Tìm hiểu tính tương đồng kháng nguyên của các chủng liên cầu khuẩn phân lập từ cá bớp (rachycentron canadum) bị bệnh mù mắt nuôi tại khánh hòa

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN NUÔI TRỒNG THỦY SẢN o0o ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU TÍNH TƯƠNG ĐỒNG KHÁNG NGUYÊN CỦA CÁC CHỦNG LIÊN CẦU KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ BỚP (Rachycentron canadum) BỊ BỆNH MÙ MẮT NUÔI TẠI KHÁNH HÒA Giảng viên hướng dẫn: TS TRẦN VĨ HÍCH Sinh viên thực : TRẦN YẾN NHI Mã số sinh viên : 55133665 Nha Trang, tháng 06 năm 2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN NUÔI TRỒNG THỦY SẢN BỘ MÔN NUÔI THỦY SẢN NƯỚC LỢ o0o ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU TÍNH TƯƠNG ĐỒNG KHÁNG NGUYÊN CỦA CÁC CHỦNG LIÊN CẦU KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ BỚP (Rachycentron canadum) BỊ BỆNH MÙ MẮT NUÔI TẠI KHÁNH HÒA GVHD: TS TRẦN VĨ HÍCH SVTH : TRẦN YẾN NHI MSSV : 55133665 Nha Trang, tháng 06 năm 2017 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành nội dung luận văn tốt nghiệp này, nỗ lực cố gắng thân, nhận nhiều giúp đỡ, đóng góp ý kiến bảo nhiệt tình thầy cô, anh, chị bạn Lời đầu tiên, xin gởi lời cảm ơn chân thành tới TS Trần Vĩ Hích, người tận tình trực tiếp hướng dẫn, bảo suốt trình làm khóa luận Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo trường Đại học Nha trang nói chung, thầy cô Viện Nuôi trồng Thủy sản nói riêng dạy dỗ cho kiến thức môn đại cương môn chuyên ngành, giúp có sở lý thuyết vững vàng tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình học tập Ngoài ra, không quên gởi lời cảm ơn đến anh, chị trại Trung tâm Nghiên cứu Giống Dịch bệnh thủy sản tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình thực đề tài Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân bạn bè tạo điều kiện quan tâm, giúp đỡ, động viên suốt trình học tập hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Sinh viên thực tập Trần Yến Nhi ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Một số đặc điểm sinh học cá bớp (Rachycentron canadum) 1.1.1 Đặc điểm phân loại 1.1.2 Nguồn gốc 1.1.3 Đặc điểm hình thái cấu tạo 1.1.4 Phân bố 1.1.5 Đặc điểm dinh dƣỡng 1.1.6 Đặc điểm sinh trƣởng 1.1.7 Đặc điểm sinh sản 1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh cá bớp 1.2.1 Ngoài nƣớc 1.2.2 Trong nƣớc 1.3 Tổng quan bệnh Streptococcus 10 1.3.1 Một số đặc điểm Streptococcus 10 1.3.2 Tình hình bệnh Streptococcus gây nuôi trồng thủy sản 10 1.3.3 Phòng trị bệnh vi khuẩn Streptococcus sp gây cá nuôi 14 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tƣợng, thời gian địa điểm nghiên cứu 16 2.2 Vật liệu dùng cho nghiên cứu 16 2.2.1 Môi trƣờng, hóa chất 16 2.2.2 Dụng cụ, thiết bị 16 2.2.3 Vật liệu dùng nghiên cứu 17 2.3 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 17 2.4 Nội dung nghiên cứu 18 iii 2.4.1 Phân lập lƣu giữ liên cầu khuẩn 18 2.4.2 Định danh vi khuẩn 19 2.4.3 Xác định tính tƣơng đồng kháng nguyên 21 2.5 Xử lý số liệu 26 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết phân lập lƣu giữ liên cầu khuẩn cá bớp bị bệnh 27 3.2 Kết định danh liên cầu khuẩn từ cá bệnh 29 3.3 Tính tƣơng đồng kháng nguyên chủng vi khuẩn phân lập 33 3.3.1 Kết phân tích protein S.iniae điện di SDS – PAGE 33 3.3.2 Tính tƣơng đồng kháng nguyên chủng liên cầu khuẩn phân lập đƣợc 34 3.3.3 Kết xác định độc lực S iniae 36 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 38 4.1 Kết luận 38 4.2 Đề xuất ý kiến 38 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Số lƣợng cá bớp thu đƣợc hộ nuôi Khánh Hòa 27 Bảng 2: Kết kiểm tra lâm sàng cá thu Cam Ranh, Vạn Ninh Ninh Ích 28 Bảng 3: Nguồn phân lập chủng liên cầu khuẩn thu đƣợc cá bệnh mù mắt nuôi Khánh Hòa 29 Bảng 4: So sánh đặc điểm chủng S.iniae phân lập đƣợc với số nghiên cứu trƣớc 31 Bảng 5: Kết ngƣng kết huyết chủng CR050417 với chủng vi khuẩn CR050417, CR120517 VN180517 34 v DANH MỤC HÌNH Hình : Cá bớp R Canadum .3 Hình 2: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 17 Hình 3: Sơ đồ điện di protein theo phƣơng pháp SDS - PAGE 22 Hình 4: Dụng cụ dùng để điện di .24 Hình 5: Gan cá bị xuất huyết 27 Hình 6: Hiện tƣợng đục mắt cá .27 Hình 7: Vi khuẩn phát triển môi trƣờng TSB 28 Hình 8: Hình dạng khuẩn lạc sau đƣợc cấy 28 Hình 9: Một số đặc điểm sinh hóa chủng liên cầu khuẩn phân lập đƣợc 30 Hình 10: Kết kiểm tra OF (a: Vi khuẩn đƣợc cấy vào môi trƣờng; b: Kết sau 48 cấy) 30 Hình : Kết định danh kit API 20Strep 30 Hình 2: Kết điện di protein màng chủng S.iniae (A: phƣơng pháp tách chiết protein máy Sonicate, B: Phƣơng pháp tách chiết protein màng kết hợp Sonicate lần mutanolysine) 33 Hình 3: Hiệu giá kháng thể huyết cá bớp chủng vi khuẩn CR050417 chủng S iniae khác 35 Hình 4: Hiệu giá kháng thể huyết cá bớp chủng vi khuẩn VN180517 chủng S iniae khác 36 Hình 5: Tỷ lệ cá chết sau tiêm nồng độ vi khuẩn VN180517 ( 105) 36 Hình 6: Một số dụng cụ khác thí nghiệm vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ TSA Tryptic Soy Agar (Môi trường nuôi cấy vi khuẩn) TSB Tryptic Soy Broth (Môi trường nuôi cấy vi khuẩn) CFU(Colony Forming Unit) Đơn vị khuẩn lạc G Gravity (Đơn vị tính lực li tâm) API 20Strep Tên KIT dùng để định danh vi khuẩn Ppm (Part per million) Một phần triệu Ctv Cộng tác viên Cs Cộng KF (KF-Streptococcus Agar) Môi trường nuôi cấy vi khuẩn BA (Blood Agar) Môi trường thạch máu PBS (Phosphate Buffered Salin) Dung dịch muối sinh lí đệm Phosphate CT TNHH Công ty trách nhiệm hữu hạn MỞ ĐẦU Với hệ thống sông ngòi dày đặc có đường bờ biển dài 3.260 km, gồm nhiều biển kín tiếp cận với đại dương rộng mở, nằm vùng khí hậu ấm áp quanh năm Việt Nam có nhiều điều kiện thuận lợi để phát triển hoạt động khai thác nuôi trồng thủy sản Tại Việt Nam phổ biến hình thức nuôi lồng bè cá mú, cá bớp (giò), cá cam, cá hồng, cá vược, tôm hùm trai ngọc Các tỉnh phát triển mạnh nghề nuôi lồng bè Quảng Ninh, Thừa Thiên Huế, Khánh hòa, Phú Yên Bà Rịa - Vũng Tàu Khánh Hòa có bờ biển dài 200 km gần 200 đảo lớn nhỏ nhiều vịnh biển đẹp Vân Phong, Nha Trang, Cam Ranh Với khí hậu ôn hòa, nhiệt độ trung bình 26oC, điều kiện tự nhiên, môi trường sinh thái biển lý tưởng thuận lợi để phát triển nuôi loài thủy hải sản, đặc biệt nghề nuôi cá lồng biển nói chung cá bớp nói riêng Hiện nay, cá bớp đối tượng quan tâm, trọng chúng có nhiều ưu điểm cá có tốc độ tăng trưởng nhanh, khả chống chịu cao thích hợp với điều kiện sóng gió vùng biển đặc biệt có giá trị kinh tế cao Tuy nhiên, nuôi cá bớp phát triển mang lại hiệu kinh tế cao cho người nuôi bên cạnh dịch bệnh bùng nổ diện rộng Bệnh thường gặp cá bớp chủ yếu bệnh vi khuẩn, vi rus kí sinh trùng (Theo Leano et al., 2008) Đặc biệt bệnh vi khuẩn Streptococcus sp (liên cầu khuẩn) gây thiệt hại lớn đến hiệu kinh tế làm giảm suất cho ngành nuôi trồng thủy sản Streptococcus sp dạng liên cầu khuẩn Gram dương phân bố rộng rãi phổ biến tự nhiên Là loài vi khuẩn chuyên gây bệnh cho nhiều động vật có xương sống (bao gồm lợn, trâu bò, cá ) Hiện nay, nhiều quốc gia giới có thông báo bùng phát lây lan dịch bệnh liên cầu khuẩn loài cá gây nguy hiểm cho đối tượng cá nuôi , bao gồm cá nước biển nước Dịch bệnh liên cầu khuẩn cá trở thành dịch bệnh gây nên tổn thất kinh tế lớn cho ngành nuôi trồng thủy sản giới nói chung Việt Nam nói riêng Sử dụng kháng sinh cho cá bị bệnh biện pháp có hiệu việc trị bệnh Streptococcus sp gây Tuy nhiên, việc sử dụng thường xuyên kháng sinh làm gia tăng dòng vi khuẩn kháng thuốc [12] Và hiệu việc phòng trị bệnh phương pháp không cao Do đó, Vaccine lựa chọn tốt việc kiểm soát bệnh streptococcus sp gây Tuy nhiên, việc sử dụng vaccine không mang lại hiệu cao mong muốn thay đổi mạnh mẽ vi khuân nhằm thích nghi với điều kiện môi trường cho phép chúng thay đổi cấu trúc protein kháng nguyên Do đó, có số loại vaccine phòng bệnh Streptococcus sp gây nghiên cứu để tạo loại vaccine có hiệu lực cao cần thiết Được đồng ý Viện Nuôi trồng Thủy sản thực đề tài: “Tìm hiểu tính tƣơng đồng kháng nguyên chủng liên cầu khuẩn phân lập từ cá bớp (Rachycenton canadum) bị bệnh mù mắt nuôi Khánh Hòa” với nội dung sau: Phân lập lưu giữ liên cầu khuẩn cá bớp (Rachycenton canadum) Định danh loài liên cầu khuẩn phân lập cá bớp (Rachycenton canadum) Tìm hiểu tính tương đồng kháng nguyên chủng phân lập cá bớp (Rachycenton canadum) Mục tiêu đề tài Định danh loài vi khuẩn Streptococcus sp phân lập, tìm hiểu tính tương đồng kháng nguyên để sản xuất loại vaccine có hiệu cao Ý nghĩa khoa học: Nhằm cung cấp thêm thông tin bệnh vi khuẩn cá bớp nói riêng cá biển nói chung, kết nghiên cứu đề tài sở cho việc sản xuất vaccine phòng trị bệnh Streptococcus sp gây cá bớp nuôi Ý nghĩa thực tiễn: Kết đề tài làm sở cho việc sử dụng vaccine thích hợp sản xuất vacine hiệu để kiểm soát bệnh Streptococcus sp làm giảm rủi ro, ô nhiễm sử dụng kháng sinh hóa chất gây 29 Bảng 3: Nguồn phân lập chủng liên cầu khuẩn t u cá bệnh mù mắt nuôi Khánh Hòa Ngày Địa điểm Kết phân lập Hình thức nuôi Cỡ cá Dấu hiệu (cm) bệnh lí Kí hiệu TSA TCBS KF G T N G T N G T N + + + + + - - - + + + - + + + chủng Đen thân,đục 20/03/2017 Cam Ranh Ao mắt, xuất 12,5 huyết gan, CR050 417 phình bụng 12/05/2017 Cam Ranh Ao 12,7 Bơi yếu, thận sưng, mắt đục - + + CR120 517 Đen thân, đục 18/05/2017 Vạn Ninh Ao 18 mắt, gan xuất huyết, thận + + + - - - - + - VN180 517 sưng Các chủng liên cầu khuẩn phân lập từ cá bớp bị bệnh có dấu hiệu đục mắt, đen thân, xuất huyết gan thận bị sưng (bảng 3) Điều cho thấy, chủng liên cầu khuẩn phân lập cá bớp bị bệnh mù mắt 3.2 Kết định danh liên cầu khuẩn từ cá bệnh Kết sau phân lập vi khuẩn 75 cá, phân lập chủng liên cầu khuẩn, tiến hành định danh chủng liên cầu khuẩn Kiểm tra đặc tính sinh hóa test API 20Strep kết hợp với số phản ứng sinh hóa truyền thống tính di động, catalase, oxydase Vi khuẩn có hình cầu, bắt màu tím (Gram dương), không di động Kết kiểm tra cho thấy chủng liên cầu khuẩn âm tính với phản ứng oxidase catalase, có khả dung huyết beta (hình 9) CR050417 A CR120517 B VN180517 30 n 9: Một số đặc điểm sinh hóa cácCchủng liên cầu khuẩn phân lập (A: Phản ứng âm tính với catalase; B: Phản ứng âm tính với oxidase; C: Khuẩn lạc môi trường thạch máu) Kết kiểm tra tiêu OF thể hình 10 cho thấy phản ứng với glucose điều kiện hiếu khí kỵ khí a b n 10: Kết kiểm tra OF (a: Vi khuẩn cấy vào môi trường; b: Kết sau 48 cấy) nh 11: Kết định danh kit API 20Strep Dựa tiêu sinh hóa vào kết định danh kit API 20Strep cho thấy có tương đồng đặc điểm chủng liên cầu khuẩn phân lập từ 31 cá bớp bị bệnh nuôi Khánh Hòa với vi khuẩn S.iniae phân lập từ cá chẽm bệnh Thái Lan (Naraid Suanyuk ctv, 2010) Có sai khác số đặc điểm như: Voges Proskauer (VP), D-sorbitol (SOR), D-lactose (LAC) D-raffinose (RAF) Đối với vi khuẩn S.iniae đề cập hệ thống phân loại Bergey chủng có sai khác khả dung huyết anpha beta Bảng 4: So sán đặc điểm chủng S.iniae phân lập với số nghiên cứu trước Chỉ tiêu Kết S.iniae S.iniae phân Ký hiệu chủng VN180517 CR120517 CR050417 đề lập từ cá chẽm cập bệnh Thái hệ thống Lan (Naraid phân loại Suanyuk ctv, 2010) Bergey Nhuộm Gram + + + + + Hình dạng Liên cầu Liên cầu Liên cầu Liên cầu Liên cầu Di động Không Không Không Không Catalase - - - - - oxidase - - - - - Phản ứng OF - - - - - - - - - - Không (hiếu khí) Phản ứng OF (kỵ khí) Gây tan huyết ß-hemolisis ß-hemolisis ß-hemolisis α, ß ß-hemolisis VP + - - ND - HIP - - - - - ESC + + + + + PYRA + + + - + αGAL - - - ND - ßGUR + + + ND + ßGAL - - - ND - 32 Chỉ tiêu Kết S.iniae S.iniae phân PAL + + + NDđề lập từ+ cá chẽm LAP + + + cập bệnh +tại Thái + ADH + + + hệ RIB + + + phân + loại Suanyuk + ARA + - - ND MAN + + + Bergey + SOR + - - - - LAC + - - - - TRE + + + + + INU - - - - - RAF + - - - - AMD + + + ND + GLYG + + + ND + thống Lan + (Naraid ND ctv, 2010) + Ghi chú: ND: không kiểm tra Kết định danh chủng phân lập bảng cho thấy chủng vi khuẩn CR050417 CR120517 tương đồng với nhau, riêng chủng VN180517 có số khác biệt với củng lại Một số khác biệt đặc điểm sinh hóa thể số phản ứng là: ß-Galactosidase (ß- GAL), VP (Voges Proskauer), L-arabinose (ARA), D-lactose (LAC), D-raffinose (RAF), D-sorbitol (SOR) Những khác biệt công bố tác giả nghiên cứu vi khuẩn S.iniae trước Kusuda cs năm 1976 với Pier cs 1976 Kết định danh chủng liên cầu phân lập từ mẫu gan, thận não cá bớp bị bệnh định danh chủng vi khuẩn Streptococcus iniae Cả chủng dễ dàng hoạt hóa trở lại sau tháng lưu giữ Glycerol 40% tủ âm sâu (-80oC) điều chứng tỏ phương pháp bảo quản nghiên cứu phù hợp 33 3.3 Tính tƣơng đồng kháng nguyên chủng vi khuẩn phân lập 3.3.1 Kết phân tích protein S.iniae điện di SDS – PAGE A B kDa 150 70 75 46 35 50 70 46 32 37 32 26 CR120517 CR050417 VN180517 Marker Marker CR120517 CR050417 VN180517 n 12: Kết điện di protein màng chủng S.iniae (A: phƣơng pháp tách chiết protein máy Sonicate, B: Phƣơng pháp tách chiết protein màng kết hợp Sonicate lần mutanolysine) Qua phương pháp thực hình 3.6 ta thấy band xuất phương pháp phương pháp band rõ Phân tích theo phương pháp để dễ dàng xác định vị trí khối lượng protein xác band Kết sau phân tích SDS – PAGE protein chủng vi khuẩn S.iniae CR050417, CR120517 VN180517 cho thấy có tương đồng chủng CR120517 CR050417 khoảng từ 32-70 kDa, có khác biệt cường độ bắt màu band Riêng chủng vi khuẩn VN180517 thấy có khác biệt số band rõ rệt 46 50 kDa Chủng VN180517 không tương đồng với chủng laị protein không tương thích thấy xuất số band khác biệt, điều chứng tỏ tính kháng nguyên chủng VN180517 khác với chủng CR120517 CR050417 Trong nghiên cứu Trần Vĩ Hích, 2014 xác định protein kháng nguyên chung chủng S.iniae phân lập có khối lượng 22 35 kDa, kết có tương đồng với kết protein kháng nguyên chung chủng vi 34 khuẩn CR120517 CR050417 có band protein vị trí band 35 kDa Hai chủng CR120517 CR050417 có tương đồng cao Có nghiên cứu thành phần protein vi khuẩn S.iniae Năm 2009, tác giả Nho cộng phân tích 65 chủng vi khuẩn S iniae mà tác giả thu thập từ cá bơn từ năm 2003 – 2006 Kết khẳng định đồng thành phần protein chủng vi khuẩn S iniae (Theo Nho cs, 2009) Nhóm tác giả cho biết SDS-PAGE chủng vi khuẩn S iniae chứa band có khối lượng phân tử xấp xỉ 65, 60, 48, 46, 44, 35, 32 26 kDa Các protein thí nghiệm có trọng lượng phân tử khoảng 26, 32, 35, 46, 48, 70 kDa, kết có độ tương đồng cao với nghiên cứu tác giả Nho cs năm 2009 Có số band không trùng với nghiên cứu trình thực chưa tối ưu hóa nên kết có số band không xuất 3.3.2 Tính tƣơng đồng kháng nguyên chủng liên cầu khuẩn phân lập đƣợc 3.3.2.1 Tính tƣơng đồng kháng nguyên chủng CR050417 với chủng vi khuẩn CR050417, CR120517 VN180517 Tính tương đồng kháng nguyên chủng CR050417 với chủng vi khuẩn CR050417, CR120517 VN180517 thể qua bảng Bảng 5: Kết ngƣng kết huyết chủng CR050417 với chủng vi khuẩn CR050417, CR120517 VN180517 CR050417 CR050417 16 32 32 16 64 16 32 32 16 64 CR120517 16 32 16 16 16 16 16 32 32 VN180517 4 8 Qua bảng kết cho thấy huyết bớp sau tiêm vi khuẩn bất hoạt chủng CR050417 ngưng kết với chủng lại có hiệu giá kháng thể cao hay thấp khác Huyết thu từ cá tiêm chủng CR050417 cho khả ngưng kết với vi khuẩn CR050417 cao Khả ngưng kết huyết với vi khuẩn CR120517 tương đối cao với VN180517 thấp nhất, chí có huyết từ cá ngưng lết với chủng VN180517 Kết lý giải hai chủng CR120517 CR050417 có tương đồng cao điều thể tương đồng band protein chủng (hình 12) Trong đó, khác biệt protein chủng vi khuẩn VN180517 với chủng lại 35 CR120517 CR050427 nguyên nhân làm cho khả ngưng kết huyết cá thí nghiệm với vi khuẩn VN180517 yếu Hiệu giá kháng thể (1:) 30 25 20 15 10 Các chủng vi khuẩn CR050417 CR120517 VN180517 n 13: Hiệu giá kháng thể huyết cá bớp chủng vi khuẩn CR050417 chủng S iniae khác 3.3.2.2 Tính tƣơng đồng kháng nguyên chủng VN180517 với chủng vi khuẩn CR050417, CR120517 VN180517 Kết từ thí nghiệm cho thấy chủng VN180517 ngưng kết không ngưng kết với chủng CR120517 CR050417 Nó thể độ ngưng kết cao thân Điều thể rõ bảng Bảng 6: Ngưng kết huyết chủng VN180517 với chủng vi khuẩn CR050417, CR120517, VN180517 CR050417 8 2 8 VN180517 CR120517 16 8 VN180517 32 16 64 64 16 64 32 64 64 32 Tương tự với kết phân tích phần tương đồng kháng nguyên chủng CR050417 với chủng vi khuẩn lại Huyết thu từ cá tiêm chủng VN180517 cho khả với vi khuẩn VN180517 cao Chủng CR050417 có huyết từ cá không ngưng kết với chủng VN180517 có huyết từ cá chủng CR120517 không ngưng kết với VN180517 Điều cho thấy chủng VN180517 ngưng kết không ngưng kết với chủng lại protein không tương thích với thấy số band khác biệt (hình 36 12) Có thể tính kháng nguyên chủng VN180517 khác với chủng CR050417 CR120517 45 Hiệu giá kháng thể (1:) 40 35 30 25 CR050417 20 CR120517 15 VN180517 10 Các chủng vi khuẩn n 14: Hiệu giá kháng thể huyết cá bớp chủng vi khuẩn VN180517 chủng S iniae khác Qua kết phân tích trên, huyết thu từ cá bớp sau tiêm vi khuẩn bất hoạt chủng vi khuẩn VN180517, CR120517 CR050417 cho khả ngưng kết với thân cao Tính kháng nguyên hai chủng CR050417 VN180517 khác 3.3.3 Kết xác định độc lực S iniae 100 Tỷ lệ chết tích lũy (%) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 23/05 24/05 25/05 26/05 27/05 28/05 29/05 30/05 Ngày VN180517 CR050417 n 15: Tỷ lệ cá chết sau tiêm nồng độ vi khuẩn VN180517 CR050417 ( 105) 37 Qua hình 15 cho thấy tỷ lệ cá chết đến 80 – 90% sau tiêm vi khuẩn VN180517 nồng độ 105 CFU/con cá Sau tiêm cá bơi lội bình thường Cá có dấu hiệu bất thường sau tiêm vi khuẩn ngày số lượng cá chết mạnh sau tiêm từ đến ngày, tỷ lệ chết tích lũy 60% Cá sau tiêm 4, ngày hoạt động yếu dần bỏ ăn Sau ngày tiêm tỷ lệ chết tích lũy lên đến 90% Cá lại hoạt động bình thường sau ngày tiêm Với chủng CR050417 sau tiêm với nồng độ 105 CFU/con cá, cá chết nhanh sau tiêm từ đến ngày , tỷ lệ chết tích lũy sau ngày 60%, sau ngày tiêm, không thấy cá chết thêm Cá hoạt động bình thường, không xuất dấu hiệu bệnh lí Dấu hiệu bệnh lí cá sau tiêm chủng vi khuẩn VN180517 CR050417 tương tự với dấu hiệu cá bị nhiễm S.iniae tự nhiên Cá gần chết có tượng đen thân, mắt đục lồi, bơi lội lờ đờ, không định hướng, cá bỏ ăn Một số dấu hiệu bên nội quan gan bị xuất huyết, thận sưng thấy giải phẫu cá Đem cấy vi khuẩn gan, não thận, kết kiểm tra thu vi khuẩn S.iniae 38 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 4.1 Kết luận Trong thời gian thu mẫu từ 08/03/2017 đến 22/05/2017, qua kiểm tra phân tích 75 cá thu địa điểm Khánh Hòa có cá có dấu hiệu mù mắt Cho thấy tỷ lệ cá bớp bị bệnh mù mắt bị nhiễm Streptococcus 75% Sự tương đồng protein chủng vi khuẩn phân lập có khác biệt Hai chủng CR120517 CR050417 có tương đồng cao có nhiều khác biệt với chủng vi khuẩn lại VN180517 Huyết thu từ cá tiêm vi khuẩn CR050417 có khả ngưng kết tốt với vi khuẩn CR050417 vi khuẩn CR120517 ngưng kết yếu với vi khuẩn VN180517 Trong huyết thu từ cá tiêm vi khuẩn VN180517 ngưng kết mạnh với thân vi khuẩn VN180517 ngưng kết yếu với chủng vi khuẩn lại Độc lực chủng vi khuẩn phân lập cao cá bớp Sau cãm nhiễm vi khuẩn cách tiêm vào với nồng độ 105 CFU/cá cho thấy tỷ lệ cá chết đến 80-90% vi khuẩn VN180517 60% vi khuẩn CR050417 Cá nhiễm bệnh biểu dấu hiệu bệnh lý giống với cá bị bệnh tự nhiên 4.2 Đề xuất ý kiến Cần tiến hành kỹ thuật western blot để xác định protein kháng nguyên vi khuẩn Streptococcus Nghiên cứu sản xuất vaccine phòng trị bệnh Streptococcus sp gây cá bớp nuôi 39 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Thu Dung, 2016 Xác định tác nhân vi khuẩn gậy bệnh xuất huyết cá bống kèo( Pseudapocryptes elongatus) Đồng Thanh Hà, Nguyễn Viết Khuê, Nguyễn Thị Hạnh 2011 Một số đặc điểm Streptococcus agalactiae – Tác nhân gây bệnh Streptococcosis cá Rô phi miền Bắc Việt Nam Trần Vĩ Hích 2014 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch cá Chẽm (Lates calcarifer Bloch 1790) vi khuẩn Streptococcus iniae Dương Văn Luông, 2011 Nghiên cứu tăng trưởng hiệu kinh tế nuôi cá giò (Rachycentron canadum) thương phẩm lồng biển hở Nghệ An Phạm Phước Thuận, 2015 Khảo sát tình hình bệnh cá bớp (Rachycentron canadum) nuôi lồng phú Quốc tiên hải tỉnh Kiên Giang Bùi Quang Tề, 2006 Giáo trình bệnh học thủy sản Nguyễn Trường Phúc 2011 Tìm hiểu bệnh mù mắt cá bớp (Rachycentron canadum Linnaeus, 1766) nuôi lồng Khánh Hòa Phạm Hồng Quân, 2013 Nghiên cứu số đặc tính học vi khuẩn Streptococcus spp gây bệnh xuất huyết cá rô phi nuôi số tỉnh miền Bắc Việt Nam Lê Thanh Cần Đặng Thị Hoàng Oanh, 2015 Một số đặc điểm bệnh học cá bớp (Rachycentron canadum, Linaeus, 1766) nuôi thâm canh Nha Trang Tài liệu Tiếng Anh 10 E McLean et al 2008 Parasites, diseases and deformities of cobia Ribarstvo 66, (1), – 16 11 Lucy Bunkley-Williams & Ernest H Williams, Jr 2006 New records of parasites for culture Cobia, Rachycentron canadum (Perciformes: Rachycentridae) in Puerto Rico Revista de Biologia Tropical, 54, (suppl 3),1–7 12 Aoki, T., Takami, k Àn Kitao, T (1990), “Drug resistance in a non – hemolytic Streptococcus sp isolated from cultured yellowtail Seriola quinqueradiata”, Diseases of Aquatic Organisms 8, pp 171-177 40 13 J.J Guo at el 2015 The effects of garlic-supplemented diets on antibacterial activities against Photobacterium damselae subsp piscicida and Streptococcus iniae and on growth in Cobia, Rachycentron canadum Aquaculture 435,111–115 14 John P Hawke 2012 Photobacteriosis Department of Pathobiological Sciences School of Veterinary Medicine Louisiana State University Baton Rouge, LA 70803 15 P R Rajan, Carmen Lopez, John Han-You Lin & Huey-Lang Yang 2001.Vibrio alginolyticus infection in cobia (Rachycentron canadum) cultured in Taiwan Bulletin of the European Association of Fish Pathologists, 21(6), 21 –234 16 Nho, S.W., Shin, G.W., Park, S.B., Jang, H.B., Cha, I.S., Ha, M.A., Kim, Y.R., Park, Y.K., Dalvi, R.S., Kang, B.J., Joh, S.J and Jung, T.S (2009), "Phenotypic characteristics of Streptococcus iniae and Streptococcus parauberis isolated from olive flounder (Paralichthys olivaceus )", Federation of European Microbiological Societies 293, pp 20-27 Tài liệu Internet http://phantichprotein.vn/cac-ky-thuat-phan-tich-protein http://www.fishbase.org https://www.google.com.vn https://vi.wikipedia.org PHỤ LỤC Một số dụng cụ hóa chất thí nghiệm Máy ly tâm lạnh Máy sonicate Một số hóa chất kit API 20strep Kính hiển vi Máy li tâm n 16: Một số dụng cụ khác thí nghiệm + Một số hóa chất dùng điện di Monomere solution( 40%) Acrylamide (FW 71,08) 10 g Bis-acrylamide (FW 154,2) 0,2 g Nước cất 25 ml 4X Resolving gel buffer (0,5M Tris HCl, pH 8,8) Tris base (FW 121,1) 1,815 g Nước cất thêm 7,5 ml Chỉnh pH 8,8 với HCl đậm đặc Thêm nước cất đến 10 ml 4X Stacking gel buffer (0,5 Tris HCl, pH 6,8) Tris base (FW 121,1) 1,5 g Nước cất thêm 20 ml Chỉnh pH 6,8 với HCl đậm đặc Thêm nước cất đến 25 ml SDS 10% SDS 2,5 g Nước cất 25 ml 2X Treatment buffer 4X Stacking gel buffer 2,5 ml SDS 10% ml Glycerol ml Dithiothreitol (DTT) ( FW 154,2) 0,31 g Bromophenol Blue 0,002 g Thêm nước cất 10 ml Tank buffer (0,025 M Tris HCl; 0,192 M Glycine; 0,1% SDS; pH 8,3) Tris (FW 121,1) 3,028 g Glycine 14,413 g SDS g Nước cất lít Resolving gel 15% Monomere 40% 3,8 ml 4X Resolving gel 2,5 ml SDS 10% 0,1 ml Nước cất 3,6 ml APS 10% 100 µl TEMED 10 µl Stacking gel 5% Monomere 40% 1,3 ml 4X Stacking gel 2,5 ml SDS 10% 0,1 ml Nước cất 6,2 ml APS 10% 50 µl TEMED 10 µl Dung dịch nhuộm gel (Staining solution) Coomassie Brilliant Blue G- 250 0,025 g Methanol 40 ml Acid acetic 10 ml Bổ sung nước cất vừa đủ 100 ml Dung dịch rửa màu Methanol 40 ml Acid acetic 10 ml Nước cất vừa đủ 100 ml Thuốc thử Bradford Hòa tan 0,01g Coomassive Brilliant Blue G-250 vào ml ethanol 96%, sau thêm 10 ml H3PO4 85% định mức lên đến 100 ml nước cất ... thần kinh khu nuôi cá bớp Khánh Hòa 2.3 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu Tìm hiểu tính tương đồng kháng nguyên chủng liên cầu khuẩn phân lập từ cá bớp bị bệnh mù mắt nuôi Khánh Hòa Phân lập lưu giữ... tƣơng đồng kháng nguyên chủng liên cầu khuẩn phân lập từ cá bớp (Rachycenton canadum) bị bệnh mù mắt nuôi Khánh Hòa với nội dung sau: Phân lập lưu giữ liên cầu khuẩn cá bớp (Rachycenton canadum). .. VIỆN NUÔI TRỒNG THỦY SẢN BỘ MÔN NUÔI THỦY SẢN NƯỚC LỢ o0o ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU TÍNH TƯƠNG ĐỒNG KHÁNG NGUYÊN CỦA CÁC CHỦNG LIÊN CẦU KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ BỚP (Rachycentron canadum) BỊ BỆNH