Hình 64: Hình ảnh khuẩn lạc chủng Cbt3F01 trên thạch Brucella
Hình 86: Hình ảnh khuẩn lạc chủng Cbt3F01 trên thạch EYA 3.5. Kết quả giải trình gen
Đề tài tiến hành giải trình tự đoạn gen độc tố của chủng phân lập từ thực phẩm pate chay mã số Cbt3F01. Kết quả thu được:
Trình tự nucleotide gen độc tố A: TTAGTATATGATTTTACCGATGAACTAGCGAAGTAAGTACTACGGATAA AATTGCGGATATAACTATAATTATTCCATATATAGGACCTGCTTTAAATA TAGGTAATATGTTATATAAAGATGATTTTGTAGGTGCTTTAATATTTTCA GGAGCTGTTATTCTGTTAGAATTTATACCAGAGATTGCAATACCTGTATT AGGTACTTTTGCACTTGTATCATATATTGCGAATAAGGTTCTAACCGTTC AAACAATAGATAATGCTTTAAGTAAAAGAAATGAAAAATGGGATGAGG TCTATAAATATATAGTAACAAATTGGTTAGCAAAGGTTAATACACAGAT TGATCTAATAAGAAAAAAAATGAAAGAAGCTTTAGAAAATCAAGCAGA AGCAACAAAGGCTATAATAAACTATCAGTATAATCAATATACTGAGGAA GAGAAAAATAATATTAATTTTAATATTGATGATTTAAGTTCGAAACTTA ATGAGTCTATAAATAAAGCTATGATTAATATAAATAAATTTTTGAATCA ATGCTCTGTTTCATATTTAATGAATTCTATGATCCCTTATGGTGTTAAAC GGTTAGAAGATTTTGATGCTAGTCTTAAAGATGCATTATTAAAGTATAT
ATATGATAATAGAGGAACTTTAATTGGTCAAGTAGATAGATTAAAAGAT AAAGTTAATAATACACTTAGTACAGATATACCTTT
So sánh trình tự nucleotide gen độc tố A của chủng phân lập với chủng C.botulinum ATCC 25763 (ID: EF028391.1); Chủng C. botulinum ATCC 19397 (ID:
CP000726.1) và nhiều chủng khác trên ngân hàng genbank đều cho độ chính xác
Identities từ 99.86 - 100%
Trình tự nucleotide gen độc tố B
TTAGATGAAAATGAGACTATAGCTATAGGTATACAAAATCATTTTGCAT CAAGGGAAGGCTTCGGGGGTATAATGCAAATGAAGTTTTGCCCAGAATA TGTAAGCGTATTTAATAATGTTCAAGAAAACAAAGGCGCAAG
So sánh trình tự nucleotide gen độc tố B của chủng phân lập với chủng C. botulinum CDC 69094 (ID: CP013246.1); Chủng C. botulinum CDC28184 (ID:
FJ981690.1) và nhiều chủng khác trên ngân hàng genbank đều cho độ chính xác từ
98.57 - 100%.
Đề tài cũng tiến hành giải trình tự tồn bộ hệ gen vi khuẩn chủng phân lập từ pate chay mã số Cbt3F01. Dữ liệu thô thu được từ máy miseq (file raw) sẽ được gửi lên hệ thống NCBI Sequence Read Archive (SRA, accession number: PRJNA762208). Các đoạn ngắn DNA được thực hiện lắp ráp bằng phần mềm Spades phiên bản 3.1.2 với các thông số là "careful", và chế độ đọc tự động “auto”, cài đặt hệ số k- mer =77. Các gen sau đó đánh dấu bằng phần mềm DDBJ Fast Annotation and Submission Tool (có sẵn trên website https://dfast.ddbj.nig.ac.jp/). Sự liên kết gene cốt lõi (Core gene alignments) được thực hiện bằng phần mềm Roary v.3.13.0 với các tùy chọn “-i 80” và “-e --mafft” [9 . Kết quả thu được từ phần mềm Roary sẽ được dùng để vẽ cây phả hệ toàn bộ hệ gen bằng phần mềm IQ- tree v.2.1.2 với kiểu tỉ lệ 1/1000.
Hình 17: Cây phả hệ chủng Cbt3F01 so với các chủng C. botulinum nhóm I, II, III III
Hình 18: Cây phả hệ chủng Cbt3F01 so với các chủng C. tobulinum nhóm I
Kết quả phân tích cho thấy chủng Cbt3F01 vi khuẩn C. botulinum, sequence type ST15, chiều dài chromosome chủng Cbt3F01 là 3822371bp. Chủng có mối quan hệ gần gũi với các chủng C. botulinum NCTC 2916; ATCC 3502 và ATCC
19397 (hình 17, 18)
Dữ liệu giải trình tự tồn bộ hệ gen vi khuẩn chủng Cbt3F01 cũng đã được upload lên ngân hàng gen tại đường link:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA762208 Mã xác định của chủng trên genbank là PRJNA762208.
Các thông tin mô tả gồm: SRX12130100 - WGS C.botulinum isolated from
home-canned food
1 ILLUMINA (Illumina MiSeq) run: 1.1M spots, 255.1M bases, 142.8Mb downloads
Design: DNA from the Cbt3F01 strain was extracted from overnight culture using DNeasy Blood and Tissue Kit. Whole-genome sequencing using the NEBNext Ultra DNA Library Prep kit for Illumina (New England Biolabs) was performed using the MiSeq machine.
Submitted by: National Institute of Hygiene and Epidemiology Study: Botulism food poisoning in Vietnam
PRJNA762208 • SRP336489 • All experiments • All runs show Abstract Sample: Vegeterian Pate (food)
SAMN21380365 • SRS10110219 • All experiments • All runs Organism: Clostridium botulinum
Library:
Name: C.botulinum_run2 Instrument: Illumina MiSeq Strategy: WGS
Source: GENOMIC
Selection: size fractionation Layout: PAIRED
CHƢƠNG IV: BÀN LUẬN
Trung bình mỗi năm ở Hoa Kỳ có 70-100 trường hợp ngộ độc thịt được báo cáo. Khoảng 25% trường hợp bị ngộ độc thịt do thực phẩm và 72% bị ngộ độc thịt đường ruột ở trẻ sơ sinh [41, 44 . Từ năm 1976, trên 1500 ca bệnh ngộ độc thịt trẻ em được báo cáo ở hơn 15 quốc gia. Trong số những nguồn tiềm ẩn nha bào C. botulinum khác nhau như bùn đất, cát thì mật ong là nguồn thực phẩm liên quan tới
bệnh ngộ độc thịt. Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh nha bào C. botulinum có
mặt tự nhiên trong một số mẫu mật ong [37, 38, 40 . Các nghiên cứu trên thế giới đã báo cáo tỉ lệ phát hiện nha bào C. botulinum trong mật ong rất khác nhau trong
khoảng từ 1,3-30,6% tùy địa điểm thực hiện và quy mô nghiên cứu [7, 22, 28, 38, 40, 41 . Nhìn chung, kết quả đều cho thấy nồng độ nha bào trong mẫu mật ong thấp (1 nha bào/gam). Một số mẫu có nồng độ cao hơn (36-60 nha bào/gam) do vi khuẩn nhân lên trong xác ong và tổ ong [7, 27 . Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, mức độ nhiễm nha bào C. botulinum phụ thuộc vào vùng thu hoạch và tình trạng vệ sinh
trong cả quá trình thu hoạch mật ong [7, 28 . Hầu hết các yếu tố ảnh hưởng đến sự có mặt của nha bào C. botulinum là: kích thước thùng chiết, khơng thay ủng khi đi từ ngồi vào phịng tách chiết, điều kiện nơi rửa tay trong phịng chiết và sự có mặt của C. botulinum trong mẫu đất [27 . Trong nghiên cứu của chúng tôi, với tổng số 129 mẫu mật ong thu thập được, chủ yếu từ các nguồn gia đình và mua ở siêu thị, chỉ có 10 mẫu (chiếm 7,8%) mua trực tiếp từ các trại ni ong do chi phí thu thập mẫu tại trang trại ni ong khá cao, khó tiếp cận chủ trang trại vì vậy việc tìm hiểu và xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sự hiện diện của nha bào là không khả thi.
Trong q trình ni cấy phân lập C. botulinum, tất cả các mẫu đều phải thực
hiện 4 quy trình ni cấy (1 mẫu gốc và 1 mẫu sau làm giàu ủ kỵ khí ở nhiệt độ phòng 25-260C; 1 mẫu gốc và 1 mẫu sau làm giàu trong tủ kỵ khí 370C) nên khá tốn kém cơng sức và ngun vật liệu, vì trong mẫu có thể có cả C. botulinum nhóm I và nhóm II, nhóm I sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 370C nhưng nhóm II lại sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 250C. Nghiên cứu này sử dụng môi trường EYA để phân lập C. botulinum từ mẫu mật ong. Hầu hết các mẫu mật ong khi cấy trên EYA đều âm tính vi khuẩn,
số ít mẫu mọc vi khuẩn khác, lipase âm tính, khuẩn lạc mềm. Có 5 mẫu có khuẩn lạc thơ ráp, mọc lan, lipase dương. Tuy nhiên kết quả PCR xác định gen sinh độc tố của các mẫu này với các mồi đặc hiệu gen độc tố A, B, C, D, E, F đều cho kết quả âm tính. Khuẩn lạc của 2 mẫu mật ong mã CHB 39 và CHB 175 có phản ứng lipase dương tính trên mơi trường EYA và hình thái khuẩn lạc mọc lan, thô ráp, bờ không đều giống C. botulinum. Kết quả định danh bằng xác định tính chất sinh vật hóa học có độ tin cậy từ 75 – 95% nhưng kết quả PCR 2 mẫu này lại âm tính với các gen độc tố A, B, C, D, E, F.
Kết quả nghiên cúu không phân lập được chủng C. botulinum mang gen sinh độc tố từ mẫu mật ong. Tuy nhiên đề tài cũng đã kiểm chứng quy trình ni cấy bằng cách trộn các nồng độ khác nhau vi khuẩn C. botulinum độc tố B phân lập từ bùn đất vào mẫu mật ong âm tính và tiến hành ni cấy. Quy trình đã thành cơng khi phát hiện được C. botulinum ở nồng độ 103
cfu/ml. Điều này chứng tỏ quy trình phân lập C. botulinum từ mẫu mật ong mà đề tài áp dụng là đạt yêu cầu.
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng hai nguồn nha bào C. botulinum tiềm ẩn quan trọng nhất là mật ong và bùn đất. Sự tích tụ C. botulinum trong đất là do sự đào thải nha bào vi khuẩn từ đường tiêu hóa của người, động vật, chim và cá. Lịch sử các nghiên cứu giám sát khẳng định rằng sự hiện diện của C. botulinum rất phổ biến trong đất với tỉ lệ phân lập khác nhau dao động từ 9,6-23,5% tùy từng vùng địa lí [10, 12, 21, 30, 37 . C. botulinum thường tìm thấy phổ biến ở mẫu đất và cặn bùn. Một vài nghiên cứu về giám sát đất tại Mĩ nhằm phát hiện C. botulinum
độc tố A, B, C, D và E cho thấy C. botulinum độc tố A tìm thấy chủ yếu ở phía tây sơng Mississippi và độc tố B thì phổ biến ở phía Đơng. Chủng độc tố F lại được phân lập từ cặn biển Pacific và từ cua ở vịnh Chesapeake. Ngồi ra, có mối liên hệ chặt chẽ giữa sự phân bố các loại độc tố của C. botulinum và độc tố gây bệnh ngộ độc thịt trẻ sơ sinh. Ở Mĩ, ngộ độc thịt trẻ sơ sinh type A tìm thấy chủ yếu ở phía Tây sông Mississippi, trong khi những ca bệnh mang type B lại phổ biến ở phía Đơng. Ví dụ như tỉ lệ ngộ độc thịt trẻ sơ sinh type B khá cao ở vùng Đông Nam Pennsylvania (43/44 ca) [37].
Một số nghiên cứu trong nước cũng đã phân lập được vi khuẩn C. botulinum
từ mẫu bùn đất quanh khu vực chăn nuôi vịt ở Cần Thơ [1, 2 . Tuy nhiên, nghiên cứu về sự phân bố vi khuẩn C. botulinum trong đất tại Việt Nam chưa có số liệu vì vậy nhóm nghiên cứu lựa chọn ngẫu nhiên 7 tỉnh thành phía Bắc để thu thập mẫu bùn đất. Chúng tôi đã chọn những vùng đất ẩm ướt, giàu chất hữu cơ, gần khu chăn ni quy mơ lớn là những vị trí có khả năng phân lập được C. botulinum để thu thập mẫu. Cũng như các mẫu mật ong và đồ hộp, khi xử lí mẫu đất, các mẫu này cũng đều được lặp lại ở 2 nhiệt độ ủ (nhiệt độ phịng và 370C). Khi ni cấy mẫu đất, đề tài sử dụng môi trường chọn lọc CBI cùng với bước sốc cồn mẫu trước khi nuôi cấy để diệt các vi khuẩn không sinh nha bào, ưu tiên cho nha bào C. botulinum sinh trưởng. Chúng tôi đã phân lập được 2 chủng C. botulinum đều mang gen độc tố B,
cả 2 chủng đều từ mẫu bùn đất ở Bắc Giang (mã số chủng CBGS 01 và CBGS 02). Hai chủng này đều có khuẩn lạc điển hình C. botulinum, đường kính 3 mm, bờ khơng đều, hơi dính, xám nhẹ và mọc lan, Catalase âm tính, phản ứng lipase dương tính, tạo bề mặt óng ánh như ngọc trai khi nghiêng đĩa thạch. Các kết quả định danh 2 chủng C. botulinum trên tương tự như các nghiên cứu khác đã báo cáo [13 . Môi trường bùn đất đủ độ ẩm, kỵ khí và giàu dinh dưỡng do đó C. botulinum dễ dàng phát triển, vì vậy chúng tơi đã phân lập được 2 chủng từ bùn đất mà không phân lập được chủng nào từ mẫu đất khô. Nghiên cứu tại Cần Thơ cho thấy đã phân lập được chủng C. botulinum độc tố E từ mẫu ruột vịt và bùn nơi chăn thả vịt, tuy nhiên kết quả của đề tài này chỉ phân lập được 2 chủng C. botulinum độc tố B từ mẫu bùn đất tại ruộng rau ở Bắc Giang. Việc phân lập được chủng C. botulinum có thể do Bắc Giang là một trong những vùng chăn nuôi quy mô lớn ở miền Bắc và việc tái sử dụng chất thải người, vật nuôi trong trồng trọt ở địa phương này khá phổ biến. Trong giai đoạn tới, nhóm nghiên cứu xem xét thu thập thêm mẫu đất tại các trang trại ni vịt ở miền Bắc để có thể phân lập thêm được chủng C. botulinum.
Ngộ độc thịt lây qua thực phẩm là dạng ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng do ăn phải thức ăn chứa độc tố thần kinh được tạo ra trong quá trình sinh trưởng của C.
botulinum. Những thực phẩm hút chân không và bảo quản lâu dài (đồ hộp, xúc xích,
hiện vi khuẩn trong mẫu môi trường và mẫu thực phẩm cũng như các thực phẩm tươi sống rất phức tạp do sự có mặt rất nhiều loại nha bào khác và/hoặc các độc tố chưa xác định được. Hơn nữa, việc phân lập vi khuẩn C. botulinum trong mẫu môi trường và mẫu thực phẩm cũng gặp nhiều hạn chế bởi sự có mặt của các chủng khơng sinh độc tố vì kiểu hình và kiểu gen giống C. botulinum. Khơng có quy trình, mơi trường cũng như nhiệt độ ủ tốt nhất cho các vi khuẩn C. botulinum sinh các loại độc tố khác nhau. Thông thường, sử dụng CMM và ủ ở 370C là môi trường làm giàu cho C. botulinum li giải protein, cịn mơi trường làm giàu cho C. botulinum không li giải protein là CMM bổ sung glucose, môi trường thịt băm tinh bột glucose hoặc TPGY và ủ ở 260
C. Việc cần thiết bổ sung lysozym (nồng độ 5 µg/ml hoặc tinh bột (0,1%) vào mơi trường làm giàu đã được khuyến cáo để kích thích sự nảy mầm của nha bào C. botulinum. Chúng tôi cũng thực hiện theo các hướng dẫn này và đã phân lập được 2 chủng C. botulinum mang gen độc tố A, B từ 2 hộp pate Minh Chay (1 hộp của bệnh nhân ở Hà Nội và 1 hộp của bệnh nhân ở Hà Giang). Đây là chùm ca bệnh ngộ độc thịt đầu tiên tại Việt Nam do ăn sản phẩm pate chay của Công ty TNHH Hai thành viên Lối sống mới Minh Chay.
Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn C. botulinum rất khó khăn. Cho đến nay vẫn chưa có sẵn mơi trường chọn lọc cho cả C. botulinum li giải protein và không li giải protein [7, 8,41 . Khó khăn nảy sinh từ đặc điểm sinh lí học khác nhau giữa chủng
C. botulinum nhóm I và II là việc lựa chọn chính xác nhiệt độ ủ. Nhiệt độ tối ưu cho
nhóm I sinh trưởng là 35-370C, trong khi đó nhiệt độ tối ưu cho nhóm II sinh trưởng là 25-300C. Nuôi cấy phân lập và định danh C. botulinum từ những mẫu có hệ vi
khuẩn chí cạnh tranh ở mức cao như mẫu đất mất rất nhiều thời gian và công sức. Hơn nữa việc phân lập chủng thuần từ canh thang cũng dễ bị thất bại và khơng thu được chủng. Chính vì vậy, chúng tơi đã lựa chọn cả 2 nhiệt độ ủ để tối ưu sự sinh trưởng cho cả 2 nhóm C. botulinum. Bên cạnh đó, nhằm hạn chế sự cạnh tranh của
các vi sinh vật khác, chúng tôi đã sử dụng cả phương pháp sốc cồn và nhiệt độ trước và sau khi nuôi cấy tăng sinh. Ngồi ra, chúng tơi đã thử nghiệm cả 2 loại môi trường làm giàu phổ biến là canh thang BHI và CMM đều cho kết quả tương đồng.
Kết quả định danh bằng bộ kit API 20A so sánh giữa chủng C. botulinum và chủng giống C. botulinum khơng có gen sinh độc tố cho thấy độ tương đồng các phản ứng sinh hóa cao. Hơn nữa phiên giả kết quả bằng ApiWeb cho thấy chủng giống C. botulinum phân lập từ mật ong mã CHB 39 được định danh là chủng giống
C. botulinum với độ tin cậy cao hơn (ID 97,1%) chủng C. botulinum mang gen sinh
độc tố phân lập từ pate (Cbt3F1, ID 96,5%) (bảng 3.6). Như vậy, nếu chỉ sử dụng đặc tính sinh vật hóa học khơng đủ để phân biệt được chủng C. botulinum và chủng giống C. botulinum. Điều này cũng đã được khẳng định bởi nghiên cứu của Lindström. M và cộng sự cho thấy chưa đến một nửa số chủng chứa gen xác định độc tố đặc hiệu của C. botulinum mặc dù đặc tính sinh vật hóa học tương tự nhau ở tất cả các chủng phân tích. Nghiên cứu này cũng báo cáo chủng C. botulinum AB
không thể hiện đặc tính sinh hóa điển hình của lồi như sổ tay của hệ thống Vi khuẩn học. Tuy nhiên kết quả của chúng tôi cho thấy chủng C. botulinum Cbt3F1 và Cbt21F18 mang gen độc tố A, B có đặc tính sinh hóa tương tự chủng C. botulinum CBGS 01 và CBGS 02 chỉ mang gen độc tố B. Kết quả của đề tài cũng
phù hợp với nghiên cứu của Lindström. M và cộng sự nhằm xác định đặc tính kiểu hình và kiểu gen của những chủng được phân loại ban đầu là C. botulinum, tác giả
cũng khẳng định rằng kit API 20A không thế phân biệt được chủng C. botulinum li giải protein và C. sporogenes [26]. So sánh giữa chủng C. botulinum và chủng giống C. botulinum cho thấy độ tương đồng các phản ứng sinh hóa cao. Đặc tính sinh vật hóa học khơng đủ để phân biệt được chủng C. botulinum và chủng giống C.
botulinum cũng đã được khẳng định bởi các tác giả khác [26, 39 . Tác giả cũng khuyến cáo phân loại kiểu gen hiệu quả nhất là sử dụng SmaI trong PFGE có thể
phân loại chính xác C. botulinum và chủng giống C. botulinum cũng như phân loại độc tố của C. botulinum. Vì vậy, chúng tơi tiến hành giải trình đoạn gen độc tố và
giải trình tự tồn bộ hệ gen vi khuẩn 1 chủng đại diện mang gen sinh độc tố A và B. Kết quả khi so sánh trình tự thu được với các chủng C. botulinum ATCC 25763
(ID: EF028391.1); Chủng C. botulinum ATCC 19397 (ID: CP000726.1) và nhiều
chủng khác trên ngân hàng genbank đều cho độ chính xác Identities từ 99.86 - 100%. Trình tự gen độc tố B khi so sánh với chủng C. botulinum CDC 69094