CD45 đánh dấu là giảm biểu hiện.
(iv) Khi dung hợp tế bào fibroblast có Rex-1 GFP với các tế bào ES khơng mang GFP. Các fibroblast khơng có bất cứ biểu hiện nào của GFP, nhưng ở các thể lai có sự biểu hiện của Rex-1 GFP và tính vạn năng được thể hiện như yếu tố phiên mã Oct4, alkaline phosphatase hoạt động, hoạt hóa telomerase và các kháng nguyên bề mặt như SSEA4, TRA 1-61, TRA 1-81. Hơn nữa khi kiểm tra các fibroblast và thể lai, sự biểu hiện gen sinh dưỡng đã giảm trong thể lai.
Những kết quả trên đã đặt ra câu hỏi: liệu nhân tế bào soma đã tái lập trình đầy đủ và có khả năng duy trì tính vạn năng khi khơng có bộ gen của tế bào ES (hoặc EC). Điều quan trọng là làm thế nào để loại bỏ NST tế bào ES sau khi nhân tế bào soma đã tái lập trình hồn tồn (Cowan và ctv, 2005).
Hình 2.13. Mơ hình loại bỏ NST (gen MHC) bằng CEC (Matsumura và ctv, 2007).
Để giải quyết những vấn đề trên Matsumura và cộng sự đã thiết kế một casette loại bỏ NST (CEC- chromosomal elimination casette). MHC (major histocompatibility
66 complex) có ở tế bào gốc để sản xuất các mơ thay thế. Đa số các gen MHC lớp I và II tập trung trên NST số 6 và 17 ở chuột. Việc loại bỏ gen MHC có nguồn gốc từ tế bào ES trong thể lai có thể cho một MHC chuyên biệt cho tế bào lai. Phương pháp CEC (chromosome elimination cassette) giúp loại bỏ các NST chứa gen MHC của tế bào ES thay thế bằng các gen MHC có nguồn gốc từ tế bào soma bàng cách sử dụng một microcellmediated chuyên biệt trong kỹ thuật chuyển NST (Tomizuka và ctv, 1997).
2.2.3. Tái lập trình nhân bằng dịch chiết tế bào
a. Dịch chiết tế bào (cell extract)
Những tế bào thấm được có thể thu nhận dịch chiết của những tế bào vạn năng. Tế bào được xử lý với những chất đành dấu vạn năng tái biểu hiện và tái biệt hóa thành những dịng khác nhau.
Phương pháp này có những biểu hiện hạn chế của tế bào ban đầu và việc tái lập trình chỉ xảy ra ở mức độ giới hạn thấp.
b. Các bước tái lập trình nhân
Dịch chiết tế bào đã được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu nhân tế bào như sự nhân đôi DNA, NST và tính năng động của màng nhân (Martins và ctv, 2000; Poccia và Collas, 1996).
Các ứng dụng dịch chiết tế bào để nghiên cứu tái lập trình nhân được nhóm Collas dùng chiết xuất tế bào T và tế bào thần kinh, các tế bào thận HEK293T của người có thể được tái lập trình để tạo các gene chuyên biệt của tế bào T và các gene tế bào thần kinh. Quy trình được áp dụng đối với tế bào lympho người, tuy nhiên, các tế