Công nghệ tế bào động vật ứng dụng

UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT ỨNG DỤNG TS Nguyễn Thanh Bình LỜI NĨI ĐẦU Hiện cơng nghệ sinh học đóng vai trị lớn việc kết hợp quy trình thiết bị kỹ thuật mức độ tế bào vi sinh vật, tế bào động thực vật để sản xuất quy mô công nghiệp sản phẩm sinh học có chất lượng cao, phục vụ cho lợi ích, nhu cầu người, phát triển kinh tế - xã hội đồng thời góp phần vào bảo vệ môi trường sống Sự thay đổi điều kiện sống qua biến đổi khí hậu tồn cầu, gia tăng dân số thách thức khoa học công nghệ, công nghệ sinh học ứng dụng, để giải việc tăng nguồn lương thực có nguồn gốc từ động thực vật, giải vấn đề y tế, đồng thời giảm tác động tiêu cực đến môi trường hoạt động nông nghiệp gây Nội dung sách tổng hợp từ nhiều nguồn sách, tạp chí khoa học có uy tín giới, số cơng trình nghiên cứu tác giả sách cơng bố nước Quyển sách cung cấp kiến thức kỹ thuật sinh học, khả ứng dụng, kỹ thuật tác động tế bào thành phần tế bào phục vụ thực tiển quy trình sản xuất Đồng thời giới thiệu số phương pháp giải vấn đề tạo giống động vật, chữa bệnh, giải thức ăn sinh học chăn nuôi tác động đến kỹ thuật sinh học mức độ tế bào mà Việt Nam thiếu tài liệu chuyên ngành tiếng việt Xin trân trọng giới thiệu bạn đọc hy vọng nguồn tài liệu tham khảo, học tập, nghiên cứu ứng dụng sản xuất Trân trọng cám ơn Quý giáo sư, đồng nghiệp, chuyên gia lĩnh vực nghiên cứu; GS TS Masahi Miyake- Nguyên Hiệu trưởng Trường Đào tạo Sau đại học Đại học Kobe - Nhật Bản tạo điều kiện, động viên, cung cấp tài liệu để tác giả hoàn thành sách Tác giả TS Nguyễn Thanh Bình MỤC LỤC CHƯƠNG I: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RECOMBINANT DNA VÀ TẠO DÒNG GENE ĐỂ ĐIỀU CHẾ CÁC SẢN PHẨM SINH HỌC PHẦN Giới thiệu PHẦN Tổng quan 1.1 Lịch sử đời kỹ thuật DNA tái tổ hợp 1.2 Kỹ thuật DNA tái tổ hợp (Recombinant DNA) tạo dòng (Gene cloning) 10 1.2.1 Kỹ thuật DNA tái tổ hợp 10 1.2.2 Tạo dòng gene 10 1.2.3 Các bước thực 11 1.2.4 Các enzyme chủ yếu dùng kỹ thuật DNA tái tổ hợp 12 1.2.4.1 Các enzyme giới hạn 12 1.2.4.2 Các enzyme polymerase 13 1.2.4.3 Các enzyme nối (Ligase) 13 1.2.4.4 Các nuclease 14 1.2.5 Các vector sử dụng DNA tái tổ hợp 14 1.2.5.1 Các vector plasmid 15 1.2.5.2 Các vector phage 16 1.2.5.3 Cosmid vector 16 1.2.5.4 Các vector khác 17 1.2.6 Các loại tế bào chủ 17 1.2.6.1 Tế bào chủ nhân sơ 17 1.2.6.2 Tế bào chủ nhân chuẩn 18 1.2.7 Tạo, tách chọn lọc dòng rDNA 19 1.2.7.1 Tạo plasmid tái tổ hợp 19 1.2.7.2 Tách dòng DNA tái tổ hợp 19 1.2.7.3 Chọn lọc dòng DNA đặc hiệu biểu gene 20 1.3 Một số ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp cloning gene điều chế sản phẩm y sinh học 20 1.3.1 Human alpha antitrypsin 20 1.3.1.1 Sơ lược bệnh thiếu men Alpha -1- Antitrypsin (AAT) 20 1.3.1.2 Sản xuất AAT cách sử dụng cừu biến đổi gene 21 1.3.2 rBST (recombinant Bovine somatotrobin)/ rBGH (recombinant bovine growth hormone) 22 1.3.2.1 Giới thiệu rBGH/rBST 23 1.3.2.2 Ứng dụng công nghệ sinh học sản xuất rBST 23 1.3.2.4 Ảnh hưởng rBST đến khả sản xuất sữa bò 24 1.3.2.5 Lợi ích rủi ro sử dụng BST 25 PHẦN Kết luận 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO 27 CHƯƠNG II: MÔ DA DÙNG TRONG DỊNG HĨA 29 Phần A: MƠ DA DÙNG TRONG DỊNG HĨA 29 PHẦN Giới thiệu 29 PHẦN Nội dung 29 2.1 Các lớp tế bào da 29 2.1.1 Lớp biểu bì 30 2.1.1.1 Lớp đáy (stratum basale) hay lớp mầm (stratum germinativum) 30 2.1.1.2 Lớp gai (stratum spinosum) 31 2.1.1.3 Lớp hạt (Stratum granulosum) 31 2.1.1.4 Lớp bóng (Stratum lucidum) 31 2.1.1.5 Lớp sừng (Stratum corneum) 31 2.1.2 Lớp bì 32 2.1.3 Lớp hạ bì 32 2.2 Tế bào gốc da 32 2.2.1 Tế bào gốc da lớp biểu bì 33 2.2.1.1 Các yếu tố định phân chia tế bào gốc biểu bì 36 2.2.2 Nang lơng tóc 40 2.2.2.1 Sự hình thành nang lông 40 2.2.2.2 Chu kỳ lơng tóc tế bào gốc nang lông 41 2.2.2.3 Các yếu tố định phân chia tế bào gốc nang 42 2.2.3 Tuyến nhờn (SG) 45 2.3 Vai trò tế bào gốc da 46 PHẦN Kết luận 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 Phần B: DỊNG HĨA BỊ 50 PHẦN Mở đầu 50 PHẦN Nội dung 50 2.1 Những nghiên cứu dịng hóa bò 50 2.2 Kỹ thuật dịng hóa 52 2.2.1 Bước 1: Chuẩn bị tế bào chất nhận 52 2.2.2 Bước 2: Xử lý tế bào cho 53 2.2.3 Bước 3: Tái kết cấu 54 2.2.4 Bước 4: Ni cấy in vitro nỗn tái kết cấu 54 2.2.5 Bước 5: Cấy phôi vào tử cung "mẹ nuôi" phát triển thành bào thai 55 2.3 Dòng hóa từ tế bào thai 55 2.3.1 Tế bào phôi lấy từ thai 55 2.3.2 Tế bào sinh dưỡng lấy từ thai 55 2.4 Dịng hóa từ tế bào sinh dưỡng trưởng thành 55 2.4.1 Chiến lược chuyển nhân tế bào sinh dưỡng chu kỳ tế bào 55 2.4.2 Đồng pha tế bào cho 56 2.4.3 Các loại tế bào sinh dưỡng sử dụng 56 2.5 Hiệu dịng hóa bị 56 2.5.1 Dịng hóa từ phơi 56 2.5.1.1 Phát triển in vitro 56 2.5.1.2 Phát triển in vivo 57 2.5.1.3 Hiệu chung 57 2.5.1.4 Những yếu tố giới hạn 57 2.5.2 Hiệu dịng hóa từ tế bào sinh dưỡng 58 2.5.2.1 Phát triển in vitro 58 2.5.2.2 Phát triển trước sanh 58 2.5.2.3 Sức sống bị dịng hóa 59 PHẦN Kết luận 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 Phần C: TÁI LẬP TRÌNH NHÂN 62 2.1 Khái niệm tái lập trình nhân 62 2.2.Tái lập trình nhân tế bào sinh dưỡng 62 2.2.1.Tái lập trình nhân chuyển nhân 62 2.2.2.Tái lập trình nhân dung hợp tế bào 64 2.2.3.Tái lập trình nhân dịch chiết tế bào 66 2.2.4.Cấy ghép tế bào 66 2.2.5.Tái lập trình nhân phân tử nhỏ 67 2.3.Các yếu tố kiểm sốt q trình tái lập trình nhân 68 2.3.1.Các yếu tố tế bào 69 2.3.2.Các nhân tố bên 71 2.4.Giới hạn sinh học kỹ thuật tái lập trình nhân 74 2.4.1.Sự bất hoạt NST X 74 2.4.2.Dị ty thể (Mitochondrial heteroplasmy) 75 2.4.3.Sự ngắn dần telomere 75 2.4.4.Sự đột biến 76 2.4.5.Thất bại trình in dấu gene 76 2.4.6.Sai sót mặt kỹ thuật 76 2.5.Khiếm khuyết động vật tạo dịng vơ tính 77 Kết luận 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 Phần D: ỨNG DỤNG CHUYỂN NHÂN Ở HEO 80 PHẦN Mở đầu 80 PHẦN Nội dung 80 2.1 Những nghiên cứu bước đầu 80 2.2 Những kiện phân tử tái lập trình nhân heo 81 2.2.1 Định nghĩa chung 81 2.2.2 Tái lập trình nhân heo 81 2.2.2.1 Sự phồng lên nhân chuyển 81 2.2.2.2 Sự tổng hợp mRNA 82 2.2.2.3 Một số gene tham gia trình tái lập trình 84 2.3 Hoạt hóa trứng 86 2.3.1 Chu kỳ tế bào 86 2.3.2 Cơ chế hoạt hóa trứng 86 2.4 Sự phát triển in vitro phôi chuyển nhân 87 2.5 Vấn đề sản xuất heo chuyển nhân 88 2.6 Ứng dụng tạo đời kỹ thuật chuyển nhân 89 PHẦN Kết luận 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO 92 CHƯƠNG III: LẬP TRÌNH CỦA DI TRUYỀN NGOÀI NHÂN DNA (EPIGENETIC) 93 3.1.Định nghĩa epigenetic 93 3.2.Cơ sở phân tử epigenetic 93 3.3.Các yếu tố epigenetic ảnh hưởng đến biểu gene 95 3.4.Các vấn đề cần quan tâm 97 TÀI LIỆU THAM KHẢO 98 CHƯƠNG IV: XÁC ĐỊNH TÍNH ĐA NĂNG CỦA TẾ BÀO 99 4.1 Khái niệm 99 4.2 Phân loại tế bào gốc 99 4.3 Đặc điểm sinh học 101 4.3.1 Tính vạn 101 4.3.2 Tính tự làm 101 4.3.3 Tính mềm dẻo 101 4.4 Những ứng dụng tính đa tế bào 101 4.4.1 Trong nghiên cứu 101 4.4.2 Ghép tế bào gốc trị liệu (stem cell therapy) 102 4.5 Phương pháp thu nhận tế bào gốc 103 TÀI LIỆU THAM KHẢO 104 CHƯƠNG V: CƠ CHẾ DI TRUYỀN PHÂN TỬ TRONG VIỆC TẠO CÁC LOẠI TẾ BÀO CHUYÊN BIỆT 106 5.1 Protein điều hòa 106 5.2 Methyl hóa DNA 109 5.3 Đoạn DNA giàu CG (vùng CpG (CG) đảo CpG) 113 5.4 Sự in dấu di truyền biểu gene theo nguồn gốc 114 5.5 Kiểm soát sau phiên mã (post-transcription control) 116 5.5.1 Biến đổi sau phiên mã đầu 5’ 3’ tiền mRNA (pre-mRNA) 116 5.5.2 Quá trình trưởng thành tiền mRNA 118 5.5.3 Sự vận chuyển mRNA trưởng thành khỏi nhân – Đời sống mRNA, phân hủy mRNA 120 TÀI LIỆU THAM KHẢO 122 CHƯƠNG VI: KỸ THUẬT SINH HỌC TRONG CẢI TIẾN TỶ LỆ SINH SẢN VÀ CHẤT LƯỢNG THƯƠNG PHẨM 123 6.1 Cấy truyền phôi bảo quản phôi 123 6.1.1 Lịch sử phát triển công nghệ cấy truyền phôi (CTP) 123 6.1.2 Cấy truyền phôi (Embryo Transfer - ET) 124 6.1.3 Kỹ thuật cấy truyền phơi bị 125 6.1.4 Bảo quản phôi 126 6.1.5 Ý nghĩa công nghệ bảo quản chuyển cấy phôi 127 6.1.6 Ứng dụng chuyển cấy bảo quản phôi chăn nuôi 128 6.2 Công nghệ thụ tinh nhân tạo (Artificial Insemination - AI) 128 6.3 Kỹ thuật PCR xác định giới tính phôi 129 6.3.1 PCR 129 6.3.2 Nguyên tắc PCR 130 6.3.3 Kỹ thuật xác định giới tính phơi bị PCR 130 6.3.4 Ý nghĩa xác định giới tính chăn ni 131 6.4 Đánh giá chất lượng tinh trùng kỹ thuật Hypoosmotic swelling test (HOST) 133 6.4.1 Định nghĩa 133 6.4.2 Phương pháp 133 6.4.3 Ứng dụng 133 TÀI LIỆU THAM KHẢO 135 CHƯƠNG VII: KỸ THUẬT TẠO THÚ BIẾN ĐỔI GENE VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN PHẨM THUỐC VÀ Y SINH HỌC 136 7.1 Khái niệm chung 136 7.1.1 Sinh vật biến đổi gene 136 7.1.2 Sự phát triển khoa học chuyển gene động vật 137 7.2 Công nghệ tạo động vật chuyển gene 137 7.2.1 Tách chiết, phân lập gene mong muốn tạo tổ hợp gene biểu tế bào động vật 138 7.2.1.1 Tách chiết, phân lập gene mong muốn 138 7.2.1.2 Tạo tổ hợp gene chuyển biểu tế bào động vật 139 7.2.2 Tạo sở vật liệu biến nạp gene 139 7.2.3 Chuyển gene vào động vật 140 7.2.3.1 Phương pháp vi tiêm 140 7.2.3.2 Phương pháp xung điện 141 7.2.3.3 Phương pháp tiêm trực tiếp 142 7.2.3.4 Phương pháp lây nhiễm retrovirus 142 7.2.3.5 Sử dụng súng bắn gene 142 7.2.3.6 Sử dụng tế bào gốc phôi 143 7.2.3.7 Đóng gói DNA ngoại lai liposome chuyển vào tế bào hay phôi 144 7.2.4 Nuôi cấy phôi ống nghiệm 144 7.2.5 Kiểm tra động vật sinh từ phôi chuyển gene 144 7.2.5.1 Phương pháp thẩm tách DNA 145 7.2.5.2 Phương pháp PCR 145 7.2.6 Tạo nguồn động vật chuyển gene cách liên tục 145 7.3 Một số thành tựu lĩnh vực tạo động vật chuyển gene 146 7.3.1 Chuột chuyển gene 146 7.3.2 Heo chuyển gene 146 7.3.3 Gà chuyển gene 147 7.3.4 Dê biến đổi gene 148 7.3.5 Chống sốt rét muỗi biến đổi gene 148 7.3.6 Điều trị thành công liệu pháp gene cho người mù 148 Kết luận 148 TÀI LIỆU THAM KHẢO 149 PHẦN THAM KHẢO 150 CHƯƠNG I: L-LYSINE TRONG TỔ HỢP KHẨU PHẦN THỨC ĂN 150 PHẦN Mở đầu 150 PHẦN Tổng quan L-lysine 150 1.1 Giới thiệu chung 150 1.2 Vai trò lysine 151 1.3 Cơ chế hoạt động lysine 151 1.4 Các trường hợp cần bổ sung lysine phần thức ăn 152 1.4.1 Trên người: Thực phẩm chức năng, điều trị bệnh 152 1.4.2 Vật nuôi: Bổ sung vào thức ăn cho gia súc, gia cầm 153 1.5 Sản xuất lysine 155 1.5.1 Lịch sử trình sản xuất lysine 155 1.5.2 Phương pháp sản xuất L-lysine 155 PHẦN Kết luận 159 TÀI LIỆU THAM KHẢO 160 CHƯƠNG II: DÒNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS TẠO CHẤT BỔ SUNG TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI VÀ BACTERIOCIN KHÁNG KHUẨN 161 2.1 Biến đổi dòng vi khuẩn 161 2.2 Bacteriocin 161 2.2.1 Khái niệm Bacteriocin 161 2.2.2 Hoạt động Bacteriocin 162 2.2.3 Cơ chế hoạt động 162 2.2.4 Ứng dụng 162 2.2.4.1 Bảo quản lương thực – thực phẩm 162 2.2.4.2 Bacteriocin chăn nuôi 166 2.2.4.3 Một số sản phẩm thị trường 166 2.3 Đặc điểm chung vi khuẩn lactic 169 2.4 Lên men lactic 170 2.5 Ứng dụng lactobacillus 172 2.5.1 Sản xuất probiotic 172 2.5.2 Sản xuất ACIDIFIER 176 KẾT LUẬN 178 TÀI LIỆU THAM KHẢO 178 CHƯƠNG III: CHUẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM VÚ Ở BÒ SỮA 179 3.1 Bệnh leukocyte bò sữa Holstein Friesian 179 3.1.1 Khái niệm bệnh leukocyte 179 3.1.2 Kỹ thuật sinh học chẩn đoán bệnh leukocyte 180 3.1.2.1 Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) 180 3.1.2.2 Kỹ thuật lai phân tử Southern blot 185 3.2 Bệnh viêm vú bò sữa 187 3.2.1 Khái niệm bệnh viêm vú 187 3.2.2 Kỹ thuật sinh học chẩn đoán bệnh viêm vú 188 3.2.2.1 Phương pháp thử viêm vú CMT (California Mastitis Test) 188 3.2.2.2 Máy đếm tế bào (flow cytometer) 190 3.2.2.3 Kỹ thuật ELISA (Enzymee-linked immunosorbent assay) 192 3.2.2.4 Một số phương pháp khác chẩn đốn viêm vú tiềm ẩn bị sữa 196 Kết luận 196 TÀI LIỆU THAM KHẢO 197 CHƯƠNG I ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RECOMBINANT DNA VÀ TẠO DÒNG GENE ĐỂ ĐIỀU CHẾ CÁC SẢN PHẨM SINH HỌC PHẦN Giới thiệu Những cố gắng không ngừng người việc nâng cao sức khỏe, có đóng góp tiến khoa học đại Trong bao gồm lĩnh vực cơng nghệ gene công nghệ chuyển gene phát liệu pháp gene dựa việc sản xuất protein tái tổ hợp (sữa bò chuyển gene cung cấp nguồn protein an tồn, có giá trị cao chế phẩm khác điều trị bệnh cho người sản xuất men Alpha antitrypsin từ cừu biến đổi gene ) Kể từ năm 1970, nhà khoa học chuyển gene lạ vào vi khuẩn bắt biểu gene Tuy nhiên, có protein phục vụ cho nhu cầu người ngày đòi hỏi phức tạp thể vi khuẩn không biểu cần đến động vật chuyển gene Sản phẩm thành công người sản xuất sản phẩm sinh học thông qua chuyển gene Insulin hoocmon sinh trưởng vào vi khuẩn E coli PHẦN Tổng quan 1.1 Lịch sử đời kỹ thuật DNA tái tổ hợp Năm 1972, phân tử DNA tái tổ hợp tạo trường Đại học Stanford (Mỹ) nhà khoa học Paul Berg cộng thực cách sử dụng đặc tính cắt enzyme giới hạn (Restriction enzyme) khả nối mạch DNA với enzyme nối ligase Nhờ kỹ thuật vật chất di truyền thường hay vài gene lắp ghép vào phân tử DNA có nguồn gốc khác (Ví dụ: lắp ghép gene động vật, thực vật vào plasmid vi khuẩn vào phage  ) để hình thành DNA tái tổ hợp Khi thể DNA tái tổ hợp tạo thành chuyển từ thể (cơ thể cho) sang thể tế bào khác (cơ thể nhận tế bào nhận) Điều quan trọng gene tái tổ hợp trì chức cũ thể, tế bào nhận Năm 1973, nhà khoa học nối nhiều đoạn DNA vào plasmid tách từ vi khuẩn Escherichia coli (E coli) Plasmid hoạt động, tự chép đưa vào tế bào vi khuẩn E coli, từ tạo công nghệ quan trọng công nghệ di truyền tách dòng gene Thành tựu kỹ thuật DNA tái tổ hợp việc sản xuất kích thích tố sinh trưởng người (hGH-human growth hoocmon) nhờ vi sinh vật nhận E coli Các nhà khoa học đưa gene mã hóa hGH vào E coli E coli có DNA tái tổ hợp sản sinh lượng lớn kích thích tố sinh trưởng người sử dụng vào thực tiễn y học Tiếp đó, vào năm đầu thập kỷ 80 kỷ XX, nhờ kỹ thuật DNA tái tổ hợp, người ta sản xuất interferol, sản xuất protein chống đơng máu… Là PCR có chương trình ln nhiệt có nhiệt độ bắt cặp giảm dần 10 hay 20 chu kỳ đầu, sau chu kỳ giảm 0,5-10C để đạt đến nhiệt độ bắt cặp thích hợp mồi (A) (B) (Trích dẫn Phạm Hùng Vân, 2009) Hình 3.6 (A) Chương trình luân nhiệt Touch-Down PCR với nhiệt độ bắt cặp giảm dần (B) Chương trình luân nhiệt Touch-Down PCR với nhiệt độ bắt cặp giảm bước f RT-PCR (reverse transcription PCR) Là phương pháp PCR mà nucleic acid đích cần phải phát RNA (ribonucleic acid) Để thực trước hết RNA đích phải phiên mã ngược thành cDNA sau dùng PCR để khuyếch đại trình tự đích cDNA cặp mồi đặc hiệu cho trình tự (A) (B) (Phạm Hùng Vân, 2009) Hình 3.7 (A) RT-PCR với giai đoạn RT dùng mồi đặc hiệu (B) RT-PCR với giai đoạn RT dùng mồi ngẫu nhiên 183 g Kỹ thuật PCR định lượng (real-time PCR) Là phương pháp khuyếch đại gene hai trình khuyếch đại gene đọc kết thực ống hay giếng mẫu Kỹ thuật cho phép giảm thời gian chẩn đoán xét nghiệm thực công đoạn chạy gene để phát sản phẩm khuyếch đại, đồng thời hạn chế vấy nhiễm hóa chất D Ứng dụng PCR Lập đồ gene; phân loại động, thực vật; kiểm tra huyết thống; chẩn đoán bệnh di truyền; phân tích mẫu DNA cổ; tách dịng gene; định kiểu gene đột biến chẩn đoán bệnh nhiễm trùng (Phạm Hùng Vân, 2009) E Cách thực đọc kết PCR bò sữa bị BLAD (Ribeiro L A ctv, 2000) Lấy mẫu máu: lấy 500 µl huyết tương bị sữa Holstein, Các bước thực hiện: - Rửa ba lần mẫu máu với ml dung dịch hòa tan gồm (0,32 M đường sucrose, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, mM MgCl2 1% Triton X- 100) Các tế bào bạch cầu tái lơ lửng 0,5 ml 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 1% Triton X-100 60ng/µl proteinase K - Dung dịch ủ 50ºC giờ, sau ủ 95ºC 15 phút, làm bất hoạt enzyme proteinase K DNA lưu trữ -20ºC sử dụng - Khảo nghiệm PCR: Khuếch đại phản ứng mẫu DNA lấy từ máu chuẩn bị với thể tích 25µl chứa: PCR đệm gồm (20 mM Tris-HCl, pH 8,4, 50 mM KCl), 0,2 mM dNTPs, 0,5 đơn vị Taq polymerase DNA, 1,5 mM MgCl2, 200 nM, đoạn mồi trước, 5'CCCTGCCAGTCCAGCTGGACACC3' đoạn mồi ngược 5'CCACGCCCATCATTCTGGGGCAG3' 100 ng gene DNA Khuếch đại thực 35 chu kỳ (15 chu kỳ 94ºC 20 chu kỳ 69ºC) Sau lấy µl ủ với enzyme TaqI HaeIII, 1,5 65ºC 37ºC, tương ứng Sản phẩm phân tích 4% đường agarose ethidium bromide - Cách đọc kết quả: Các đoạn mồi sử dụng để khuếch đại đoạn DNA 58 bp Các enzymee TaqI hạn chế sản phẩm PCR thành hai mảnh vỡ 26 32 bp động vật bình thường homozygote (hình 1, tất đường, ngoại trừ 5, 7, 18 22, hình, đường 1, 2, 3, 5) Dị hợp tử động vật cho ba mảnh vỡ 58, 26 32 bp (hình 1, đường 5, 7, 18 22) 184 Để xác nhận xuất đột biến CD18, mẫu ủ với enzyme HaeIII Các enzyme tác động sản phẩm PCR thành hai mảnh vỡ 49 bp cá thể bình thường thành ba mảnh 9, 19 30 bp động vật bị ảnh hưởng Dị hợp tử động vật có bốn mảnh 9, 19, 30 49 bp (Ribeiro L A ctv, 2000) 3.1.2.2 Kỹ thuật lai phân tử Southern blot  Khái niệm kỹ thuật lai phân tử Southern blot Theo Nguyễn Ngọc Hải (2007), kỹ thuật lai phân tử bắt cặp đoạn dò acid nucleic mạch đơn với mạch đơn acid nucleic khác từ mẫu Dựa nguyên tắc bắt cặp bổ sung nucleotide, bắt cặp xảy chuỗi nucleotide có trình tự bổ sung hồn tồn tương đồng xảy trường hợp tương đồng chuỗi phần triệu Điều định tính đặc hiệu phản ứng lai sở ứng dụng cho việc chẩn đoán phân biệt loài vi sinh vật khác đột biến di truyền Kỹ thuật Southern blot Edward Southern phát minh năm 1970, cho phép nghiên cứu DNA gene, kiểm tra kết chuyển gene kiểm tra có mặt gene (1 trình tự DNA) gene tế bào 185 Hình 3.8 Nguyên tắc lai phân tử (Bùi Minh Trí, 2006)  Các bước Southern blot (Nguyễn Ngọc Hải, 2007) - Đầu tiên cần tách chiết DNA gene tế bào, sử dụng enzyme giới hạn (RE) cắt phân tử DNA thành đoạn nhỏ, điện di gel agarose để tách đoạn DNA theo kích thước - Gây biến tính DNA (biến thành mạch đơn) gel dung dịch kiềm (thường dùng NaOH 0,5 M: MaCl 1,5 M), sau chuyển đoạn DNA từ gel lên màng lai sức mao dẫn (màng lai thường sử dụng màng nitrocellulose) Vị trí đoạn DNA gel giữ nguyên chuyển lên màng lai - Sử dụng mẫu dị (probe) có đánh dấu phóng xạ lai với đoạn DNA màng lai, tạo nên phân tử DNA lai Tiến hành lai phân tử cách cho vào hợp lai chuyên dụng lớp khoảng 0,2 – 0,4 cm dịch lai, chứa mồi có đánh dấu phóng xạ Đặt màng lai vào hộp lai nhiệt độ 650C/3 – giờ, sau thêm dịch lai với chế độ nhiệt 650C lắc nhẹ để tăng tốc độ phản ứng Rửa màng lai dung dịch SSC (NaCl, natri citrate nước) nhiệt độ 650C hai đến ba lần để loại bỏ mẫu dị khơng bắt cặp chuyên biệt với DNA cố định màng Sau rửa thấm khô giấy lọc sấy khô 650C - Thực phóng xạ tự ghi (autoradiography) để định vị phân tử lai (DNA gene – mẫu dò) cách đặt phim nhạy cảm với tia phóng xạ áp sát màng lai Các phân tử lai (các mẫu dị có đánh dấu phân tử lai) tác động lên phim giây đọc kết lai qua chấm đen phim  Ứng dụng Southern blot Xác định diện, kích thước, số lượng sao, tính đồng dạng DNA phức hợp (phát gene đặc biệt gene nguyên vẹn) 186 Hình 3.9 Các bước kỹ thuật Southern blot http://meds.queensu.ca/qcri/flow/cri-fc-getstarted.htm 3.2 Bệnh viêm vú bò sữa 3.2.1 Khái niệm bệnh viêm vú Theo Chung Anh Dũng (2007), bệnh viêm vú phổ biến bị sữa, thơng thường 50% bị bị nhiễm khoảng 5% thể rõ triệu chứng lâm sàng, có hai loại bệnh viêm vú: - Viêm vú lâm sàng nhiễm trùng lộ rõ bầu vú thể triệu chứng qua mức độ thay đổi sữa (sữa bị vón, lỗng, màu sắc mùi khác thường); hình dạng bầu vú thay đổi (bầu vú sung huyết, sưng to…), vài trường hợp dẫn đến triệu chứng toàn thân (sốt, hay bỏ ăn…) - Viêm vú cận lâm sàng hay gọi viêm vú tiềm ẩn chưa có dấu hiệu viêm, nghĩa số lượng tế bào soma (Somatic cell counts- SCC) sữa cao khơng có bất thường rõ ràng sữa bầu vú Đối với trường hợp viêm vú tiềm ẩn lâm sàng thể nhẹ khó phát mắt thường thông qua việc sờ khám bầu vú mà phát thơng qua số chẩn đoán phi lâm sàng như: Kiểm tra thử nghiệm CMT 187 (California Mastitis Test), đếm số lượng tế bào soma phát vi khuẩn để chẩn đoán bệnh viêm vú cận lâm sàng (Varatanovic N ctv, 2010) 3.2.2 Kỹ thuật sinh học chẩn đoán bệnh viêm vú 3.2.2.1 Phương pháp thử viêm vú CMT (California Mastitis Test) Theo Mellenberger R (2001), CMT xét nghiệm dùng để chẩn đoán bệnh viêm vú tiềm ẩn cách dùng thuốc thử Leucocytest (thành phần 10% Teepol 1/10.000 bột Bromo cresol)  Nguyên tắc Thuốc thử Leucocytest chất có hoạt tính bề mặt (làm thay đổi sức căng bề mặt), có đặc tính làm gel hóa sữa có chứa tế bào bạch cầu, dẫn đến thay đổi tính chất nhớt sữa Phản ứng gel hóa tự đánh giá theo cách bán định lượng theo mối tương quan với mức độ viêm nhiễm đặc hiệu bầu vú (Mellenberger R., 2001) Bảng 3.1 Giải thích kết CMT (Mellenberger R., 2001) Mức độ CMT Số lượng tế bào Kết luận Hỗn hợp đồng nhất, màu xám 100.000 Bình thường Hỗn hợp lợn cợn, màu xám ngã tím T 300.000 Nghi ngờ Sự vón cục bền nhìn thấy rõ, màu xám tím 900.000 Viêm vú tiềm ẩn Đóng vón dày thành đám nhớt, màu tím 2.700.000 Viêm vú tiềm ẩn 8.100.000 Viêm vú tiềm ẩn gần biểu lâm sang Hỗn hợp sữa thuốc thử Đóng vón dày giống lịng trắng trứng, màu tím đậm 188  Các bước tiến hành đọc kết CMT 1/ Vắt lấy sữa đầu từ núm vú (đánh dấu số thứ tự núm vú) 2/ Chỉ lấy ml sữa đầu từ núm vú 3/ Cho vào ô (đã chứa ml sữa) ml thuốc thử leucocytest 4/ Lắc hỗn hợp 5/ Xét nghiệm phải đọc Nếu bạn chờ đợi lâu, kết khơng đáng tin cậy Hình 3.10 Các bước tiến hành CMT http://www.dgz.be/ondersteuning/programmas_runderen/gezonmelk_cmt.asp 189 Mức độ Mức độ Mức độ Nghi ngờ Hình 3.11 Cách đọc kết CMT http://www.dgz.be/ondersteuning/programmas_runderen/gezonmelk_cmt.asp 3.2.2.2 Máy đếm tế bào (flow cytometer) a Khái niệm tế bào soma Theo Viện Chăn nuôi (2001), tế bào soma tế bào bình thường thể có số lượng thấp sữa Nếu số lượng tế bào soma tăng sữa điều khơng bình thường, điều dẫn đến chất lượng sữa bị giảm bị bị nhiễm trùng phía tuyến vú Số lượng tế bào soma (somatic cell counts- SCC) dùng để đánh giá chất lượng sữa Thành phần tế bào chủ yếu tổng số tế bào soma (SCC) tế bào bạch cầu số tế bào tuyến vú (tế bào biểu mô) Các tế bào biểu mô phận bình thường thể, chúng bị bong lại tái sinh bình thường Tế bào 190 bạch cầu có vai trị bảo vệ thể để chống lại bệnh tật hỗ trợ việc xây dựng lại mô bào tuyến vú bị tổn thương Số lượng SCC đàn bị bình thường nhìn chung 200.000/ml, số lượng SCC 250.000-300.000/ml cho ta biết đàn bò bị viêm vú vi sinh vật b Máy phát viêm vú điện tử hay máy đo điện trở sữa Theo Chung Anh Dũng (2007), nhấn công tắc máy phát viêm vú khơng có sữa cốc đo, hình hiển thị số “1 0”, chứng tỏ pin kết nối tốt với dụng cụ khơng có thử nghiệm Cầm cốc đo đặt núm vú thùy vú muốn kiểm tra, vắt sữa trực tiếp vào cốc đo đến ngang vạch quy định cốc Sau ấn cơng tắc giữ 1-2 giây hình hiển thị số Nếu sử dụng loại máy khơng có điều chỉnh nhiệt độ, kết phải ghi nhận sau vắt sữa đầy cốc đo Dựa kết máy đo để đánh giá mức độ viêm vú (A) (B) Hình 3.12 (A) Máy đo điện trở sữa (B): Máy đếm tế bào soma (Nguồn: http://apsdairycell.apstherapy.fr/html/DairyCell%20info%20mastitis%202008 htmhttp://www.easterndairy.ca/management.html) c Nguyên tắc máy đếm tế bào Máy đếm tế bào phân tích lượng lớn tế bào đơn Thiết bị gồm hệ thống thủy động học áp lực, chùm laser, mặt phẳng chặn tia laser/dòng tế bào, chuỗi máy dò ánh sáng phân tích số liệu Q trình thu nhận số liệu sau: - Tế bào nhuộm thuốc tế bào (huỳnh quang), cho dòng tế bào vào máy đếm chảy theo ống nhỏ có lỗ cho tế bào qua Dịng tế bào qua vùng có tia laser để kích hoạt phẩm nhuộm huỳnh quang Tín hiệu huỳnh quang tiếp nhận hệ thống máy vi tính để phân tích tín hiệu từ tính số lượng tế bào 191 - Sau nhuộm tế bào tích điện tích khác bề mặt tế bào nên dùng từ trường điện để tách loại tế bào riêng biệt (Trần Thị Dân, 2005) Hình 3.13 Nguyên lý máy đếm tế bào http://meds.queensu.ca/qcri/flow/cri-fc-getstarted.htm 3.2.2.3 Kỹ thuật ELISA (Enzymee-linked immunosorbent assay) Theo Charlier J ctv (2005), dùng kỹ thuật ELISA để chẩn đoán phát bệnh viêm vú bò sữa Trong kỹ thuật ELISA người ta sử dụng enzyme đánh dấu thay cho chất đồng vị phóng xạ ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay) kỹ thuật sinh hóa để phát kháng thể hay kháng nguyên mẫu xét nghiệm Hiện ELISA sử dụng nhiều lĩnh vực nghiên cứu y học, nông nghiệp đặc biệt kiểm tra an toàn sản phẩm sinh học a Nguyên lý Theo Nguyễn Ngọc Hải (2007), số enzyme alkaline phosphatase hay peroxidase gắn kết với kháng thể cách khơng đặc hiệu, enzyme nhận biết nhờ vào phản ứng chúng với chất tương ứng, nhờ thơng qua enzyme nói để phát kháng thể gắn kết với chúng Hoạt tính xúc tác enzyme giải phóng oxy nguyên tử từ H2O2, oxy oxy hóa chất thị màu, làm thay đổi màu hỗn dịch Chất thị màu thay đổi chứng minh có mặt enzyme kết hợp kháng nguyên với kháng thể Như vậy, kỹ thuật ELISA gồm thành phần tham gia phản ứng: 192 - Kháng nguyên: thường gắn sẵn giá Hiện người ta thường sử dụng loại giá đĩa ELISA 96 giếng - Kháng thể cần xác định huyết - Conjugate phức hợp có gắn chất thị màu Kỹ thuật bao gồm hai bước: - Phản ứng miễn dịch học: kết hợp kháng nguyên kháng thể - Phản ứng hóa học: nhờ hoạt tính enzyme để giải phóng oxy ngun tử oxy nguyên tử oxy hóa chất thị màu Chất thị thay đổi màu có nghĩa chứng minh có mặt enzyme chứng minh kết hợp kháng nguyên với kháng thể b Phân loại Có nhiều loại kỹ thuật ELISA dùng chẩn đốn: ELISA trực tiếp, ELISA gián tiếp, ELISA cạnh tranh,… Hình 3.14 Các bước Sandwich ELISA (http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/ELISA) Giải thích: (1) Phủ đĩa KT; (2) Thêm mẫu cần xác định KN KN (nếu có) gắn với KT; (3) kháng thể dùng để phát thêm vào kết hợp với KN; (4) Thêm KT thứ cấp liên kết với enzyme KT thứ cấp gắn với KT dùng để phát hiện; (5) Thêm chất Enzyme làm biến đổi chất phát tín hiệu phát đo + Kỹ thuật ELISA trực tiếp Kháng nguyên gắn vào đáy giếng phản ứng sau phủ lên kháng thể đặc hiệu gắn enzyme ủ nhiệt độ thời gian thích hợp Sau rửa để loại bỏ kháng thể gắn enzyme (conjugate) không kết hợp với kháng nguyên cho vào giếng chất màu Đọc kết sau 10 phút quang phổ kế Có thể đọc kết theo hai trường hợp sau: + Nếu kháng ngun đặc hiệu với kháng thể có kết hợp kháng nguyên kháng thể gắn enzyme (conjugate) khơng bị rửa trơi, giếng có diện enzyme Enzyme giải phóng oxy nguyên tử từ H2O2 (cho vào chất màu) để oxy hóa chất màu làm thay đổi màu hỗn dịch giếng 193 + Nếu kháng nguyên không đặc hiệu với kháng thể khơng xảy kết hợp kháng nguyên – kháng thể, conjugate bị rửa trôi giếng khơng có enzyme để giải phóng oxy nguyên tử từ H2O2 oxy hóa chất màu kết hỗn dịch giếng phản ứng không thay đổi màu Hình 3.15 Kỹ thuật ELISA trực tiếp (http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=1194) + Kỹ thuật gián tiếp Về nguyên tắc kỹ thuật gián tiếp không khác so với kỹ thuật trực tiếp kỹ thuật gián tiếp có tăng thêm bước phản ứng Conjugate kỹ thuật trực tiếp kháng thể đặc hiệu gắn enzyme, conjugate phản ứng gián tiếp kháng thể khác loài kháng lại kháng thể có mặt huyết cần chẩn đốn Với phản ứng gián tiếp kháng thể đặc hiệu có hai chức năng: kháng thể kháng nguyên, hai kháng nguyên conjugate Khi đọc kết có hai trường hợp xảy ra, tương tự kỹ thuật ELISA trực tiếp: phản ứng dương tính màu hỗn dịch thay đổi ngược lại phản ứng âm tính màu hỗn dịch khơng thay đổi Hình 3.16 Kỹ thuật ELISA gián tiếp http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=1194 + Kỹ thuật ELISA cạnh tranh 194 Hình 3.17 Kỹ thuật ELISA cạnh tranh http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=1194 Trong ELISA cạnh tranh, conjugate kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên gắn bề mặt giếng Do có cạnh tranh kháng thể huyết conjugate trình gắn kết với kháng nguyên để hình thành phức hợp kháng nguyên- kháng thể, kháng nguyên- conjugate Phức hợp kháng nguyên- kháng thể phức hợp kháng nguyên- conjugate có màu đậm so với môi trường ngược lại Tùy vào mức độ đậm nhạt màu (được đánh giá tỷ số chênh OD ánh sáng có độ dài sóng thích hợp) mà người ta xác định dương tính, âm tính hay nghi ngờ c Ứng dụng ELISA Phát kháng nguyên hay kháng thể kháng kháng nguyên d Cách thực kỹ thuật ELISA chẩn đoán bệnh viêm vú bò sữa Lấy mẫu sữa huyết thanh: mẫu sữa thu thập hàng tuần cần vô trùng trước vắt sữa Sữa (0,1 ml) cấy trực tiếp cừu máu agar ấp 18-24 h 370C xét nghiệm vi khuẩn Hoặc 10 ml sữa bị đông lạnh -200C vòng sau thu huyết học để phân tích thêm Mẫu máu thu thập hàng tuần sau vắt sữa Huyết thu thập sau ly tâm (15 phút 2.000 vòng / phút) lưu trữ -200C pha loãng lần (vol / vol) với glycerol Đối với phương pháp ELISA, đĩa thí nghiệm gồm 96 giếng tráng 100 pl kháng nguyên Listeria monocytogenee ủ cacbonat-bicarbonate đệm (0,1 M, pH 9,6) Sau rửa với dung dịch PBS có bổ sung 0,1% (vol/vol) Tween 20 (Sigma Chemical Co) Sau rửa, giếng bão hịa với 150 pl PBS có bổ sung 0,5% (wt / vol) gelatin 370C để làm giảm hấp phụ không đặc hiệu Sau bổ sung chất thị màu đọc kết quang phổ (Bourry A ctv, 1996) 195 3.2.2.4 Một số phương pháp khác chẩn đoán viêm vú tiềm ẩn bò sữa a Kiểm tra thay đổi pH sữa Theo Chung Anh Dũng (2007), bình thường sữa bị có pH khoảng 6,5 đến 6,7 thường 6,6 nhiệt độ 25oC Khi pH cao 6,7 vú bị viêm, pH thấp 6,5 sữa có chứa sữa đầu hay sữa bị vi khuẩn lên men Để xác định pH sữa, sử dụng chất thị màu có khoảng chuyển màu phù hợp với pH thay đổi sữa, chất hay dùng là: Chất thị màu 7 Xanh methylen Màu vàng Màu xanh mạ Màu xanh Phenol Red Màu vàng gạch Màu đỏ vàng Màu đỏ thẩm b Dựa vào phương pháp thử cồn (ethanol 68%) Theo Chung Anh Dũng (2007), tỷ lệ sữa: cồn 1:1, cho ml sữa vào ống nghiệm khô, cho ml cồn, đảo nhẹ, quan sát cục vón dọc theo thành ống nghiệm, yêu cầu phải đảm bảo chất lượng nồng độ cồn đủ tiêu chuẩn (cồn ethanol 68% = 68 ml cồn ethanol 96% + 28 ml nước cất) Nếu thấy sữa bị kết tủa, đông vón lợn cợn dọc theo thành ống nghiệm  nghi ngờ viêm vú c Dựa vào thời gian màu thuốc thử xanh methylen Mẫu sữa thử nghiệm điều kiện vô trùng, cho vào ống nghiệm 10 ml sữa, cho thêm vào 1ml blue methylen 5%, nút ống lại, lắc nhẹ cho dung dịch trộn sau đem ủ ấm 370C, quan sát đổi màu đọc kết (Chung Anh Dũng, 2007) Kết luận Ngày việc chẩn đoán bệnh thú y ngồi phương pháp thơng thường cịn có tiến khoa học ngành công nghệ sinh học đem lại hiệu cao Có nhiều ứng dụng kỹ thuật sinh học chẩn đốn bệnh bị sữa với độ xác cao, cụ thể: - Bệnh BLAD dùng kỹ thuật PCR, kỹ thuật lai phân tử Southern blot để phát gene đột biến gây bệnh - Bệnh viêm vú tiềm ẩn dùng phương pháp CMT, thử cồn, thử methylen, đo độ pH, máy kiểm tra viêm vú, máy đếm tế bào soma kỹ thuật ELISA 196 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Thị Dân, 2005 Công nghệ sinh học chăn nuôi gia súc Nhà xuất Nơng Nghiệp TP Hồ Chí Minh Chung Anh Dũng, 2007 Quy trình chẩn đốn, phịng trị bệnh viêm vú bò sữa Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam Nguyễn Ngọc Hải, 2007 Công nghệ sinh học thú y Nhà xuất nơng nghiệp Tp HCM Bùi Minh Trí, 2006 Bài giảng cao học môn sinh học phân tử Phạm Hùng Vân, 2009 PCR real-time PCR vấn đề áp dụng thường gặp Nhà xuất Y học, chi nhánh Tp HCM 3-33 Tiếng nước Bourry A and Poutrel B., 1996 Bovine Mastitis Caused by Listeria monocytogenees: Kinetics of Antibody Responses in Serum and Milk After Experimental Infection Charlier J., Duchateau L., Vangroenweghe F., Claerebout E., Burvenich C et Vercruysse J., 2005 The effect of an experimentally induced acute mastitis on the test results of an Ostertagia ostertagi milk ELISA 136(2):161-5 Mellenberger R., 2001 California Mastitis Test (CMT) An Invaluable Tool for Managing Mastitis Ribeiro L A., Baron E E., Martinez M L and Coutinho L L., 2000 PCR screening and allele frequency estimation of bovine leukocyte adhesion defiency in Holstein and Gir cattle in Brazil Geneetics and Molecular Biology, 23, 4, 831-834 10 Ruegg P L et Reinemann D J., 2002 Milk Quality and Mastitis Tests University of Wisconsin, Madison 11 Varatanovic N., Podzo M., Mutevelic T., Podzo K., Cengic B., Hodzic A et Hodzic E., 2010 Use of caifornia mastitis test, somatic cells count and bacteriological findings in diagnostics of subclinical mastitis Biotechnology in Animal Husbandry 26 (1-2), p 65-74 Trang web http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=1194 http://www.tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/ELISA http://www.meds.queensu.ca/qcri/flow/cri-fc-getstarted.htm http://www.dgz.be/ondersteuning/programmas_runderen/gezonmelk_cmt.asp http://www.ias-cnsh.org/TrangCh%e1%bb%a7/tabid/36/EntryID/11/Default.aspx http://www.meds.queensu.ca/qcri/flow/cri-fc-getstarted.htm 197 ... sử dụng tế bào chủ động vật Các loại tế bào chủ động vật bao gồm:  Tế bào thận khỉ xanh châu Phi  Tế bào thận chuột đồng nhỏ  Tế bào thận phôi người  Tế bào tử cung chuột bạch  Tế bào côn... tác di truyền, cơng nghệ di truyền Tuy nhiên, người ta dùng tế bào thực vật nuôi cấy môi trường thích hợp dùng làm tế bào chủ  Các tế bào chủ động vật 18 Các tế bào động vật nuôi phức tạp, điều... dần tế bào già bên bong ra, tế bào sừng (chứa nhiều sừng) Tế bào sừng tế bào có nguồn gốc từ ngoại phơi bì phân bố khắp biểu bì (chiếm 95% tổng số tế bào lớp biểu bì), có hoạt động phân bào tế bào