PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM TỪ THÂN CÂY DÓ BẦU TẠO TRẦM TỰ NHIÊN TẠI KHÁNH HOÀ

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM TỪ THÂN CÂY DÓ BẦU TẠO TRẦM TỰ NHIÊN TẠI KHÁNH HOÀ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM TỪ THÂN CÂY DÓ BẦU TẠO TRẦM TỰ NHIÊN TẠI KHÁNH HOÀ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM TỪ THÂN CÂY DÓ BẦU TẠO TRẦM TỰ NHIÊN TẠI KHÁNH HOÀ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM TỪ THÂN CÂY DÓ BẦU TẠO TRẦM TỰ NHIÊN TẠI KHÁNH HOÀ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM TỪ THÂN CÂY DÓ BẦU TẠO TRẦM TỰ NHIÊN TẠI KHÁNH HOÀ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM TỪ THÂN CÂY DÓ BẦU TẠO TRẦM TỰ NHIÊN TẠI KHÁNH HOÀ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM TỪ THÂN CÂY DÓ BẦU TẠO TRẦM TỰ NHIÊN TẠI KHÁNH HOÀ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM TỪ THÂN CÂY DÓ BẦU TẠO TRẦM TỰ NHIÊN TẠI KHÁNH HOÀ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM TỪ THÂN CÂY DÓ BẦU TẠO TRẦM TỰ NHIÊN TẠI KHÁNH HOÀ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM TỪ THÂN CÂY DÓ BẦU TẠO TRẦM TỰ NHIÊN TẠI KHÁNH HOÀ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM TỪ THÂN CÂY DÓ BẦU TẠO TRẦM TỰ NHIÊN TẠI KHÁNH HOÀ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM TỪ THÂN CÂY DÓ BẦU TẠO TRẦM TỰ NHIÊN TẠI KHÁNH HOÀ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM TỪ THÂN CÂY DÓ BẦU TẠO TRẦM TỰ NHIÊN TẠI KHÁNH HOÀ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM TỪ THÂN CÂY DÓ BẦU TẠO TRẦM TỰ NHIÊN TẠI KHÁNH HOÀ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM TỪ THÂN CÂY DÓ BẦU TẠO TRẦM TỰ NHIÊN TẠI KHÁNH HOÀ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM TỪ THÂN CÂY DÓ BẦU TẠO TRẦM TỰ NHIÊN TẠI KHÁNH HOÀ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM TỪ THÂN CÂY DÓ BẦU TẠO TRẦM TỰ NHIÊN TẠI KHÁNH HOÀ PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM TỪ THÂN CÂY DÓ BẦU TẠO TRẦM TỰ NHIÊN TẠI KHÁNH HOÀ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP - - KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM TỪ THÂN CÂY DÓ BẦU TẠO TRẦM TỰ NHIÊN TẠI KHÁNH HỒ NGÀNH MÃ SỐ : CƠNG NGHỆ SINH HỌC : 7420201 Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực Mã sinh viên Lớp Khoá học : TS Nguyễn Thị Hồng Gấm : Trần Thị Thu Hồng : 1653070344 : 61 – CNSH : 2016 - 2020 Hà Nội, 2020 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp, với tình cảm chân thành, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới trường Đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện cho tơi có mơi trường học tập tốt suốt thời gian học tập, nghiên cứu trường Trước tiên xin gửi lời cảm ơn chân thành tới giáo viên hưỡng dẫn TS Nguyễn Thị Hồng Gấm tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho suốt trình nghiên cứu thực khóa luận tốt nghiệp Đồng thời, tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn tới thầy cô Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp giúp đỡ, tạo điều kiện cho suốt q trình học tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp lần Sau xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè bạn sinh viên lớp K61_CNSH động viên, giúp đỡ hồn thành tốt luận văn tốt nghiệp Vì điều kiện thời gian khả thân hạn chế nên đề tài không tránh khỏi thiếu sót định, tơi mong nhận ý kiến đóng góp q báu thầy giáo bạn để khóa luận tốt nghiệp hồn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 09 tháng năm 2020 Sinh viên thực Trần Thị Thu Hồng i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC ii DANH MỤC KÝ HIỆU TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu Trầm hương (Aquilaria crassna) 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Sự phân bố Trầm hương tự nhiên 1.1.3 Đặc điểm hình thái 1.2 Tổng quan sản phẩm Trầm hương 1.2.1 Phân loại sản phẩm Trầm hương 1.2.2 Khai thác, chế biến bảo quản Trầm hương 11 1.2.3 Thành phần Trầm hương 13 1.2.4 Công dụng Trầm hương 14 1.3 Giới thiệu số chủng nấm cộng sinh Trầm hương 17 1.3.1 Giới thiệu loài nấm Aspergillus 17 1.3.2 Giới thiệu loài nấm Penicillium 18 1.3.3 Giới thiệu loài nấm Fusarium 20 1.4 Một số cơng trình nghiên cứu cấy tạo trầm 21 PHẦN MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 24 2.1.1 Mục tiêu chung 24 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 24 2.2 Nội dung nghiên cứu 24 2.3 Vật liệu nghiên cứu 24 2.4 Phương pháp nghiên cứu 25 2.4.1 Tiến hành xử lý mẫu 25 2.4.2 Chuẩn bị môi trường phân lập 26 2.4.3 Tiến hành cấy mẫu theo dõi 27 ii 2.4.4 Tiến hành cấy chuyển (truyền) 27 2.4.5 Phương pháp định danh nấm 27 2.4.6 Môi trường dinh dưỡng để nhân sinh khối sợi nấm 30 2.4.7 Tiến hành cấy nấm vào môi trường lỏng 30 2.4.8 Tạo công thức phối trộn dòng nấm 31 2.4.9 Thí nghiệm cấy chế phẩm vi sinh vào thân Dó bầu 31 2.5 Phương pháp thu thập xử lý số liệu 32 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Kết phân lập chủng nấm từ Dó bầu 33 3.2 Kết định danh tên loài chủng nấm phân lập 34 3.2.1 Kết sơ định danh thơng qua đặc điểm hình thái nấm 34 3.2.2 Kết định danh tên loài sinh học phân tử 37 3.3 Kết thử nghiệm chế phẩm vi sinh kích thích tạo trầm hương Dó bầu 45 KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 48 Kết luận 48 Tồn 48 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 iii DANH MỤC KÝ HIỆU TỪ VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleic acid NCBI National Centerfor Biotechnology Information ITS internal transcribed spacer PCR Polymerase chain reaction PDA Potato dextrose agar PEC 2- (2-phenylethyl) STT Số thứ tự iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Công thức phối trộn dòng nấm 31 Bảng 3.1: Kết phân lập chủng nấm từ Dó bầu 33 Bảng 3.2: Kết thử nghiệm chế phẩm vi sinh kích thích tạo trầm hương Dó bầu 46 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình thái Trầm hương Hình 1.2: Cây Dó bầu có trầm 10 Hình 1.3: Bộ khung phân tử Sesquiterpenes (A) 13 Hình 1.4: Cấu trúc hóa học hợp chất sesquitoepene thường tồn nhựa trầm hương 14 Hình 1.5: Nấm Aspergillus với khuẩn ty, cọng bào tử, túi thể bình 18 Hình 1.6: Nấm Penicillium với cọng bào tử, đính bào từ, cán, thể bình vẽ, thể bình 19 Hình 1.7: Đính bào tử Fusarium 21 Hình 2.1: Thân Dó bầu có trầm tự nhiên Khánh Hịa 26 Hình 2.2: Đĩa môi trường cấy mẫu (A) mẫu sau ngày nuôi cấy (B) 27 Hình 2.3: Mơi Trường trước cấy chủng nấm (A) sau cấy chủng nấm (B) 31 Hình 2.4: Sơ đồ bố trí lỗ khoan cấy chế phẩm vi sinh thân Dó bầu 32 Hình 3.1: Chủng nấm M4.1a đĩa thạch (A) kính hiển vi (B) 34 Hình 3.2: Chủng nấm M4.3 đĩa thạch (A) kính hiển vi (B) 35 Hình 3.3: Chủng nấm M4.5a đĩa thạch (A) kính hiển vi (B) 36 Hình 3.4: Chủng nấmM4.7 đĩa thạch (A) kính hiển vi (B) 36 Hình 3.5: Chủng nấm M4.13 đĩa thạch (A) kính hiển vi (B) 37 Hình 3.6 Kết so sánh trình tự gen chủng M4.1a BLAST NCBI 38 Hình 3.7: Sơ đồ di truyền chủng M4.1a 38 Hình 3.8: Kết so sánh trình tự gen chủng M4.3 BLAST NCBI 39 Hình 3.9: Sơ đồ di truyền chủng M4.3 39 Hình 3.10: Kết so sánh trình tự gen chủng M4.5a BLAST NCBI 41 Hình 3.11: Sơ đồ di truyền chủng M4.5a 41 Hình 3.12: Kết so sánh trình tự gen chủng M4.7 BLAST NCBI 42 Hình 3.13: Sơ đồ di truyền chủng M4.7 43 Hình 3.14: Kết so sánh trình tự gen chủng M4.13 BLAST NCBI 44 Hình 3.15: Sơ đồ di truyền chủng M4.13 44 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Trầm dó, dó bầu, dó núi (Danh pháp khoa học: Aquilaria crassna) loại thực vật thuộc họ Trầm - Thymelaeaceae Loài phân bố Đông Nam Á đảo New Guinea Trầm hương sinh từ vết thương Dó Bầu Thế nhưng, khơng phải Dó bầu sinh trầm hương Chính vậy, Trầm hương quý lại hết Vết thương từ dó sau đọng nước trời mưa dó bầu tiết chất nhựa tự vệ xung quanh vết thương Thông thường, thân dó có vết trùng đục, người ta hay gọi mắt thân Nhựa tiết thời gian trở nên đậm đặc hơn, mùi thơm hương dĩ nhiên thu hút loài kiến đến ăn, phân tử lồi nấm mà kiến mang đến vơ tình “cấy” vào lớp nhựa Trải qua thời gian dài chịu ảnh hưởng nhiều tác động từ thiên nhiên sinh loại sản phẩm đặc biệt gọi Trầm hương hay Kì nam Trầm hương từ ngàn đời xem vị thuốc quý chữa nhiều bệnh tật Trước hàng vua quan, quý tộc có điều kiện dùng Chính mà Trầm hương có giá trị kinh tế cao thị trường, điều làm cho Dó bầu trở thành lồi thực vật đặc biệt nhiều nhà khoa học người dân ý, có giá trị đặc biệt mặt nghiên cứu khoa học Việt Nam nói riêng nước giới nói chung Trong với rừng nguồn Trầm hương tự nhiên ngày cạn dần Cùng với khai thác mức bừa bãi người làm cho lồi thuộc chi Aquilaria có khả cho Trầm bị cạn kiệt Ở Việt Nam người khai thác Trầm chặt đốn bừa bãi Dó bầu độ tuổi mà thời gian ngắn thuộc họ Trầm gần bị tuyệt chủng Trước tình hình nước ta có nhiều tổ chức, quan, cá nhân trồng Dó bầu đại trà, nhằm mục đích cải thiện kinh tế, phủ xanh đất trống đồi trọc, góp phần xóa đói giảm nghèo v.v… Tuy nhiên, việc tạo trầm ngồi tự nhiên hay biện pháp thủ cơng khả tạo trầm hương hạn chế Với biện pháp học, phương pháp có ưu điểm đơn giản, dễ thực có nhược điểm xác suất thành công thấp Đối với phương pháp dùng hố chất có ưu điểm hiệu quả, tạo nhiều trầm thời gian ngắn, nhược điểm phương pháp sản phẩm cịn dư thừa thành phần hố chất độc hại Cl-, SO42-, NO2 PO4,… ảnh hưởng đến sản phẩm không người tiêu dùng ưa chuộng Phương pháp mang tính khả quan sử dụng chủng nấm có khả kích thích tạo trầm cấy trực tiếp vào thân cây, với ưu điểm tỷ lệ thành công cao không để lại lượng hoá chất độc hại tồn dư sản phẩm Xuất phát từ thực tế trên, hướng dẫn TS Nguyễn Thị Hồng Gấm, thực đề tài khoá luận “Phân lập định danh số chủng nấm từ thân Dó bầu tạo trầm tự nhiên Khánh Hoà” PHẦN TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu Trầm hương (Aquilaria crassna) Cây Trầm hương (Dó bầu) thuộc: Lớp (Class): Magnoliopsida Bộ (Order): Myrtales Họ (Family): Thymelaeaceae Chi Aquilaria có tất 24 lồi (Species) khác Tiến sĩ Lê Công Kiệt (Việt Nam) tiến sĩ Paul Kessler (Hà Lan) vừa phát loài thứ 25 cao nguyên Trung Bộ năm 2005 có tên khoa học Aquilaria rugosa L.C.Kiet & PJ.A Cây Dó bầu thuộc lồi Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte 1.1.1 Phân loại Aquilaria thuộc họ thực vật hạt kín Thymelaeaceae, loài đặc hữu vương quốc Indomalaya Cho đến nay, có tổng cộng 21 lồi Aquilaria ghi nhận 13 số chúng công nhận lồi sản xuất trầm hương Trầm hương (cịn gọi gaharu Đông Nam Á, oud Trung Đông, chen xiang Trung Quốc, jinkoh Nhật Bản agar Ấn Độ) loại gỗ nhựa thơm tối có giá trị cao Ở Việt Nam cách gọi tên tiếng Việt cho loài khác địa phương Ở đảo Phú Quốc người ta chia Dó thành hai lồi khác nhau, Dó nghệ gỗ có màu vàng nhạt cứng cịn Dó bầu gỗ màu trắng mềm Ở tỉnh Miền Trung chia Dó lồi: Dó bầu hương, Dó me, Dó dây Dó bầu thường Ngoài ra, số địa phương khác người ta cịn chia Dó lồi như: Dó bầu, Dó niệt, Dó me, Dó gạch… Với cách phân chia nêu khó xác định tên khoa học loài [1][2] Mặc dù cách phân loại đặt tên nhiều điểm bất đồng, chưa có khoa học, Việt Nam Dó bầu (Tên khoa học: Aquilaria Crassna pierre ex Lecomte) nông dân ưa chuộng nhân giống rộng rãi có khả cho Trầm nhiều chất lượng Trầm tốt Hình 3.3: Chủng nấm M4.5a đĩa thạch (A) kính hiển vi (B) Dựa vào khoá phân loại, so sánh đặc điểm quan sát được, kết luận sơ chủng nấm có kí hiệu M4.4a thuộc chi Aspergillus Muthuraj Sangareswari Nagajothi cộng (2016) phân lập thành công chủng Aspergillus mang đặc điểm tương tự [11] 3.2.1.4 Đặc điểm hình thái chủng M4.7 Hình thái bên ngoài: Sợi nấm màu đen, mọc theo kiểu khuẩn lạc hình trịn Hình thái hiển vi: Sợi nấm có vách ngăn rõ Hình 3.4: Chủng nấm M4.7 đĩa thạch (A) kính hiển vi (B) Dựa vào khoá phân loại, so sánh đặc điểm quan sát được, kết luận sơ chủng nấm có kí hiệu M4.7 thuộc chi: fonsecaea Claudio Guedes Salgado cộng phân lập chủng fonsecaea pedrosoi từ gai Mimosa pudica L với hình thái bên ngồi hiển vi giống chủng M4.7 [12] 36 3.2.1.5 Đặc điểm hình thái chủng M4.13 Hình thái bên ngồi: Sợi nấm có màu trắng Khi già có bào tử xanh bột mịn, mọc từ tâm sau lan dần theo vịng trịn Có tiết sắc tố màu vàng mơi trường Hình thái hiển vi: hệ sợi nấm mang bào tử trần cụm sợi nấm Có vách ngăn hai tế bào Hình 3.5: Chủng nấm M4.13 đĩa thạch (A) kính hiển vi (B) Dựa vào khố phân loại, so sánh đặc điểm quan sát được, kết luận sơ chủng nấm có kí hiệu M4.13 thuộc chi Penicillium Muthuraj Sangareswari Nagajothi cộng (2016) phân lập thành công chủng Penicillium thân Dó bầu với đặc điểm giống chủng M4.13 [11] 3.2.2 Kết định danh tên loài sinh học phân tử 3.2.2.1 Chủng nấm M4.1a Kết giải trình tự gen chủng nấm M4.1a, với 559 nucleotid có trình tự đây: GCGGGGGGGTAGGGACCTCTGGGTCCACCTCCCACCCGTGTTTATTT TACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTTAATGGCCGCCAAGGGGGCT TACGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAATACACCCTCGAACTCTGTCT GAAGATTGAAGTCTGAGTGAAAATATAAATTATTTAAAACTTTCAAC AACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCG ATACGTAATGTGAATTGCAAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAAC GCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGT CATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCCCCGAT 37 CTCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTC CTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCG CTTGCCGATCAACCCAAATTTTTATCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTA GGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA Hình 3.6 Kết so sánh trình tự gen chủng M4.1a BLAST NCBI Xây dựng di truyền: Hình 3.7: Sơ đồ di truyền chủng M4.1a Kết xây dựng tiến hóa, xác định lồi cho thấy chủng M4.1a có quan hệ gần gũi với lồi Penicillium citrinum với mức độ tương đồng 98,82% Năm 2016, Muthuraj Sangareswari Nagajothi cộng phân lập gỗ Trầm hương tự nhiên, thấy diện chủng nấm Aspergillus, Lasiodiploidia, Chaetomium, Fusarium Penicillium[11] Vậy, chủng M4.1a thuộc chi Penicillium 3.2.2.2 Chủng nấm M4.3 38 Kết giải trình tự gen chủng nấm M4.3, với 515 nucleotid có trình tự đây: GGGGGTTTTAACTCCCACCCATGTGGACTTACCTTTTGTTGCCTCGGC AGAAGTTATAGGTCTTCTTATAGCTGCTGCCGGTGGACCATTAAACT CTTGTTATTTTATGTAATCTGAGCGTCTTATTTTAATAAGTCAAAACT TTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGA AATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATC TTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTC GAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTAGCTTAGTGTTGGGAATCTACTT CTTTATAGTTGTAGTTCCTGAAATACAACGGCGGATTTGTAGTATCCT CTGAGCGTAGTAATTTTTTTCTCGCTTTTGTTAGGTGCTATAACTCCC AGCCGCTAAACCCCCAATTTTTTGTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGG AATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA Hình 3.8: Kết so sánh trình tự gen chủng M4.3 BLAST NCBI Xây dựng di truyền: 39 Hình 3.9: Sơ đồ di truyền chủng M4.3 Kết xây dựng tiến hóa, xác định lồi cho thấy chủng M4.3 có quan hệ gần gũi với Pestalotiopsis sp với mức độ tương đồng 99,42% Nutan Kaushik cộng phân lập cộng đồng nấm vi khuẩn cư trú bên thân A malaccensis đất lách, mẫu thu thập từ 21 địa điểm khác bang Assam Đông Bắc Ấn Độ Chi Pestalotiopsis Penicillium thích hợp để kích thích sản xuất gỗ trầm hương nhanh chóng vịng tháng sau thời gian nhiễm bệnh [12] Vậy, chủng M4.3 thuộc chi Pestalotiopsis 3.2.2.3 Chủng nấm M4.5a Kết giải trình tự gen chủng nấm M4.5a, với 571 nucleotid có trình tự đây: CGGAGCATAGTCATTCGATCGAGCCTCCACCCGTGTATACCGTACCT TGTTGCTTCGGCGGGCCCGCGGCGAAGCGTAGCTAAACCAAGCTTTT TATCCACAGTCCCAAGGGTTTTATTATTGAATAGTCAAACTTTCACTG TCTGTCTTTTGTTTCTCGCGTCCATTTGTAACGCAGCCAGATAAAACT TTTAACATGGATTGCCTAGATTCCGGAATCATTGAATATTTGAACGA AATTTGATAATTTTGGTATTTTGCAGAATTCGCTGGATTGAGCGTCCT TTCACCCTCAATCCCCCCCCTTGGTATTCGGGGGATACGCCAGGTCCG ATCGTCATAGTTTCCCTTAAGAACGTATTGTGTGTGGGTTAGGCTTCC CCCCGGGGCCGATTTTGATAGTGGGCGCCACAACTGATTCCGTACCT TGGACGTATGGTCCTGTACCACCCGCCCTTGTACTCCAGCCTGGCGCT GGCCGAAGCAAAAAAGCAACCAACTGTTTCTCCAGGTTGACCTCGGA TCAGGAAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCATTAACGGGGAG GA 40 Hình 3.10: Kết so sánh trình tự gen chủng M4.5a BLAST NCBI Xây dựng di truyền: Hình 3.11: Sơ đồ di truyền chủng M4.5a Kết xây dựng tiến hóa, xác định lồi cho thấy chủng M4.5a có mức độ tương đồng với lồi Aspergillus subramanianii với mức độ tương đồng 74,72% Tian et al (2013) báo cáo diện loài Phomopsis, Botryosphaeria, Aspergillus Colletotrichs Aquilaria bị thương [13] Vậy, chủng M4.5a thuộc chi Aspergillus 3.2.2.4 Chủng nấm M4.7 Kết giải trình tự gen chủng nấm M4.7, với 596 nucleotid có trình tự đây: 41 CATAGGCCGACCTCCACCCTTTGTTTACTAGACCTCAGTTGCTTCGGC AGGTCCGTCTTAATAGAACGCTGGAGGACCGCTCAATGCGGGCGTTG CCTCTGGCCAGTGTCTGCCGATAGCCTAATCTCCTAACTCTGGATCAA TCATGATTTACAATGTCTAAGTGATTTTATTCAATTAAAAGCAAAAA CTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGC GAAATGCGATAAGTAATGCGAATTGCAGAATTCCAGTGAGTCATCGA ATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCGAAGGGCATGCCTG TTCGAGCGTCATTATCACCCCCTCAAGCCCCTGTGCTTGGTGTTGGAC GGCTTGGTGGAGCAAGTTCACACTTTCCACCCCTCCTAAAGACAATG ACGGCGGCCTGCGGAACCCCCGGTACACTGAGCTTCTTAACTGAGCA CGTATCGGATGAAGGGTGCCCGGGACCCGGTCTTCTCCCTCACGGGA ACACTTTTTTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACGCGCT GAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA Hình 3.12: Kết so sánh trình tự gen chủng M4.7 BLAST NCBI Xây dựng di truyền: 42 Hình 3.13: Sơ đồ di truyền chủng M4.7 Kết xây dựng tiến hóa, xác định lồi cho thấy chủng M4.7 có quan hệ gần gũi với loài Fonsecaea monophora với mức độ tương đồng 98,83% Sakon Monggoot (2016) cộng phân lập ba mươi ba chủng nấm nội sinh tiếp tục xác định cấp độ gen dựa đặc điểm hình thái Trong dó, chủng nấm Fonsecaea có khả kích thích tạo trầm hương cho sản phẩm có chất lượng cao [14] Vậy, chủng M4.7 thuộc chi Fonsecaea 3.2.2.5 Chủng nấm M4.13 Kết giải trình tự gen chủng nấm M4.13, với 559 nucleotid có trình tự đây: GCGGGGGGGTAGGGACCTCTGGGTCCACCTCCCACCCGTGTTT ATTTTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTTAATGGCCGCCAAGGG GGCTTACGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAATACACCCTCGAACTCT GTCTGAAGATTGAAGTCTGAGTGAAAATATAAATTATTTAAAACTTT CAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAA TGCGATACGTAATGTGAATTGCAAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTT GAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGA GCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCCC CGATCTCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCC GGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCC GGCGCTTGCCGATCAACCCAAATTTTTATCCAGGTTGACCTCGGATC AGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA 43 Hình 3.14: Kết so sánh trình tự gen chủng M4.13 BLAST NCBI Xây dựng di truyền: Hình 3.15: Sơ đồ di truyền chủng M4.13 Kết xây dựng tiến hóa, xác định lồi cho thấy chủng M4.13 có quan hệ gần gũi với loài Penicillium crustosumvới mức độ tương đồng 99,1% Nhiều nhà khoa học phân lập số endophytes từ trầm hương (Chhipa et al., 2017) Chỉ có 31% vi khuẩn 23% nấm cho thấy khả sản xuất Agarospirol phương pháp lây nhiễm nhân tạo Vi khuẩn Pantoea phân tán nấm Penicillium polonicum cho thấy sản lượng cao so với chủng phân lập khác [13] Vậy, chủng M4.13 thuộc chi Penicillium 44 Như vậy, kết xác định loài sinh học phân tử cho kết tổng hợp bảng 3.2 Bảng 3.2: Kết xác định loài sinh học phân tử chủng nấm Mức độ tương đồng Kết luận Penicillium citrinum 98,82% M4.1a thuộc chi Penicillium M4.3 Pestalotiopsis sp 99,42% M4.3 thuộc chi Pestalotiopsis M4.5a Aspergillus subramanianii 74,72% M4.5 thuộc chi Aspergillus M4.7 Fonsecaea monophora 98,83% M4.7 thuộc chi Fonsecaea M4.13 Penicillium crustosum 99,1% M4.13 thuộc chi Penicillium STT Ký hiệu chủng M4.1a Quan hệ gần gũi với loài 3.3 Kết thử nghiệm chế phẩm vi sinh kích thích tạo trầm hương Dó bầu Sau cấy chế phẩm vi sinh vào Dó bầu 03 tháng, thực việc đánh giá kết thử nghiệm chế phẩm vi sinh xem chế phẩm vi sinh có khả kích thích tạo trầm hương cho Dó bầu thử nghiệm hay không? Tiến hành đục sâu vào lớp gỗ trong, quan sát màu sắc vết tạo trầm diện tích vết trầm tạo Lấy mảnh gỗ vết tạo trầm đốt để đánh giá mùi thơm sau đốt mẫu gỗ Việc đánh giá mùi trầm thực chuyên gia thuộc Công ty Cổ phần Trúc lâm Quán Tuệ - đơn vị chuyên sản xuất kinh doanh sản phẩm từ trầm hương Việt Nam Kết thu bảng 3.3 đây: 45 Bảng 3.3: Kết thử nghiệm chế phẩm vi sinh kích thích tạo trầm hương Dó bầu Cơng thức chế phẩm Hình ảnh Mơ tả Mùi trầm Khơng thấy hình thành trầm hương Khơng ĐC Xuất màu nâu Thơm ngát đậm quanh vết khoan mùi trầm lan dài xuống khoảng 15 cm G5 46 Xuất màu nâu Thơm ngát đậm quanh vết khoan mùi trầm lan rộng khoảng 0,5 - 1,2cm G8 Xuất màu nâu Thơm ngát đậm quanh vết khoan mùi trầm lan rộng khoảng 0,2 - 0,7 cm G7 Như dựa vào bảng số liệu quan sát hình ảnh vị trí thử nghiệm Dó bầu ta kết luận rằng: chủng nấm cộng sinh phân lập có khả tạo trầm Trầm hương Các mẫu gỗ lấy từ vị trí thử nghiệm lây nhiễm nấm Dó bầu ngồi tự nhiên đốt cho mùi thơm Trầm hương Trong cơng thức G5 cho kết tạo trầm tốt công thức nghiên cứu Một nghiên cứu trước Aquilaria malaccensis Chong et al (2015) thử nghiệm cho thấy gỗ hương trầm hình thành thân 18 tháng sau cấy nấm Pojanagaroon Kaewrak (2005) kết luận vết thương học gây tạo trầm hương bắt đầu Aquilaria crassma tuổi [3] 47 KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ mẫu gỗ Dó bầu có trầm tự nhiên thu thập Khánh Hoà tiến hành phân lập định danh chủng nấm có quan hệ gần gũi với chi Penicillium, Pestalotiopsis, Aspergillus, Fonsecaea Dựa đặc điểm hình thái màu sắc hệ sợi bào tử chủng nấm quan sát kính hiển vi, định danh sơ chủng M4.1a M4.13 thuộc chi Penicillium, chủng nấm M4.3 thuộc chi Pestalotiopsis, chủng nấm M4.5a thuộc chi Aspergillus chủng nấm M4.7 thuộc chi Fonsecaea Cả chủng nấm định danh phương pháp phân tích trình tự vùng gen ITS Căn vào kết so sánh ngân hàng GenBank kết luận chủng nấm M4.1a M4.13 thuộc chi Penicillium, chủng nấm M4.3 thuộc chi Pestalotiopsis, chủng nấm M4.5a thuộc chi Aspergillus chủng nấm M4.7 thuộc chi Fonsecaea Kết nghiên cứu khả kích thích tạo Trầm hương Dó bầu chủng nấm phân lập cho kết vùng gỗ biến đổi màu từ vàng đậm đến nâu đen Khi đốt phần gỗ biến đổi màu thấy có mùi thơm đặc trưng Trầm hương Ngồi quanh vùng gỗ biến đổi màu cịn có có màu nâu đen chạy dọc theo sớ gỗ thân ăn sâu vào thân Tồn Do thời gian thực hạn chế nên chưa thể thử nghiệm chế phẩm vi sinh nhiều Dó bầu chưa đánh giá khả kích thích tạo trầm chế phẩm vi sinh Dó bầu thời gian dài Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh có khả kích thích tạo trầm hương Dó bầu Tiếp tục đánh giá khả kích thích tạo trầm chế phẩm vi sinh Dó bầu thời gian dài 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Đinh Trung Chánh, Vi nhân giống dó bầu (Aquilaria crassna Piere ex Lecomte) phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Luận án thạc sĩ khoa học Nông nghiệp, Đại học Nông Lâm TP HCM, 1998 Hoàng Đăng Hiếu, Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phân tích đa dạng định danh lồi tập đồn Dị bầu (Aquilaria sp) Hà Tĩnh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, 2012 Lã Đình Mới, Lưu Đàm Cư, Trần Minh Hợi cộng sự, Tài nguyên thực vật có tinh dầu Việt Nam, Tập I, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Ngân Trầm Hương, “Nghiên cứu gây tạo Trầm hương”, 2018 Phạm Quang Hộ, Cây cỏ Việt Nam, An IIIlustraed Flora of Viet Nam 2, Nxb Trẻ, Hà Nội Phạm Tiến Lợi, Nghiên cứu gây tạo Trầm hương Dó bầu phương pháp vi sinh hố học, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, 2006 PGS TS Cao Ngọc Điệp, TS Nguyễn Văn Thành, Giáo trình mơn Nấm học, 2009 Trần Văn Minh, Bùi Thị Tường Thu, Đinh Trung Chánh, Bùi Cách Tuyến (1998), Nhân giống Trầm qua đỉnh sinh trưởng, Tạp trí Lâm nghiệp TIẾNG ANH Akter S., Islam M T., Zulkefeli M., Khan S I (2013) Agarwood productiona multidisciplinary field to be explored in Bangladesh Int J Pharm Life Sci 10.Chen H., Yang Y., Xue J., Wei J., Zhang Z., Chen H.f (2011) Comparison of compositions and antimicrobial activities of essential oils from chemically stimulated agarwood, wild agarwood and healthy Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg trees 11.Cheng Seng Tan, Nurulhikma Md Isa, Ismanizan Ismail and Zamri Zainal, "Agarwood Induction: Current Developments and Future Perspectives." 12.Claudio Guedes Salgado, Jorge Pereira and partner, Isolation of Fonsecaea pedrosoi from thorns of Mimosa pudica, a probable natural source of chromoblastomycosis, 2004 49 13.Cong Kiet, "A New Species of Aquilaria in Viet Nam.," Le Seminar, University of Natural Sciences Ho Chi Minh City 14.Hai L E., Shyun C Y., Yusoff A M (1999) Early survival and growth in field trials of Aquilaria malaccensis (karas) and Azadirachta excelsa (sentang) J Trop For Sci 15.Hemraj Chhipa and Nutan Kaushik, Fungal and Bacterial Diversity Isolated from Aquilaria malaccensis Tree and Soil, Induces Agarospirol Formation within Months after Artificial Infection, 2017 16.Gao, Z.H., Wei, J.H., Yang, Y., Zhang, Z and Zhao, W.T (2012) Selection and Validation of Reference Genes for Studying Stress-Related Agarwood Formation of Aquilaria sinensis Plant Cell Reports 17 N K T P Muthuraj Sangareswari, "Fungal Microbes Associated with Agarwood Formation," American Journal of Plant Sciences, 2016 18 N Raj, "Redisposals and redescriptions in the Monochaetia-Seiridium, Pestalotia-Pestalotiopsis complexes II Pestalotiopsis besseyii (Guba) comb nov and Pestalosphaeria varia sp nov Mycotaxon.," 1985 19.Novriyanti, K., Santosa, E., Syafii, W., Turjaman, M and Sitepu, I.R (2010) Antifungal Activity of Wood Extract of Aquilaria crassna Pierre ex Lecomte against Agarwood-Inducing Fungi, Fusarium solani Journal of Forestry Research 20.Tamuli P., Boruah P., Nath S C., Samanta R (2000) Fungi from diseased agarwood tree (Aquilaria agallocha Roxb.): two new records Adv Forestry Res 21.Zhang Z., Zhang X., Yang Y., Wei J H., Meng H., Meng Z H., et al (2014) Hydrogen peroxide induces vessel occlusions and stimulates sesquiterpenes accumulation in stems of Aquilaria sinensis Plant Growth Regul Trang web 22 https://tramhuongviet.com/nghien-cuu-cay-tram-huong-phan-1 23.http://www.tramhuonghg.com/su-khac-biet-giua-tram-huong-tu-nhien-vatram-huong-nhan-tao/ 24 https://caythuocdangian.com/tram-huong/ 50 ... - Phân lập số chủng nấm từ thân Dó bầu có trầm tự nhiên Khánh Hồ - Định danh dòng nấm phân lập được: Định danh thơng qua hình thái định danh thơng qua sinh học phân tử - Bước đầu nghiên cứu tạo. .. khoá luận ? ?Phân lập định danh số chủng nấm từ thân Dó bầu tạo trầm tự nhiên Khánh Hoà? ?? PHẦN TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu Trầm hương (Aquilaria crassna) Cây Trầm hương (Dó bầu) thuộc:... QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập chủng nấm từ Dó bầu Tiến hành phân lập mẫu thân Dó bầu có trầm tự nhiên môi trường khác Sau nhiều lần cấy chuyển liên tục để tạo dòng thuần, kết thu chủng nấm tạo