CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xây dựng phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế acidcarnosic từ dược liệu Hương thảo carnosic từ dược liệu Hương thảo
2.2.1.1. Phương pháp định lượng acid carnosic trong dược liệu Hương thảo bằng phương pháp HPLC
a. Xác định hàm ẩm của dược liệu Hương thảo:
Tiến hành theo phụ lục 9.6 (DĐVN V) bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô bằng máy đo hàm ẩm tự động. Mỗi mẫu lấy khoảng 3g, sấy ở 105 oC trong 4h [43].
b. Định lượng
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử:
+ Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 5,0 mg chất chuẩn acid carnosic vào bình định mức 5ml, sau đó hịa tan và bổ sung bằng MeOH vừa đủ đến vạch. Lắc đều và thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000μg/ml.
+ Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,5g dược liệu Hương thảo cho vào bình nón 50ml, chiết siêu âm với 15 ml bằng dung môi chiết MeOH trong 40 phút, số lần chiết là 2 lần. Gạn, lọc dịch chiết qua giấy lọc, gộp dịch chiết vào bình định mức 100 ml, định mức bằng MeOH đến vạch. Lọc dung dịch đã chuẩn bị ở trên qua màng lọc 0,45 µm và tiêm vào hệ thống phân tích HPLC.
- Điều kiện phân tích: sử dụng phương pháp HPLC đã được thẩm định [44], cố định được các điều kiện.
+ Cột sắc ký: Eclipse XDB – C18 (150 mm x 4,6 mm; 5 μm). + Detector: PDA.
+ Nhiệt độ cột: 25 ± 0,5oC. + Thể tích tiêm: 10 µl.
+ Hệ dung mơi: ACN : acid phosphoric 0,1%, tỷ lệ 60:40. Chương trình rửa giải đẳng dịng.
- Cách tiến hành:
+ Tính tương thích hệ thống:
Cân bằng cột bằng hỗn hợp pha động ít nhất 30 phút. Pha dung dịch chuẩn acid carnosic có nồng độ khoảng 200 μg/ml từ dung dịch chuẩn gốc (1000 μg/ml). Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn acid carnosic nồng độ 200 μg/ml vào hệ thống HPLC.
Yêu cầu: Hệ số bất đối của pic không được lớn hơn 2,0; số đĩa lý thuyết của cột không được nhỏ hơn 2000, độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic sau 6 lần tiêm lặp lại không được lớn hơn 2,0%.
+ Xây dựng đường chuẩn: Xây dựng phương trình tuyến tính của đường chuẩn rồi từ đó suy ra nồng độ chất trong mẫu thử.
Từ dung dịch chuẩn gốc acid carnosic có nồng độ 1000 µg/ml, tiến hành pha lỗng bằng dung mơi MeOH để có được dãy chuẩn với các nồng độ theo thứ tự là: 40, 50, 100, 200, 250 µg/ml.
Tiêm dung dịch chuẩn, mỗi nồng độ tiêm 3 lần, ghi lại sắc ký đồ và xác định đáp ứng của pic.
Tiêm mẫu thử, mỗi mẫu thử lặp lại 3 lần, ghi nhận sắc kí đồ và ghi lại đáp ứng với chất cần phân tích.
Tiến hành sắc kí theo điều kiện đã chọn ở mục 2.2.1.1 (b) và xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ dung dịch chất chuẩn. Xác định hệ số tương quan R2.
Yêu cầu: 0,99 ≤ R2 ≤ 1. + Tính kết quả:
Nồng độ acid carnosic chiết được từ dược liệu: Dựa vào đường chuẩn biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic, phương trình S = a × C +¿b.
Hàm lượng AC trong dược liệu được xác định dựa trên công thức: HL (%) = a xm ×(S−b)× V ×(100−h)100××1000000100
Trong đó: HL: Hàm lượng acid carnosic trong dược liệu (%). C: Nồng độ acid carnosic trong dung dịch thử. V: Thể tích dung dịch hịa tan mẫu thử (ml). m: Khối lượng dược liệu cân để chiết xuất (g). h: Hàm ẩm của dược liệu (%).
S: Diện tích pic acid carnosic (µV*s). a: Hệ số góc của đường chuẩn.
b: Hệ số chắn của đường chuẩn.
2.2.1.2. Xây dựng phương pháp chiết xuất acid carnosic từ Hương thảo
a. Khảo sát các dung môi chiết xuất:
- Nguyên liệu Hương thảo sau khi thu được rửa sạch, sấy khô đến khi hàm ẩm nhỏ hơn 10%, xay nhỏ. Đóng gói ngun liệu trong bao bì kín cho đến khi sử dụng.
- Chuẩn bị dung dịch thử:
+ Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,5g dược liệu Hương thảo cho vào bình nón 50ml, chiết siêu âm với 15 ml dung môi chiết (lần lượt là EtOH50%, EtOH75%, EtOH 96%) trong 40 phút, số lần chiết 2 lần. Gạn, lọc, gộp dịch chiết vào bình định mức 100 ml, định mức bằng dung môi chiết đến vạch. Lọc dung dịch đã chuẩn bị ở trên qua màng lọc 0,45 µm. Chuẩn bị 3 mẫu. Tiến hành định lượng trên hệ thống HPLC để tính hàm lượng acid carnosic.
- Với mỗi độ cồn trên, thực hiện chiết xuất 3 mẫu, rồi sử dụng phương pháp HPLC theo quy trình ở mục 2.2.1.1 (b) để tìm dung mơi chiết xuất tối ưu.
- Hàm lượng AC trong dược liệu được xác định dựa trên công thức: HL (%) = a xm ×(S−b)× V ×(100−h)100××1000000100
Trong đó: HL: Hàm lượng acid carnosic trong dược liệu (%).
C: Nồng độ acid carnosic trong dung dịch thử (μg/ml). V: Thể tích dung dịch hịa tan mẫu thử (ml).
m: Khối lượng dược liệu cân để chiết xuất (g). h: Hàm ẩm của dược liệu (%).
S: Diện tích pic acid carnosic (µV*s). a: Hệ số góc của đường chuẩn.
b: Hệ số chắn của đường chuẩn.
Bảng 2.3. Các thông số khảo sát lựa chọn dung môi chiết xuất AC từ Hương thảo Dung môi Thời gian chiết xuất Số lần chiết xuất Tỷ lệ DM/DL EtOH 50% 40 phút/lần 2 15/1 EtOH 75% 40 phút/lần 2 15/1 EtOH 96% 40 phút/lần 2 15/1
b. Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp chiết xuất Hương thảo:
Sau khi lựa chọn được dung môi chiết xuất ta tiến hành khảo sát phương pháp:
- Chuẩn bị mẫu thử:
+ Chiết xuất siêu âm (phương pháp 1):
Cân chính xác khoảng 0,5g dược liệu Hương thảo cho vào bình nón 50ml, chiết siêu âm với 15 ml EtOH 96% trong 40 phút, số lần chiết 2 lần. Gạn, lọc, gộp dịch chiết vào bình định mức 100 ml, định mức bằng EtOH 96% đến vạch. Lọc dung dịch đã chuẩn bị ở trên qua màng lọc 0,45 µm. Chuẩn bị 3 mẫu. Tiến hành định lượng trên hệ thống HPLC để tính hàm lượng acid carnosic.
+ Chiết xuất hồi lưu (phương pháp 2):
Cân chính xác khoảng 0,5g dược liệu Hương thảo cho vào bình cầu có nút mài 50ml, chiết hồi lưu 2 lần, mỗi lần sử dụng 15ml EtOH 96% trong 40 phút kể từ lúc sôi. Gạn, lọc, gộp dịch chiết vào bình định mức 100 ml, định mức bằng EtOH 96% đến vạch. Lọc dung dịch đã chuẩn bị ở trên qua màng lọc 0,45 µm.
Chuẩn bị 3 mẫu. Tiến hành định lượng trên hệ thống HPLC để tính hàm lượng acid carnosic.
- Các tiến hành tương tự như phần 2.2.1.1 (b)
- Hàm lượng AC trong dược liệu được xác định dựa trên công thức: HL (%) = a xm ×(S−b)× V ×(100−h)100××1000000100
Trong đó: HL: Hàm lượng acid carnosic trong dược liệu (%).
C: Nồng độ acid carnosic trong dung dịch thử (μg/ml). V: Thể tích dung dịch hịa tan mẫu thử (ml).
m: Khối lượng dược liệu cân để chiết xuất (g). h: Hàm ẩm của dược liệu (%).
S: Diện tích pic acid carnosic (µV*s). a: Hệ số góc của đường chuẩn.
b: Hệ số chắn của đường chuẩn.
Bảng 2.4 . Các thông số khảo sát lựa chọn phương pháp chiết xuất CA từ Hương thảo PP chiết xuất Dung môi Thời gian chiết Số lần chiết Tỷ lệ DM/DL
Siêu âm EtOH
96%
40 phút/lần
2 15/1
Hồi lưu EtOH
96%
40 phút/lần
2 15/1
Yêu cầu: Lựa chọn phương pháp chiết có hiệu suất chiết AC cao nhất.
2.2.1.3. Xây dựng phương pháp phân lập, tinh chế acid carnosic từ cây Hương thảo
Để phân tích, phân tách cũng như tinh chế acid carnosic từ dược liệu Hương thảo, ta sử dụng phương pháp HPLC điều chế.
- Chuẩn bị mẫu thử:
Cân chính xác khoảng 1g cắn vào cốc có mỏ 10ml, hịa tan cắn trong lượng tối thiểu dung dịch MeOH.
- Điều kiện phân lập:
+ Cột sắc ký: YMC Pack ODC - A (250 mm x 10 mm; 5 μm). + Detector: PDA.
+ Nhiệt độ cột: 25 ± 0,5oC. + Thể tích tiêm: 100 µl.
+ Bước sóng định lượng: 230 nm.
+ Hệ dung môi: ACN : acid phosphoric 0,1%, tỷ lệ 60:40. Chương trình rửa giải đẳng dịng.
- Cách tiến hành:
+ Tiến hành phân lập acid carnosic bằng phương pháp HPLC điều chế với điều kiện phân lập trên, dung dịch chuẩn tương tự như mục 2.2.1.1 (b).
+ Phương pháp hứng mẫu: Khi pic chất cần phân lập bắt đầu xuất hiện, tiến hành hứng dịch theo sự xuất hiện của pic. Gộp dịch của pic chất cần phân lập lại, cô thu hồi dung môi đến áp suất giảm ta được sản phẩm tinh chế (SPTC)
Cơng thức tính hiệu suất của q trình từ Hương thảo tạo ra sản phẩm tinh chế (SPTC) theo quy trình xây dựng:
HSPTC = mSPTC
mHươngthảo × 100% Trong đó:
H : hiệu suất của q trình từ Hương thảo tạo ra sản phẩm tinh chế acid carnosic (%).
mSPTC : khối lượng SPTC thu được (g).
mHương thảo : khối lượng Hương thảo sử dụng (g).
2.2.2. Bước đầu đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của chất đối chiếuacid carnosic acid carnosic
2.2.2.1. Tính chất
Tính chất của sản phẩm tinh chế được quan sát bằng mắt thường dưới ánh sáng ban ngày. Tính chất cảm quan phải phù hợp với nhận dạng của các tài liệu đã cơng bố.
2.2.2.2. Định tính
- Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
+ Tiến hành sắc ký lớp mỏng dung dịch thử song song với dung dịch chuẩn trên cùng một bản mỏng. Trên sắc ký đồ, dung dịch thử phải có vết cùng màu và cùng giá trị Rf với dung dịch chuẩn.
- Định tính bằng dữ liệu phổ
+ Sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D- NMR) :1H-NMR,
13C-NMR.
+ So sánh với phổ của mẫu chuẩn ghi song song cùng điều kiện hoặc với phổ đối chiếu trong các dữ liệu thu được từ thực nghiệm và các dữ liệu đã công bố.
2.2.2.3. Định lượng acid carnosic tinh chế được bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.
Tiến hành định lượng bằng phương pháp HPLC với điều kiện phân tích và dung dịch chuẩn như ở mục 2.2.1.1 (b).
- Chuẩn bị dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 5 mg SPTC vào bình định mức 5ml, hịa tan và bổ sung vừa đủ đến vạch bằng MeOH. Sau đó, pha
lỗng bằng MeOH thành dung dịch có nồng độ khoảng 200 μg/ml. Tiến hành định lượng bằng hệ thống HPLC.
- Cơng thức tính hàm lượng hợp chất chính trong SPTC: HL (%) = (S−b m×1000)× V × n ×100
Trong đó:
a: Hệ số góc của đường chuẩn. b: Hệ số chắn của đường chuẩn.
V: Thể tích dung dịch hịa tan SPTC (ml). n: Hệ số pha loãng.
m: Khối lượng SPTC dùng pha dung dịch thử (mg). HL: Hàm lượng acid carnosic tính theo phần trăm (%). S: Diện tích pic của mẫu thử (µV*s).
2.2.2.5. Xác định tạp chất liên quan
- Phương pháp: Sử dụng HPLC để xác định cụ thể số lượng tạp chất và tính gần đúng tỷ lệ tạp chất dựa trên tỉ lệ phần trăm diện tích pic.
- Tiến hành:
+ Điều kiện sắc ký như mục định lượng, thời gian chạy sắc ký phải gấp 2 đến gấp 3 lần thời lưu của pic chính thu được trong SKĐ của mẫu thử.
+ Tiêm vào hệ thống sắc ký lần lượt các dung dịch: mẫu trắng, mẫu thử. - Cơng thức tính hàm lượng tạp chất gần đúng theo tỷ lệ diện tích pic khi áp dụng phương pháp HPLC:
Ctạp % = Stạp
∑Spic× 100
Trong đó: Ctạp %: tỉ lệ phần trăm tạp chất trong mẫu phân tích. Stạp : diện tích pic tạp chất (µV*s).
∑Spic : tổng diện tích pic (µV*s). 2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÍ SỐ LIỆU
Các số liệu được xử lý bằng thuật toán thống kê và phần mềm Microsoft Excel 2016.
2.4. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền – Viện Đào tạo Dược, Học viện Quân Y.
Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Viện nghiên cứu y dược học quân sự – Học viện Quân Y.
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT, PHÂNLẬP VÀ TINH CHẾ ACID CARNOSIC TỪ DƯỢC LIỆU HƯƠNG THẢO LẬP VÀ TINH CHẾ ACID CARNOSIC TỪ DƯỢC LIỆU HƯƠNG THẢO
3.1.1. Kết quả xây dựng phương pháp định lượng acid carnosic từdược liệu Hương thảo dược liệu Hương thảo
3.1.1.1. Kết quả xác định hàm ẩm của dược liệu Hương thảo
Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả xác định hàm ẩm dược liệu Hương thảo
STT Khối lượng
(g) Hàm ẩm (%)
1 3,012 6,09
2 3,008 6,08
X ± SD 6,07 ± 0,03
RSD (%) 0,49
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy rằng hàm ẩm của dược liệu Hương thảo là 6,07 ± 0,03 %.
3.1.1.2. Kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng acid carnosic từ dược liệu Hương thảo
Chuẩn AC có độ tinh khiết 98%, trong quá trình cân, khối lượng mẫu chuẩn đã cân là 0,0051g. Kết quả thu được như sau:
- Tính tương thích hệ thống
Bảng 3.2. Kết quả xác định tính tương thích của hệ thống HPLC M ẫu N ồng độ (µg/m) Diện tích pic (µV*s) Thời gian lưu (phút) Số đĩa lý thuyết Hệ số bất đối xứng 1 1 99,92 2412450 11,002 2814 1,05 2 1 99,92 2391087 11,340 2834 1,06 3 1 99,92 2392042 11,570 2876 1,07 4 1 99,92 2412078 11,105 2809 1,04 5 1 99,92 2432486 11,019 2840 1,09 6 1 99,92 2433441 11,273 2823 1,07 ´ X ± SD 2412264± 16905,91 11,218 ±0,201 2832 ±22,12 1,06 ±0,02 RSD (%) 0,771 1,79 0,78 1,57
- Nhận xét: Kết quả bảng 3.2 cho thấy các thơng số về diện tích pic, thời gian lưu cũng như số đĩa lý thuyết đều đạt như yêu cầu đề ra. Như vậy, hệ thống sắc ký là phù hợp với mẫu phân tích.
- Khoảng tuyến tính
Bảng 3.3. Sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ acid carnosic
ST
T Nồng độ chuẩn AC (µg/ml)
Diện tích pic (µV*s)
1 39,98 173442
2 49,8 344567
3 99,96 958656
4 199,92 2412264
5 249,9 3090763
- Kết quả bảng trên được minh họa rõ hơn dưới dạng đồ thị ở hình 3.1
0 50 100 150 200 250 300 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 f(x) = 13897.4191747437 x − 382208.588570108 R² = 0.999457934959817 Nồng độ (µg/ml) Di ện tí ch p ic (µ V* s)
Hình 3.1: Tương quan giữa diện tích pic và nồng độ acid carnosic
Trong khoảng nồng độ khảo sát (39,98 – 249,9 µg/ml) có sự phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích. Phương trình hồi quy là y = 13897x – 382209 với hệ số tương quan R2 = 0,9995. Như vậy, đường chuẩn đã xây dựng đáp ứng các yêu cầu của phương pháp phân tích định lượng bằng HPLC.
3.1.2. Kết quả xây dựng phương pháp chiết xuất acid carnosic từHương thảo Hương thảo
3.1.2.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết xuất
+ Tiến hành khảo sát các loại dung môi gồm: EtOH 50%, 75% và 96% cùng với các thông số lựa chọn như sau: phương pháp chiết siêu âm, tỷ lệ dung môi/dược liệu 15/1, chiết 2 lần với thời gian chiết là 40 phút/lần. Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Bảng khảo sát ảnh hưởng dung môi chiết xuất
M ẫu
Hiệu suất chiết acid carnosic từ dược liệu Hương thảo (%)
EtOH 50% EtOH 75% EtOH 96%
Sp ic (µV*s) H (%) Sp ic (µV*s) H (%) Spi c (µV*s) H (%) 1 84 2586 1 ,88 97 3246 2,07 211 3276 3,82 2 83 4774 1 ,76 99 6425 2,18 211 7521 3,87 3 85 9231 1 ,92 96 1357 2,12 212 4783 3,94 X ± SD - 1 ,85 ±0,07 - 2,12 ±0,04 - 3,88 ±0,05 R SD (%) - 0 ,04 - 0,02 - 0,01
Từ kết quả của bảng 3.4 cho thấy: Khi sử dụng EtOH 50% là dung môi chiết xuất thì hiệu suất chiết đạt được là khá thấp (1,85%). Tiến hành thay đổi dung môi từ nước thành EtOH 75% - EtOH 96% thì hiệu suất chiết tăng đáng kể. Hiệu suất chiết là khác nhau ở mỗi nồng độ ethanol khác nhau, hiệu suất đạt cao nhất khi chiết bằng EtOH 96% với giá trị là 3,88 %. Vì vậy, EtOH 96% được lựa