NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ ACID CARNOSIC TỪ HƯƠNG THẢO (Rosmarinus officinalis L.), HỌ HOA MÔI (Lamiaceae) LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y TRẦN THỊ MAI NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ ACID CARNOSIC TỪ HƯƠNG THẢO (Rosmarinus officinalis L.), HỌ HOA MÔI (Lamiaceae) LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC HÀ NỘI - 2022 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y TRẦN THỊ MAI NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ ACID CARNOSIC TỪ HƯƠNG THẢO (Rosmarinus officinalis L.), HỌ HOA MÔI (Lamiaceae) LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Cán hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Thư HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực hồn thành khóa luận này, bên cạnh em ln có giúp đỡ vơ q giá đến từ Thầy Cơ, gia đình bạn bè Thời điểm hồn thành khóa luận lúc em xin phép bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến người dạy dỗ, hướng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian qua Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới đến: TS Nguyễn Văn Thư, người thầy tận tình hướng dẫn, động viên, truyền cho em nhiều kiến thức, kinh nghiệm quý báu giúp đỡ em suốt q trình thực khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Thầy Cô giáo Kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu – - Dược học cổ truyền hỗ trợ tạo điều kiện giúp đỡ em suốt q trình học tập làm khóa luận Em xin chân thành cảm ơn tới Ban giám đốc Học viện, Phịng Đào tạo tồn thể cán Giảng viên, Kỹ thuật viên Viện Đào tạo Dược, Học viện Quân Y tạo điều kiện giúp đỡ em trình học tập nghiên cứu, quan tâm dìu dắt truyền cho em kiến thức quý giá suốt năm theo học trường Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn tới gia đình lời cảm ơn bạn bè động viên, khích lệ em suốt q trình học tập thực khóa luận Mặc dù có nhiều cố gắng hết khả mình, song khả kinh nghiệm thân có hạn, nên khóa luận khơng tránh khỏi tồn tại, hạn chế thiếu sót Vì em mong nhận góp ý chân thành Thầy giáo, Cơ giáo Hội đồng chấm khóa luận để khóa luận em hồn thiện hơn.Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 07 năm 2022 Học viên Trần Thị Mai MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ HƯƠNG THẢO 1.1.1 Tên gọi phân loại thực vật .2 1.1.2 Phân loại thực vật 1.1.3 Đặc điểm thực vật 1.1.4 Phân bố 1.1.5 Thành phần hóa học .4 1.1.6 Tác dụng sinh học công dụng: 1.2 TỔNG QUAN VỀ ACID CARNOSIC 13 1.2.1 Công thức cấu tạo .13 1.2.3 Tác dụng sinh học acid carnosic 14 1.2.4 Ứng dụng acid carnosic .17 1.3 PHƯƠNG PHÁP THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU 19 1.3.1 Các khái niệm chất đối chiếu hóa học 19 1.3.2 Thiết lập chất đối chiếu sơ cấp 19 1.3.3 Thiết lập chất đối chiếu thứ cấp 20 1.3.4 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng đánh giá chất đối chiếu yêu cầu nội dung quy trình phân tích 20 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 22 2.1.1 Nguyên liệu 22 2.1.2 Hóa chất, thuốc thử 23 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 23 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.2.1 Xây dựng phương pháp chiết xuất, phân lập tinh chế acid carnosic từ dược liệu Hương thảo 24 2.2.2 Bước đầu đánh giá số tiêu chất lượng chất đối chiếu acid carnosic 31 2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÍ SỐ LIỆU 33 2.4 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 34 3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ ACID CARNOSIC TỪ DƯỢC LIỆU HƯƠNG THẢO 34 3.1.1 Kết xây dựng phương pháp định lượng acid carnosic từ dược liệu Hương thảo .34 3.1.2 Kết xây dựng phương pháp chiết xuất acid carnosic từ Hương thảo .37 3.1.3 Kết xây dựng phương pháp phân lập, tinh chế acid carnosic từ dược liệu Hương thảo 42 3.2 KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA CHẤT ĐỐI CHIẾU ACID CARNOSIC 42 3.2.1 Tính chất .42 3.2.2 Định tính .43 3.2.3 Định lượng 47 3.2.4 Tạp chất liên quan 50 KẾT LUẬN 53 KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG STT 2.1 2.2 Tên bảng Các hóa chất, dung mơi sử dụng nghiên cứu Các thiết bị dụng cụ nghiên cứu Trang 23 23 2.3 Các thông số khảo sát lựa chọn dung môi chiết xuất AC từ Hương thảo 26 2.4 Các thông số khảo sát lựa chọn phương pháp chiết xuất AC từ Hương thảo 27 3.1 Kết xác định hàm ẩm dược liệu Hương thảo 35 3.2 Kết xác định tính tương thích hệ thống HPLC 36 3.3 Sự tương quan diện tích pic nồng độ acid carnosic 37 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng dung môi chiết xuất 39 3.5 Kết khảo sát lựa chọn phương pháp chiết xuất 40 3.6 Dữ liệu phổ 1H- NMR 13C- NMR hợp chất tinh chế 47 3.7 Kết xác định hàm lượng acid carnosic SPTC 50 3.8 3.9 Kết phân tích tạp chất SPTC Tóm tắt tiêu phương pháp thử chất đối chiếu 51 53 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình 1.1 Cây Hương thảo Trang 1.2 Cấu trúc số terpen phân lập từ loài Hương thảo 1.3 Cấu trúc số flavonoid phân lập từ loài Hương thảo 1.4 Cấu trúc số phenolic phân lập từ loài Hương thảo 1.5 Công thức cấu tạo acid carnosic 13 2.1 Hương thảo sấy khơ 22 3.1 Tương quan diện tích pic nồng độ acid carnosic 38 3.2 Sơ đồ quy trình chiết xuất acid carnosic từ dược liệu Hương thảo 41 3.3 Phổ 1H-NMR hợp chất tinh chế 42 Phổ 1H-NMR hợp chất tinh chế 45 Phổ 46 3.4 3.5 được C-NMR hợp chất tinh chế 13 3.6 Cấu trúc hóa học acid carnosic 48 3.7 Sắc ký đồ mẫu trắng 49 3.8 Sắc ký đồ mẫu acid carnosic chuẩn 49 3.8 Sắc ký đồ mẫu acid carnosic tinh chế 50 3.10 Sắc ký đồ mẫu trắng 52 3.11 Sắc ký đồ mẫu thử 52 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT STT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ AC Acid carnosic CAN Acetonitril ASEAN Association of Southeast Asian Nations (Hiệp hội quốc gia Đông Nam Á) CĐC Chất đối chiếu CTCL Chỉ tiêu chất lượng DCM Dicloromethan DĐVN Dược điển Việt Nam V GLP Good Laboratory Practices V thuốc) HPLC (Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm High-performance Chromatography Liquid (Sắc ký lỏng hiệu cao) 10 IC50 Inhibitory Concenration 50% (Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử) 11 MeOH Methanol 12 NMR Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) 13 PCRS Primary Chemical Reference Standard (Chất đối chiếu hóa học sơ cấp) 14 PPPT Phương pháp phân tích 15 RSD Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) 16 17 R officinalis SCRS Rosmarinus officinalis Secondary Standard 10 Chemical Reference Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu thử Bảng 3.9 Tóm tắt tiêu phương pháp thử chất đối chiếu Chỉ tiêu chất lượng Tính chất Yêu cầu Phương pháp thử Phải phù hợp với nhận dạng Quan sát mắt thường tài liệu công bố ánh sáng ban ngày Định tính Sắc ký lớp mỏng Phải có màu Rf trùng với Sắc ký lớp mỏng dung dịch chuẩn Phổ cộng hưởng Phải giống mẫu chuẩn Đo phổ NMR: 1H- NMR, từ hạt nhân- phù hợp với phổ đối chiếu 13C- NMR, so sánh với NMR phổ chuẩn thiết lập Định lượng Khơng 95,0% Phương pháp HPLC Tạp chất liên Không vượt 5%, Phương pháp HPLC quan loại pic có tỷ lệ diện tích 0,05% 52 KẾT LUẬN Sau thời gian tiến hành làm thực nghiệm, đề tài hoàn thành hai mục tiêu đề rút số kết luận sau: Xây dựng phương pháp chiết xuất, phân lập tinh chế acid carnosic từ dược liệu Hương thảo 100g Hương thảo chiết xuất phương pháp chiết hồi lưu EtOH 96% thu 2,8 g cắn Acid carnosic phân lập từ 1g cắn phương pháp HPLC điều chế, tinh chế với hệ dung môi rửa giải ACN : acid phosphoric 0,1% (60:40) thu 27,9 mg SPTC Hiệu suất trình từ dược liệu Hương thảo tạo sản phẩm tinh chế (SPTC) theo quy trình xây dựng 0,0781% Bước đầu đánh giá số tiêu chất lượng chất đối chiếu acid carnosic Bao gồm tiêu: - Tính chất: chất rắn dạng bột màu vàng nhạt - Định tính: sắc ký lớp mỏng so sánh với mẫu chuẩn, phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều kết hợp đối chiếu tài liệu tham khảo - Định lượng: Bằng HPLC Kết hàm lượng acid carnosic tinh chế 96,63± 1,13% - Tạp chất liên quan: Bằng HPLC Kết % tạp SPTC 1,752% 53 KIẾN NGHỊ Do thời gian thực đề tài có hạn nên kết nghiên cứu đóng góp phần nhỏ vào cơng trình nghiên cứu Vì vậy, em xin đưa đề xuất: Tiếp tục nghiên cứu thiết lập tiêu chuẩn chất đối chiếu acid carnosic theo hướng dẫn ASEAN, WHO thiết lập, phân phối bảo quản chất đối chiếu 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Sotgia F., Martinez-Outschoorn U E and Lisanti M P (2011) Mitochondrial oxidative stress drives tumor progression and metastasis: should we use antioxidants as a key component of cancer treatment and prevention? BMC medicine (1): 1-5 Tuệ Tĩnh Thiền sư Tuyển tập 3033 thuốc đông y (xuất lần thứ 2) 1362 Đỗ Tât Lợi (2003) Những thuốc vị thuốc Việt Nam (xuất lần thứ 8) NXB y học, 648-649 Gui-hua L (2011) Determination of Ursolic Acid and Oleanolic Acid in Rosmarinus officinalis by RPHPLC-PAD Food Sci 32 (12): 243-245 Cantrell C L., Richheimer S L., Nicholas G M, et al (2005) s ecoHinokiol, a New Abietane Diterpenoid from Rosmarinus officinalis Journal of natural products 68 (1): 98-100 Zhang Y., Smuts J P., Dodbiba E, et al (2012) Degradation study of carnosic acid, carnosol, rosmarinic acid, and rosemary extract (Rosmarinus officinalis L.) assessed using HPLC Journal of agricultural and food chemistry 60 (36): 9305-9314 Nakatani N and Inatani R (1983) A new diterpene lactone, rosmadial, from Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) Agricultural and Biological Chemistry 47 (2): 353-358 Munné-Bosch S., Alegre L and Schwarz K (2000) The formation of phenolic diterpenes in Rosmarinus officinalis L under Mediterranean climate European Food Research and Technology 210 (4): 263-267 Bai N., He K., Roller M, et al (2010) Flavonoids and phenolic compounds from Rosmarinus officinalis Journal of agricultural and food chemistry 58 (9): 5363-5367 10 Begum A., Sandhya S., Vinod K R, et al (2013) An in-depth review on the medicinal flora Rosmarinus officinalis (Lamiaceae) Acta scientiarum polonorum Technologia alimentaria 12 (1): 61-74 11 Erkan N., Ayranci G and Ayranci E (2008) Antioxidant activities of rosemary (Rosmarinus Officinalis L.) extract, blackseed (Nigella sativa L.) essential oil, carnosic acid, rosmarinic acid and sesamol Food chemistry 110 (1): 76-82 12 Vicente G., Molina S., González-Vallinas M, et al (2013) Supercritical rosemary extracts, their antioxidant activity and effect on hepatic tumor progression The Journal of Supercritical Fluids 79: 101-108 13 Rahbardar M G and Hosseinzadeh H (2020) Therapeutic effects of rosemary (Rosmarinus officinalis L.) and its active constituents on nervous system disorders Iranian Journal of Basic Medical Sciences 23 (9): 1100 14 da Rosa J S., Facchin B M., Bastos J, et al (2013) Systemic administration of Rosmarinus officinalis attenuates the inflammatory response induced by carrageenan in the mouse model of pleurisy Planta medica 79 (17): 16051614 15 Tawfeeq A A., Mahdi M F., Abaas I S, et al (2018) Isolation, quantification, and identification of rosmarinic acid, gas chromatographymass spectrometry analysis of essential oil, cytotoxic effect, and antimicrobial investigation of rosmarinus officinalis leaves Asian J Pharm Clin Res 11 (6): 126-132 16 Tavassoli S., Mousavi S., Emam-Djomeh Z, et al (2011) Comparative study of the antimicrobial activity of Rosmarinus officinalis L essential oil and methanolic extract Middle-East Journal of Scientific Research (4): 467-471 17 Yesil-Celiktas O., Sevimli C., Bedir E, et al (2010) Inhibitory effects of rosemary extracts, carnosic acid and rosmarinic acid on the growth of various human cancer cell lines Plant foods for human nutrition 65 (2): 158-163 18 Moore J., Megaly M., MacNeil A J, et al (2016) Rosemary extract reduces Akt/mTOR/p70S6K activation and inhibits proliferation and survival of A549 human lung cancer cells Biomedicine & Pharmacotherapy 83: 725-732 19 Bao T-Q., Li Y., Qu C, et al (2020) Antidiabetic effects and mechanisms of rosemary (Rosmarinus officinalis L.) and its phenolic components The American Journal of Chinese Medicine 48 (06): 1353-1368 20 Machado D G., Bettio L E., Cunha M P, et al (2009) Antidepressant-like effect of the extract of Rosmarinus officinalis in mice: involvement of the monoaminergic system Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry 33 (4): 642-650 21 Cháfer A., Fornari T., Berna A, et al (2005) Solubility of solid carnosic acid in supercritical CO2 with ethanol as a co-solvent The Journal of supercritical fluids 34 (3): 323-329 22 Pisoschi A M., Pop A., Cimpeanu C, et al (2016) Antioxidant capacity determination in plants and plant-derived products: A review Oxidative medicine and cellular longevity 2016: 200 23 Garbarino J A., Troncoso N., Delpiano P, et al (2006) Antioxidant activity analysis for the selection of Rosmarinus officinalis L Natural Product Communications (12): 300-315 24 Masuda T., Inaba Y and Takeda Y (2001) Antioxidant mechanism of carnosic acid: structural identification of two oxidation products Journal of Agricultural and Food Chemistry 49 (11): 5560-5565 25 Pavić V., Jakovljević M., Molnar M, et al (2019) Extraction of carnosic acid and carnosol from sage (Salvia officinalis L.) leaves by supercritical fluid extraction and their antioxidant and antibacterial activity Plants (1): 16 26 Myali A A H A., Hassoon A S., Hussain M H, et al (2020) Reversed phase liquid chromatographic-ultra violet detection and evaluation of phenolic antioxidants in fresh rosemary leaves and determination of antibacterial activity of extract Journal 2290 (2): 200-232 27 Xia G., Wang X., Sun H, et al (2017) Carnosic acid (CA) attenuates collagen-induced arthritis in db/db mice via inflammation suppression by regulating ROS-dependent p38 pathway Free Radical Biology and Medicine 108: 418-432 28 Liu M., Zhou X., Zhou L, et al (2018) Carnosic acid inhibits inflammation response and joint destruction on osteoclasts, fibroblast‐like synoviocytes, and collagen‐induced arthritis rats Journal of cellular physiology 233 (8): 6291-6303 29 Barni M., Carlini M., Cafferata E, et al (2012) Carnosic acid inhibits the proliferation and migration capacity of human colorectal cancer cells Oncology reports 27 (4): 1041-1048 30 Jiang S., Qiu Y., Wang Z, et al (2021) Carnosic Acid Induces Antiproliferation and Anti-Metastatic Property of Esophageal Cancer Cells via MAPK Signaling Pathways Journal of Oncology 2021: 150 31 de Oliveira M R (2018) Carnosic acid as a promising agent in protecting mitochondria of brain cells Molecular neurobiology 55 (8): 6687-6699 32 Offord E A., Gautier J-C., Avanti O, et al (2002) Photoprotective potential of lycopene, β-carotene, vitamin E, vitamin C and carnosic acid in UVA-irradiated human skin fibroblasts Free Radical Biology and Medicine 32 (12): 1293-1303 33 Aruoma O., Halliwell B., Aeschbach R, et al (1992) Antioxidant and prooxidant properties of active rosemary constituents: carnosol and carnosic acid Xenobiotica 22 (2): 257-268 34 Aoyagi Y., Takahashi Y., Satake Y, et al (2006) Cytotoxicity of abietane diterpenoids from Perovskia abrotanoides and of their semisynthetic analogues Bioorganic & medicinal chemistry 14 (15): 5285-5291 35 Hadad N and Levy R (2012) The synergistic anti-inflammatory effects of lycopene, lutein, β-carotene, and carnosic acid combinations via redoxbased inhibition of NF-κB signaling Free Radical Biology and Medicine 53 (7): 1381-1391 36 Dickmann L J., VandenBrink B M and Lin Y S (2012) In vitro hepatotoxicity and cytochrome P450 induction and inhibition characteristics of carnosic acid, a dietary supplement with antiadipogenic properties Drug Metabolism and Disposition 40 (7): 1263-1267 37 Calabrese V., Scapagnini G., Catalano C, et al (2000) Biochemical studies of a natural antioxidant isolated from rosemary and its application in cosmetic dermatology International journal of tissue reactions 22 (1): 513 38 Bernardes W A., Lucarini R., Tozatti M G, et al (2010) Antimicrobial activity of Rosmarinus officinalis against oral pathogens: relevance of carnosic acid and carnosol Chemistry & biodiversity (7): 1835-1840 39 Jeong E., Jang H., Kim S, et al (2015) Protective effect of eupatilin against renal ischemia-reperfusion injury in mice Journal 47 (Issue): 757762 40 Kim H (2019) Globalization and regulatory change: The interplay of laws and technologies in E-commerce in Southeast Asia Computer Law & Security Review 35 (5): 105315 41 Klabbers J (2022) An introduction to international organizations law Cambridge University Press, 42 Oketch-Rabah H A., Roe A L., Rider C V, et al (2020) United States Pharmacopeia (USP) comprehensive review of the hepatotoxicity of green tea extracts Toxicology Reports 7: 386-402 43 Bộ y tế (2018) Dược điển Việt Nam V Nhà xuất y học 1354-1355 44 Okamura N., Fujimoto Y., Kuwabara S, et al (1994) High-performance liquid chromatographic determination of carnosic acid and carnosol in Rosmarinus officinalis and Salvia officinalis Journal of Chromatography A 679 (2): 381-386 PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC PHỤ LỤC HÌNH ẢNH CỦA PHỔ ACID CARNOSIC TINH CHẾ ĐƯỢC