Phân lập và xác định độc tố vi khuẩn clostridium botulinum gây bệnh ngộ độc thịt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI - LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ VI KHUẨN CLOSTRIDIUM BOTULINUM GÂY BỆNH NGỘ ĐỘC THỊT LÊ THỊ TRANG HÀ NỘI - 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI - LUẬN VĂN THẠC SĨ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ VI KHUẨN CLOSTRIDIUM BOTULINUM GÂY BỆNH NGỘ ĐỘC THỊT LÊ THỊ TRANG CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 8420201 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS Nguyễn Thùy Trâm HÀ NỘI - 2022 TS Lê Huy Hồng LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực đề tài, em nhận nhiều giúp đỡ, tạo điều kiện thầy cô giáo Trường Đại học Mở Hà Nội, nhà khoa học Viện vệ sinh dịch tễ trung ương Em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào thầy cô Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở Hà Nội giảng dạy cho em kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập hoàn thành luận văn Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thùy Trâm, TS Lê Huy Hoàng, người thầy trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho em suốt q trình nghiên cứu để hồn thành luận văn Em xin gửi lời cảm ơn tới Lãnh đạo Viện vệ sinh dịch tễ trung ương, Lãnh đạo khoa Vi khuẩn anh chị phịng thí nghiệm Vi khuẩn kỵ khí, ln tạo điều kiện, chia sẻ giúp đỡ em trình thực luận văn Nghiên cứu sử dụng kinh phí đề tài “Nghiên cứu sản xuất kit LAMP phát nhanh gen độc tố Clostridium botulinum gây bệnh ngộ độc thịt", mã số đề tài 02/2021 ĐX Em xin trân trọng cảm ơn chủ nhiệm đề tài Cuối em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, đồng nghiệp, quan quan tâm, động viên, nhiệt tình giúp đỡ em trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng Lê Thị Trang năm 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi Lê Thị Trang, học viên Cao học khóa 2019-2021 Trường Đại học mở Hà Nội, chuyên ngành công nghệ sinh học, xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn Thầy: TS Nguyễn Thùy Trâm, TS Lê Huy Hồng Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng Ngƣời viết cam đoan Lê Thị Trang năm 2021 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh ngộ độc thịt 1.1.1 Nguồn gốc đặc điểm bệnh ngộ thịt 1.1.2 Các dạng bệnh ngộ độc thịt 1.1.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh ngộ độc thịt 1.2 Tổng quan vi khuẩn C botulinum 11 1.2.1 Đặc điểm chung vi khuẩn C botulinum 11 1.2.2 Sự phân bố vi khuẩn C botulinum 13 1.2.3 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn C botulinum 15 1.2.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn C botulinum giới 17 1.2.5 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn C botulinum Việt Nam 17 CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 19 2.1.1 Đối tượng nghiên cúu 19 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 19 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 19 2.2 Vật liệu- dụng cụ hóa chất dùng nghiên cứu 19 2.2.1 Trang thiết bị, dụng cụ 19 2.2.2 Vật tư tiêu hao 20 2.2.3 Hóa chất, sinh phẩm 20 Hóa chất sinh phẩm dùng cho nuôi cấy phân lập 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu: 22 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 22 Nghiên cứu mô tả thực nghiệm mô tả cắt ngang 22 2.3.2 Các kỹ thuật nghiên cứu 22 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ 36 3.1 Kết thu thập loại mẫu 36 3.2 Kết xác định tính chất sinh vật hóa học C botulinum kit API 20A 38 3.3 Kết xác định gen độc tố kỹ thuật PCR 40 3.5 Kết giải trình gen 45 CHƢƠNG IV: BÀN LUẬN 50 KẾT LUẬN 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Viết đầy đủ tiếng anh Viết giải nghĩa tiếng việt bp Base pair Đơn vị đo chiều dài phân tử DNA CDC Centers for Disease Control and Prevention Trung tâm kiểm sốt phịng ngừa bệnh dịch API Analytical Profile Index Hồ sơ định danh vi khuẩn ATCC American Type Culture Collection Bộ chủng chuẩn Mỹ An toàn sinh học ATSH BHI Brain Heart Infusion Canh thang não tim BoNT Botulinum Neurotoxin Độc tố thần kinh botulinum C botulinum Clostridium botulinum Vi khuẩn Clostridium botulinum CBI Clostridium botulinum isolation Môi trường phân lập C botulinum CMM Cooked Meat Medium Môi trường thịt băm EYA Egg York Agar Thạch trứng nhuyễn EYE Egg York Emulsion Lịng đỏ trứng nhuyễn GAM Gifu Anaerobic Medium Mơi trường ni cấy kỵ khí PFGE Pulsed- Field Gel Electrophoresis Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN TPGY Trypticase Peptone Glucose Yeast extract medium Mơi trường TPGY Vi khuẩn kỵ khí VKKK WHO Điện di xung trường World Health Orgnization Tổ chức Y tế giới DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cơ chế dẫn truyền thần kinh khe synap chế cắt đứt dẫn truyền thần kinh botulin Hình 2: Mơ hình chuỗi nặng chuỗi nhẹ độc tố bolulinum Hình 3: Hình ảnh nhuộm Gram vi khuẩn C botulinum 12 Hình 4: Hình ảnh khuẩn lạc thạch C botulinum EYA 13 Hình 5: Phản ứng sinh vật hóa học 28 Hình 6: Sắp xếp index N S theo thứ tự giá 31 Hình 7: Đoạn ngắn DNA sau gắn index adapter 32 Hình 8: Hình ảnh tạo cluster giải trình tự read 34 Hình 9: Quá trình giải trình tự máy Miseq 35 Hình 10: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR phát gen độc tố B C botulinum 41 Hình 11: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR phát gen độc tố A C botulinum 41 Hình 12: Hình ảnh khuẩn lạc chủng Cbt3F01 thạch máu 43 Hình 13: Hình ảnh khuẩn lạc chủng Cbt3F01 thạch GAM 43 Hình 14: Hình ảnh khuẩn lạc chủng Cbt3F01 thạch Brucella 44 Hình 15: Hình ảnh nhuộm gram chủng Cbt3F01 44 Hình 16: Hình ảnh khuẩn lạc chủng Cbt3F01 thạch EYA 45 Hình 17: Cây phả hệ chủng Cbt3F01 so với chủng C botulinum nhóm I, II, III 47 Hình 18: Cây phả hệ chủng Cbt3F01 so với chủng C tobulinum nhóm I 48 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Báo cáo ca bệnh ngộ độc thịt từ năm 2008 – 2017 Mỹ Bảng Thành phần phản ứng PCR…………………………………… 29 Bảng 1.Tổng số mẫu loại thu thập……………………………… 36 Bảng Nguồn gốc mẫu mật ong 36 Bảng 3 Nguồn gốc mẫu đất 37 Bảng Các loại mẫu đồ hộp 37 Bảng Tỉ lệ phân lập C botulinum từ loại mẫu 42 Bảng Kết định danh chủng C botulinum kit API 20A 38 Bảng Kết xác định loại độc tố phương pháp PCR 40 MỞ ĐẦU Nha bào vi khuẩn Clostridium botulinum (C botulinum) có mật ong, đất nguồn lây nhiễm vi khuẩn vào thực phẩm gây bệnh ngộ độc thịt Nhiều nước giới (Mỹ, Nhật, Đức, Braxin, Thái Lan) có báo cáo hàng năm số liệu ca bệnh ngộ độc thịt Trung bình năm Mỹ có 70-100 trường hợp ngộ độc thịt báo cáo, số khoảng 25% ca bệnh ngộ độc thịt thực phẩm 72% ca bệnh ngộ độc thịt trẻ sơ sinh [42,45] Từ năm 1976 đến nay, 1500 ca bệnh ngộ độc thịt trẻ em báo cáo 15 quốc gia Tuy nhiên Việt Nam có chùm ca bệnh báo cáo gần vào tháng 9/2020 Hà Nội tháng 3/2021 ngộ độc pate chay Điều thiếu quan tâm bác sĩ lâm sàng nhà nghiên cứu vi sinh học Thêm vào đó, vi khuẩn C botulinum vi khuẩn kỵ khí tuyệt đối, khó ni cấy phân lập Vi khuẩn sinh độc tố thần kinh xem độc tố mạnh xếp vào danh sách tác nhân nguy hiểm nhóm A bị nghi ngờ sử dụng làm vũ khí sinh học nên lại khó khăn việc đặt mua chia sẻ chủng vi khuẩn từ hãng hay tổ chức nghiên cứu quốc tế Các sở nghiên cứu, bệnh viện, trường học khơng có chứng dương để tiến hành nghiên cứu, xét nghiệm chẩn đốn vi khuẩn này, nghiên cứu bệnh ngộ độc thịt Việt Nam bị quên lãng Bộ Y tế Việt Nam có ban hành tiêu chuẩn việt nam (TCVN) liên quan đến chẩn đoán vi khuẩn độ tố vi khuẩn C botulinum kỹ thuật PCR Elisa [4,5,6] thực tế khơng có chứng dương để xác nhận phương pháp Dựa vào tình hình thực tiễn trên, tiến hành thực đề tài “Phân lập xác định độc tố vi khuẩn C botulinum gây bệnh ngộ độc thịt” với mục tiêu nghiên cứu sau: Nuôi cấy phân lập chủng vi khuẩn kỵ khí C botulinum từ mẫu mơi trường thực phẩm Xác định độc tố C botulinum kĩ thuật PCR giải trình tự gen Hình 18: Cây phả hệ chủng Cbt3F01 so với chủng C tobulinum nhóm I Kết phân tích cho thấy chủng Cbt3F01 vi khuẩn C botulinum, sequence type ST15, chiều dài chromosome chủng Cbt3F01 3822371bp Chủng có mối quan hệ gần gũi với chủng C botulinum NCTC 2916; ATCC 3502 ATCC 19397 (hình 17, 18) Dữ liệu giải trình tự tồn hệ gen vi khuẩn chủng Cbt3F01 upload lên ngân hàng gen đường link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA762208 Mã xác định chủng genbank PRJNA762208 Các thông tin mô tả gồm: SRX12130100 - WGS C.botulinum isolated from home-canned food ILLUMINA (Illumina MiSeq) run: 1.1M spots, 255.1M bases, 142.8Mb downloads Design: DNA from the Cbt3F01 strain was extracted from overnight culture using DNeasy Blood and Tissue Kit Whole-genome sequencing using the NEBNext Ultra DNA Library Prep kit for Illumina (New England Biolabs) was performed using the MiSeq machine Submitted by: National Institute of Hygiene and Epidemiology Study: Botulism food poisoning in Vietnam 48 PRJNA762208 • SRP336489 • All experiments • All runs show Abstract Sample: Vegeterian Pate (food) SAMN21380365 • SRS10110219 • All experiments • All runs Organism: Clostridium botulinum Library: Name: C.botulinum_run2 Instrument: Illumina MiSeq Strategy: WGS Source: GENOMIC Selection: size fractionation Layout: PAIRED 49 CHƢƠNG IV: BÀN LUẬN Trung bình năm Hoa Kỳ có 70-100 trường hợp ngộ độc thịt báo cáo Khoảng 25% trường hợp bị ngộ độc thịt thực phẩm 72% bị ngộ độc thịt đường ruột trẻ sơ sinh [41, 44 Từ năm 1976, 1500 ca bệnh ngộ độc thịt trẻ em báo cáo 15 quốc gia Trong số nguồn tiềm ẩn nha bào C botulinum khác bùn đất, cát mật ong nguồn thực phẩm liên quan tới bệnh ngộ độc thịt Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh nha bào C botulinum có mặt tự nhiên số mẫu mật ong [37, 38, 40 Các nghiên cứu giới báo cáo tỉ lệ phát nha bào C botulinum mật ong khác khoảng từ 1,3-30,6% tùy địa điểm thực quy mô nghiên cứu [7, 22, 28, 38, 40, 41 Nhìn chung, kết cho thấy nồng độ nha bào mẫu mật ong thấp (1 nha bào/gam) Một số mẫu có nồng độ cao (36-60 nha bào/gam) vi khuẩn nhân lên xác ong tổ ong [7, 27 Các nghiên cứu rằng, mức độ nhiễm nha bào C botulinum phụ thuộc vào vùng thu hoạch tình trạng vệ sinh trình thu hoạch mật ong [7, 28 Hầu hết yếu tố ảnh hưởng đến có mặt nha bào C botulinum là: kích thước thùng chiết, khơng thay ủng từ ngồi vào phịng tách chiết, điều kiện nơi rửa tay phòng chiết có mặt C botulinum mẫu đất [27 Trong nghiên cứu chúng tôi, với tổng số 129 mẫu mật ong thu thập được, chủ yếu từ nguồn gia đình mua siêu thị, có 10 mẫu (chiếm 7,8%) mua trực tiếp từ trại ni ong chi phí thu thập mẫu trang trại ni ong cao, khó tiếp cận chủ trang trại việc tìm hiểu xác định yếu tố ảnh hưởng đến diện nha bào khơng khả thi Trong q trình ni cấy phân lập C botulinum, tất mẫu phải thực quy trình ni cấy (1 mẫu gốc mẫu sau làm giàu ủ kỵ khí nhiệt độ phòng 25-260C; mẫu gốc mẫu sau làm giàu tủ kỵ khí 370C) nên tốn cơng sức ngun vật liệu, mẫu có C botulinum nhóm I nhóm II, nhóm I sinh trưởng tốt nhiệt độ 370C nhóm II lại sinh trưởng tốt nhiệt độ 250C Nghiên cứu sử dụng môi trường EYA để phân lập C botulinum từ mẫu mật ong Hầu hết mẫu mật ong cấy EYA âm tính vi khuẩn, 50 số mẫu mọc vi khuẩn khác, lipase âm tính, khuẩn lạc mềm Có mẫu có khuẩn lạc thơ ráp, mọc lan, lipase dương Tuy nhiên kết PCR xác định gen sinh độc tố mẫu với mồi đặc hiệu gen độc tố A, B, C, D, E, F cho kết âm tính Khuẩn lạc mẫu mật ong mã CHB 39 CHB 175 có phản ứng lipase dương tính mơi trường EYA hình thái khuẩn lạc mọc lan, thô ráp, bờ không giống C botulinum Kết định danh xác định tính chất sinh vật hóa học có độ tin cậy từ 75 – 95% kết PCR mẫu lại âm tính với gen độc tố A, B, C, D, E, F Kết nghiên cúu không phân lập chủng C botulinum mang gen sinh độc tố từ mẫu mật ong Tuy nhiên đề tài kiểm chứng quy trình ni cấy cách trộn nồng độ khác vi khuẩn C botulinum độc tố B phân lập từ bùn đất vào mẫu mật ong âm tính tiến hành ni cấy Quy trình thành công phát C botulinum nồng độ 103 cfu/ml Điều chứng tỏ quy trình phân lập C botulinum từ mẫu mật ong mà đề tài áp dụng đạt yêu cầu Nhiều nghiên cứu giới hai nguồn nha bào C botulinum tiềm ẩn quan trọng mật ong bùn đất Sự tích tụ C botulinum đất đào thải nha bào vi khuẩn từ đường tiêu hóa người, động vật, chim cá Lịch sử nghiên cứu giám sát khẳng định diện C botulinum phổ biến đất với tỉ lệ phân lập khác dao động từ 9,6-23,5% tùy vùng địa lí [10, 12, 21, 30, 37 C botulinum thường tìm thấy phổ biến mẫu đất cặn bùn Một vài nghiên cứu giám sát đất Mĩ nhằm phát C botulinum độc tố A, B, C, D E cho thấy C botulinum độc tố A tìm thấy chủ yếu phía tây sơng Mississippi độc tố B phổ biến phía Đơng Chủng độc tố F lại phân lập từ cặn biển Pacific từ cua vịnh Chesapeake Ngồi ra, có mối liên hệ chặt chẽ phân bố loại độc tố C botulinum độc tố gây bệnh ngộ độc thịt trẻ sơ sinh Ở Mĩ, ngộ độc thịt trẻ sơ sinh type A tìm thấy chủ yếu phía Tây sông Mississippi, ca bệnh mang type B lại phổ biến phía Đơng Ví dụ tỉ lệ ngộ độc thịt trẻ sơ sinh type B cao vùng Đông Nam Pennsylvania (43/44 ca) [37] 51 Một số nghiên cứu nước phân lập vi khuẩn C botulinum từ mẫu bùn đất quanh khu vực chăn nuôi vịt Cần Thơ [1, Tuy nhiên, nghiên cứu phân bố vi khuẩn C botulinum đất Việt Nam chưa có số liệu nhóm nghiên cứu lựa chọn ngẫu nhiên tỉnh thành phía Bắc để thu thập mẫu bùn đất Chúng chọn vùng đất ẩm ướt, giàu chất hữu cơ, gần khu chăn nuôi quy mơ lớn vị trí có khả phân lập C botulinum để thu thập mẫu Cũng mẫu mật ong đồ hộp, xử lí mẫu đất, mẫu lặp lại nhiệt độ ủ (nhiệt độ phòng 370C) Khi nuôi cấy mẫu đất, đề tài sử dụng môi trường chọn lọc CBI với bước sốc cồn mẫu trước nuôi cấy để diệt vi khuẩn không sinh nha bào, ưu tiên cho nha bào C botulinum sinh trưởng Chúng phân lập chủng C botulinum mang gen độc tố B, chủng từ mẫu bùn đất Bắc Giang (mã số chủng CBGS 01 CBGS 02) Hai chủng có khuẩn lạc điển hình C botulinum, đường kính mm, bờ khơng đều, dính, xám nhẹ mọc lan, Catalase âm tính, phản ứng lipase dương tính, tạo bề mặt óng ánh ngọc trai nghiêng đĩa thạch Các kết định danh chủng C botulinum tương tự nghiên cứu khác báo cáo [13 Môi trường bùn đất đủ độ ẩm, kỵ khí giàu dinh dưỡng C botulinum dễ dàng phát triển, chúng tơi phân lập chủng từ bùn đất mà không phân lập chủng từ mẫu đất khô Nghiên cứu Cần Thơ cho thấy phân lập chủng C botulinum độc tố E từ mẫu ruột vịt bùn nơi chăn thả vịt, nhiên kết đề tài phân lập chủng C botulinum độc tố B từ mẫu bùn đất ruộng rau Bắc Giang Việc phân lập chủng C botulinum Bắc Giang vùng chăn nuôi quy mô lớn miền Bắc việc tái sử dụng chất thải người, vật nuôi trồng trọt địa phương phổ biến Trong giai đoạn tới, nhóm nghiên cứu xem xét thu thập thêm mẫu đất trang trại nuôi vịt miền Bắc để phân lập thêm chủng C botulinum Ngộ độc thịt lây qua thực phẩm dạng ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng ăn phải thức ăn chứa độc tố thần kinh tạo trình sinh trưởng C botulinum Những thực phẩm hút chân không bảo quản lâu dài (đồ hộp, xúc xích, thịt hun khói) điều kiện lí tưởng cho nha bào vi khuẩn kỵ khí phát triển Việc phát 52 vi khuẩn mẫu môi trường mẫu thực phẩm thực phẩm tươi sống phức tạp có mặt nhiều loại nha bào khác và/hoặc độc tố chưa xác định Hơn nữa, việc phân lập vi khuẩn C botulinum mẫu môi trường mẫu thực phẩm gặp nhiều hạn chế có mặt chủng khơng sinh độc tố kiểu hình kiểu gen giống C botulinum Khơng có quy trình, môi trường nhiệt độ ủ tốt cho vi khuẩn C botulinum sinh loại độc tố khác Thông thường, sử dụng CMM ủ 370C môi trường làm giàu cho C botulinum li giải protein, cịn mơi trường làm giàu cho C botulinum không li giải protein CMM bổ sung glucose, môi trường thịt băm tinh bột glucose TPGY ủ 260C Việc cần thiết bổ sung lysozym (nồng độ µg/ml tinh bột (0,1%) vào mơi trường làm giàu khuyến cáo để kích thích nảy mầm nha bào C botulinum Chúng thực theo hướng dẫn phân lập chủng C botulinum mang gen độc tố A, B từ hộp pate Minh Chay (1 hộp bệnh nhân Hà Nội hộp bệnh nhân Hà Giang) Đây chùm ca bệnh ngộ độc thịt Việt Nam ăn sản phẩm pate chay Công ty TNHH Hai thành viên Lối sống Minh Chay Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn C botulinum khó khăn Cho đến chưa có sẵn mơi trường chọn lọc cho C botulinum li giải protein không li giải protein [7, 8,41 Khó khăn nảy sinh từ đặc điểm sinh lí học khác chủng C botulinum nhóm I II việc lựa chọn xác nhiệt độ ủ Nhiệt độ tối ưu cho nhóm I sinh trưởng 35-370C, nhiệt độ tối ưu cho nhóm II sinh trưởng 25-300C Ni cấy phân lập định danh C botulinum từ mẫu có hệ vi khuẩn chí cạnh tranh mức cao mẫu đất nhiều thời gian công sức Hơn việc phân lập chủng từ canh thang dễ bị thất bại khơng thu chủng Chính vậy, chúng tơi lựa chọn nhiệt độ ủ để tối ưu sinh trưởng cho nhóm C botulinum Bên cạnh đó, nhằm hạn chế cạnh tranh vi sinh vật khác, sử dụng phương pháp sốc cồn nhiệt độ trước sau nuôi cấy tăng sinh Ngồi ra, chúng tơi thử nghiệm loại môi trường làm giàu phổ biến canh thang BHI CMM cho kết tương đồng 53 Kết định danh kit API 20A so sánh chủng C botulinum chủng giống C botulinum gen sinh độc tố cho thấy độ tương đồng phản ứng sinh hóa cao Hơn phiên giả kết ApiWeb cho thấy chủng giống C botulinum phân lập từ mật ong mã CHB 39 định danh chủng giống C botulinum với độ tin cậy cao (ID 97,1%) chủng C botulinum mang gen sinh độc tố phân lập từ pate (Cbt3F1, ID 96,5%) (bảng 3.6) Như vậy, sử dụng đặc tính sinh vật hóa học khơng đủ để phân biệt chủng C botulinum chủng giống C botulinum Điều khẳng định nghiên cứu Lindström M cộng cho thấy chưa đến nửa số chủng chứa gen xác định độc tố đặc hiệu C botulinum đặc tính sinh vật hóa học tương tự tất chủng phân tích Nghiên cứu báo cáo chủng C botulinum AB khơng thể đặc tính sinh hóa điển hình loài sổ tay hệ thống Vi khuẩn học Tuy nhiên kết cho thấy chủng C botulinum Cbt3F1 Cbt21F18 mang gen độc tố A, B có đặc tính sinh hóa tương tự chủng C botulinum CBGS 01 CBGS 02 mang gen độc tố B Kết đề tài phù hợp với nghiên cứu Lindström M cộng nhằm xác định đặc tính kiểu hình kiểu gen chủng phân loại ban đầu C botulinum, tác giả khẳng định kit API 20A không phân biệt chủng C botulinum li giải protein C sporogenes [26] So sánh chủng C botulinum chủng giống C botulinum cho thấy độ tương đồng phản ứng sinh hóa cao Đặc tính sinh vật hóa học khơng đủ để phân biệt chủng C botulinum chủng giống C botulinum khẳng định tác giả khác [26, 39 Tác giả khuyến cáo phân loại kiểu gen hiệu sử dụng SmaI PFGE phân loại xác C botulinum chủng giống C botulinum phân loại độc tố C botulinum Vì vậy, chúng tơi tiến hành giải trình đoạn gen độc tố giải trình tự tồn hệ gen vi khuẩn chủng đại diện mang gen sinh độc tố A B Kết so sánh trình tự thu với chủng C botulinum ATCC 25763 (ID: EF028391.1); Chủng C botulinum ATCC 19397 (ID: CP000726.1) nhiều chủng khác ngân hàng genbank cho độ xác Identities từ 99.86 100% Trình tự gen độc tố B so sánh với chủng C botulinum CDC 69094 54 (ID: CP013246.1); Chủng C botulinum CDC28184 (ID: FJ981690.1) nhiều chủng khác ngân hàng genbank cho độ xác từ 98.57 - 100% Như từ kết kĩ thuật giải trình tự tồn hệ gen vi khuẩn, chúng tơi khẳng định chủng Cbt3F01 phân lập từ đề tài chủng C botulinum, sử dụng làm chứng dương cho kỹ thuật khác Các chủng C botulinum độc tố A, B phân lập từ đề tài nguồn gen quý cho nghiên cứu đặc điểm hệ gen C botulinum, cập nhật kĩ thuật chẩn đoán liệu pháp điều trị bệnh ngộ độc thịt Kết chung nghiên cứu cho thấy, nghiên cứu xác định gen độc tố B chủng C botulinum phân lập từ mẫu bùn đất gen độc tố A, B chủng phân lập từ pate kỹ thuật PCR Chứng tỏ quy trình PCR mà nghiên cứu tham khảo từ tài liệu Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11395:2016 phù hợp sử dụng để phát gen sinh độc A, B vi khuẩn C botulinum Nồng độ, thành phần phản ứng PCR, trình tự mồi, chu trình nhiệt sử dụng phần phương pháp vật liệu nghiên cứu phù hợp ứng dụng Nghiên cứu khơng phân lập chủng mang gen sinh độc tố C, D, E, F nên chưa kiểm chứng quy trình PCR mà nghiên cứu tham khảo từ tài liệu Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11395:2016 có phù hợp sử dụng để phát gen sinh độc C, D, E, F vi khuẩn C botulinum hay không Phương pháp xác định độc tố vi khuẩn C botulinum thực kỹ thuật Elisa thử nghiệm động vật, đồng thời phải có kháng huyết chứng dương để đối chứng Mục tiêu nghiên cứu phân lập chủng C botulinum mang gen sinh độc tố để sử dụng làm chứng dương cho nghiên cứu để sản xuất kháng huyết cần phải có thêm nhiều nghiên cứu xác định loại độc tố vi khuẩn C botulinum Nên nội dung đề tài dừng lại bước xác định gen sinh độc tố vi khuẩn C botulinum mà chưa thực việc xác định độc tố vi khuẩn C botulinum tên đề tài 55 Kết nghiên cứu ghi nhận nhà khoa học ngồi nước thơng qua báo khoa học đăng tạp chí chuyên ngành nước quốc tế Bài báo “Phát Clostridium botulinum mật ong, đất thực phẩm đóng hộp tự chế biến số tỉnh Miền Bắc Việt Nam năm 2019 – 2020” đăng tạp chí Y học dự phòng báo: “First report of foodborne botulism due to Clostridium botulinum type A(B) from vegetarian home-canned pate in Hanoi, Vietnam” đăng tạp chí quốc tế Anaerobe 56 KẾT LUẬN Bằng kỹ thuật giải trình tự toàn hệ gen vi khuẩn, đề tài định danh xác định chủng Cbt3F01 vi khuẩn C botulinum nhóm I (nhóm ly giải protein) sequence type ST15, chiều dài chromosome 3822371bp Chủng Cbt3F01 sau sử dụng làm chứng dương để khẳng định lại kết nghiên cứu Nghiên cứu nuôi cấy phân lập thành công chủng C botulinum, bao gồm chủng C botulinum CBGS01 CBGS02 mang gen độc tố B từ mẫu bùn đất, chủng C botulinum Cbt0F01 Cbt21F18 mang đồng thời gen độc tố A, B từ mẫu thực phẩm pate Minh Chay, chủng giống C botulinum CHB 39 CHB 175 không mang gen độc tố (C botulinum- like strain) từ mật ong Các chủng C botulinum mang gen sinh độc tố A, B phân lập từ đề tài nguồn gen quý cho nghiên cứu đặc điểm hệ gen C botulinum, cập nhật kĩ thuật chẩn đoán liệu pháp điều trị bệnh ngộ độc thịt Nghiên cứu chưa phân lập sưu tập chủng có đầy đủ loại gen sinh độc tố đề tài phân lập chủng C botulinum mang gen sinh độc tố A, B gây bệnh người động vật Đây nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán bệnh ngộ độc thịt Đề tài định danh xác định chủng C botulinum phân lập mang gen sinh độc tố chưa thực kỹ thuật xác định độc tố vi khuẩn C botulinum 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Đức Hiền Phạm Mạnh Hùng, 2012 Độc tính tính gây bệnh vịt độc tố vi khuẩn (Clostridium botulinum) phân lập thành phố Cần Thơ.Tạp chí Khoa học 2012:22c 40-46, Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Đức Hiền, 2012 Phân lập xác định tính nhạy cảm kháng sinh vi khuẩn (Clostridium botulinum) từ vịt môi trường chăn thả thành phố Cần Thơ Tạp chí Khoa học 2012:22c 64-71, Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Văn Tuấn, 2008 Phương pháp ước tính cỡ mẫu, Y Học Thực Chứng Nhà xuất Y học 2008 Trang 75-106 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9049: 2012 Thực phẩm – Xác định Clostridium Botulinum độc tố chúng phương pháp vi sinh TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN11135:2015 Vi Sinh Vật Trong Thực Phẩm – Phát Hiện Độc Tố Thần Kinh Botulinum Typ A, B, E Và F Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 11395:2016 ISO/TS 17919:2013 Vi sinh vật chuỗi thực phẩm- Phản ứng chuỗi Polymerase (PCR) để phát vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm- Phát Clostridia sinh độc tố thần kinh Botulinum typ A, B, E F TÀI LIỆU TIẾNG ANH Vu Thi Lam An, 2006 Incidence of Clostridium botulinum Spores in Honey and Infant Food Samples Collected from Vietnam and Germany PhD thesis Amita Sachdeva, 2010 Detection and Confirmation of Clostridium botulinum in Water Used for Cooling at a Plant Producing Low-Acid Canned Foods A.J Page, C.A Cummins, M Hunt, V.K Wong, S Reuter, M.T Holden, M Fookes, D Falush, J.A Keane, J Parkhill, Roary: rapid large-scale 58 prokaryote pan genome analysis, Bioinformatics 31 (2015) 3691–3693 doi: 10.1093/bioinformatics/btv421 10 Centers for Disease Control and Prevention: National Botulism Surveillance Summary, 2017 https://www.cdc.gov/botulism/surv/2017/index.htm 11 Carolina Lu´quez, 2005, Distribution of Botulinum Toxin-Producing Clostridia in Soils of Argentina APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, July 2005, p 4137–4139 12 Carter, A.T and Peck, M.W, 2015 Genomes, neurotoxins and biology of Clostridium botulinum Group I and Group II Res Microbiol 66(4):303-17 13 Ekaterine Zhorzholiani, 2017 Spread of Clostridium botulinum in the soils of Georgia ISDS 2016 Conference Abstracts 14 Espelund, M and Klaveness, D, 2014 Botulism outbreaks in natural environments - an update Front Microbiol 5:287 15 Fereshteh, 2013 Identification of Botulinum Toxin Type in Clinical Sample and Foods in Iran Arch Iran Med 2013; 16(11): 642 – 646 16 Ferrante, L and Opdal, S.H, 2015 Sudden infant death syndrome and the genetics of inflammation Front Immunol 6:63 17 JAOAC 60, 541(1977); 73, 166(1990) 18 Gelli, D.S., Jakabi, M., Souza, A, 2002 Botulism: a laboratory investigation on biological and food samples from cases and outbreaks in Brazil (1982-2001) Rev Inst Med Trop Sao Paulo 44(6):321-4 19 https://www.fda.gov/food/foodscienceresearch/laboratorymethods/ucm070 879.htm 20 Kongsaengdao, S.; Thai Botulism Study Group 2006 An outbreak of botulism in Thailand: clinical manifestations and management of severe respiratory failure Clin Infect Dis 43(10):1247-56 Epub 2006 Oct 16 59 21 K K Hill, 2007 Genetic Diversity among Botulinum NeurotoxinProducing Clostridial Strains JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Feb 2007, p 818–832 22 Kiyotaka YAMAKAWA, 1988 Distribution of Clostridium botulinum in Japan and in Shinkiang District of China Microbiol Immunol Vol 32 (6), 579-587 23 Kiyotaka YAMAKAWA, Shinichi NAKAMURA, 1992 Prevalence of Clostridium botulinum Type E and Coexistence of C botulinum Nonproteolytic Type B in the River Soil of Japan Immunol Vol 36 (6), 583-591 24 Larry E Davis, MD, 1996 Botulinum Toxin From poison to Medicine West J Med 1993 Jan; 158:25-29 25 LEK TANASUGARN, 1979 Clostridium botulinum in the Gulf of Thailand APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Feb 1979, p 194-197 26 Lindström M and Korkeala H., Identification of Clostridium botulinum with API 20 A, Rapid ID 32 A and RapID ANA II FEMS Immunology and Medical Microbiology 24 (1999) 267-274 27 Lindström, M., Riikka Keto, Annukka Markkula, Mari Nevas, Sebastian Hielm and Hannu Korkeala, 2001 Multiplex PCR Assay for Detection and Identification of Clostridium botulinum Types A, B, E, and F in Food and Fecal Material Appl Environ Microbiol 67(12):5694-9 28 Lindström, M and Korkeala, H., 2006 Laboratory diagnostics of botulism ClinMicrobiol Rev 19(2):298-314 29 Mari Nevas, 2006 Clostridium botulinum in honey production with respect to infant botulism Thesis of PhD 60 30 Michael W Peck and Arnoud HM van Vliet, 2016 Impact of Clostridium botulinum genomic diversity on food safety Current Opinion in Food Science 2016, 10:52–59 31 P Chellapandi, A Prisilla, 2018 Clostridium botulinum type A-virulomegut interactions: A systems biology insight Human Microbiome Journal 7-8: 15-22 32 R Creti, Fenicia, P Aureli, 1990 Occurrence of Clostridium botulinum in the soil of the vicinity of Rome Current Microbiology 20, 317-321 33 Rebagliati, V., Philippi, R., Tornese, M., Paiva, A., Rossi, L., Troncoso, A.2009 Food-borne botulism in Argentina J Infect Dev.Ctries 3(4):250-4 34 Shabaan H Ahmed, 2011 Multiplex PCR for Detection and Genotyping of C botulinum Types A, B, E and F Journal of American Science, 2011;7(10) 35 Stephen S Arnon, 2001, Botulinum Toxin as a Biological Weapon, JAMA 2001;285:1059-1070 36 Sobel, J 2005 Botulism Clin Infect Dis 41(8):1167-73 37 Stephen S Arnon, 2006 CHAPTER 159 – INFANT BOTULISM 38 Suzanne R Kalb, 2006 B, E, and F in serum and stool samples 39 THADDEUS F MIDURA, 1996 Update: Infant Botulism Clinical Microbiology Review, Apr.p.119-125 40 Tomasz Grenda, 2016 Molecular diversity of Clostridium botulinum and phenotypically similar strains 41 Tomasz Grenda, 2018 Clostridium botulinum spores in Polish honey samples J Vet Sci 2018, 19(5), 635-642 42 Van Ermengem E., 1979 Classics in infectious diseases A new anaerobic bacillus and its relation to botulism Rev Infec.t Dis, Jul-Aug;1(4):701-19 61 43 Victoria Rebagliati, 2009 Food-borne botulism in Argentina J Infect Dev Ctries 2009; 3(4):250-254 44 Xin, W., Huang, Y., Ji, B., Li, P., Wu, Y., Liu, J., Wang, X., Yang, H., Kang, L., Gao, S., An, X., Xu, X., Tong, Y., Wang, J 2019 Identification and characterization of Clostridium botulinum strains associated with an infant botulism case in China Anaerobe 55:1-7 45 WHO, 2002 Clostridum botulinum 46 Methods in Biotechnology Food-borne pathogens, Methods and Protocol Edited by Catherine C Adley Humana Press 62 ... nên vi? ??c nuôi cấy phân lập vi khuẩn C botulinum khó khăn Tuy nhiên ca bệnh ngộ độc thịt sơ sinh hay ngộ độc thịt vết thương, phân lập thành công vi khuẩn C botulinum sinh độc tố tiêu chuẩn vàng... ngộ độc thịt Bệnh ngộ độc thịt có dạng phổ biến bệnh ngộ độc thịt lây truyền qua thực phẩm, bệnh ngộ độc thịt trẻ sơ sinh bệnh ngộ độc thịt vết thương [36,37,39] 1.1.2.1 Bệnh ngộ độc thịt lây truyền... độc tố khác Loài Clostridia khác C butyricum sinh độc tố E C baratii sinh độc tố F Bệnh ngộ độc thịt người thường chủng sinh độc tố A, B, E F gây Độc tố A có xu hướng độc độc tố B, E thời gian gây