Hàng trên: màu sắc các phản ứng sinh hóa dƣơng tính. Hàng dƣới: màu sắc các phản ứng sinh hóa âm tính của kit sinh hóa Api 20A (nguồn: https://www.biomerieux-
usa.com/clinical/api)
Phiên giải kết quả: sử dụng phần mềm apiwebTM để phiên giải kết quả định danh vi sinh vật bằng tính chất sinh vật hóa học.
Ví dụ: Dãy số 4232 602 3 tương ứng kết quả định danh là C.septicum độ tin cậy 99.99%.
2.3.3.6 Kỹ thuật PCR phát hiện gen độc tố
Tách DNA bằng phƣơng pháp nhiệt
Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn, hịa tan trong 200µl đệm TE. Ủ nhiệt khơ 950C trong 15 phút. Ly tâm 14.000 vòng/2 phút. Lấy nước nổi làm DNA khn mẫu. DNA có thể sử dụng ngay hoặc bảo quản ở -200
C.
Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng PCR
Lấy các thành phần của hỗn hợp phản ứng PCR từ -200C ra, để vào khay lạnh hoặc để ở ngăn mát tủ lạnh hoặc hộp đá vụn đến khi tan hoàn toàn, trộn đều bằng cách búng nhẹ vào đáy tube và ly tâm ngắn trước khi mở nắp. Khi sử dụng nên trộn đều các thành phần 2 – 3 lần bằng pipet.
Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng PCR gồm các thành phần theo bảng 2.1, trộn đều, ly tâm ngắn sau đó chia 18µl hỗn hợp phản ứng PCR vào các tube PCR 0.2ml.
Bảng 2 .1 thành phần phản ứng PCR Thành phần Thành phần PCR 1x(µl) Nồng độ cuối cùng PCR Master Mix 2x 10 1x Mồi xi 20µM 0.6 0,3 µM Mồi ngược 20µM 0.6 0,3 µM MgCl2 25mM 0.8 2,5 mM
Nước tinh khiết 6.0
DNA khuôn 2
Bổ sung DNA mẫu và chạy phản ứng PCR
Tra DNA mẫu vào hỗn hợp phản ứng PCR được tiến hành trong tủ an toàn sinh học cấp 2 chuyên dùng để tra DNA. Hỗn hợp thành phần phản ứng PCR sau khi bổ sung DNA mẫu được ly tâm ngắn trước khi đưa vào máy PCR. Chu trình nhiệt: 940
C (5 phút), 35 chu kì: 940C (30 giây), 600C (30 giây), 720C (1 phút), 720C (3 phút), giữ 150C. Điện di sản phẩm trên thạch Agarose nồng độ 1,5%, điện trường 100V trong thời gian 30 phút.
Phân tích kết quả PCR
Mẫu chứng âm (nước cất tinh sạch) không được lên vạch DNA nào, nếu thấy vạch là phản ứng PCR đã bị nhiễm và phải thực hiện lại kỹ thuật. Các mẫu được xác định dương tính khi xuất hiện các vạch có kích thước tương ứng với gen độc tố. Các mẫu khơng có vạch hoặc có vạch khơng đúng kích thước gen độc tố được coi là âm tính.
2.3.3.7 Kỹ thuật giải trình tự tồn bộ hệ gen vi khuẩn
Nguyên lý: DNA tổng số của vi khuẩn được cắt nhỏ thành các mảnh (kích thước trung bình từ 200 – 400bp), các index ngắn sau đó được nối vào 2 đầu của mỗi mảnh DNA. Các index này sẽ làm trình tự mồi cho emPCR và giải trình tự.
Quy trình giải trình tự bằng cơng nghệ Illumina NGS gồm 3 bước thực hiện cơ bản:
Bước 1: Chuẩn bị DNA tổng số của vi khuẩn Bước 2: Chuẩn bị thư viện (library preparation) Bước 3: Chạy máy giải trình tự Illumina-Miseq
Các bƣớc tiến hành:
Bƣớc 1: Chuẩn bị DNA tổng số của vi khuẩn
Tách DNA tổng số của vi khuẩn bằng kit QIAamp DNA Mini Kit
Lấy đầy 1 que cấy 10µl vi khuẩn hịa đều vào 200µl đệm AE. Ly tâm 13.000 vịng/10 phút để loại bỏ nước nổi, thu cặn vi khuẩn. Trộn đều cặn vi khuẩn trong 180µl dung dịch đệm ALT. Nhỏ 20µl protein K trộn đều bằng máy trộn voltex. Ủ 560C/1 giờ trong máy ủ nhiệt đến khi vi khuẩn ly giải hoàn toàn (dung dịch đệm trong, không nhầy). Trộn đều bằng máy trộn voltex trong 15 giây, nhỏ 200µl dung dịch đệm AL, trộn đều sau đó nhỏ 200µl cồn tuyệt đối và trộn đều. Hút toàn bộ hỗn hợp nhỏ vào cột DNeasy Mini spin coumn, ly tâm 8000 vòng x 1 phút. Rửa cột bằng cách nhỏ 500µl dung dịch đệm AW1, ly tâm 8000 vòng x 1 phút. Rửa lần 2 bằng 500µl dung dịch AW2, ly tâm 14000 vòng x 3 phút. Chuyển cột sang tube 1.5ml sạch mới, nhỏ 200µl dung dịch đệm AE vào trung tâm cột, để DNA ly giải ở nhiệt độ phòng 5 phút, ly tâm 8000 vòng x 2 phút thu DNA tổng số.
Chuẩn hóa nồng độ đầu vào của DNA tổng số bằng kit Nextera XT DNA Library Preparation Kit
Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ tương đối của DNA sau khi tách bằng đo Nanodrop: Sử dụng 2ul mẫu DNA của từng mẫu sau khi tách để đo Nanodrop; giá
trị tỉ số 260/280 từ 1,8-2,0 là đạt yêu cầu về độ tinh sạch của DNA đầu vào cho quá trình giải trình tự. Nếu nồng độ DNA quá thấp (dưới 50ng/ul) cần tách lại mẫu và tăng lượng tế bào vi khuẩn. Sau đó xác định lại nồng độ DNA của mẫu bằng kit Qubit dsDNA HS và pha loãng DNA mẫu về nồng độ 3.5 ng/ul.
Bƣớc 2: Chuẩn bị thƣ viện
Tagmentation: DNA tổng số của vi khuẩn được cắt ngẫu nhiên thành đoạn
nhỏ bằng ezyme. Rã đông các sinh phẩm ATM, TD and DNA tổng số, để trên khay inox đông lạnh. NT đưa về nhiệt độ phòng. Đảo tube 3-5 lần rồi spin down. Trộn các thành phần sau vào ống PCR:
5μl TD buffer
3μl mẫu DNA (0.2ng/μl) 2.5μl ATM
Trộn đều bằng pipet, ly tâm ngắn mẫu sau khi trộn. Ủ mẫu ở 55 o
C/ 5 phút. Sau đó nhỏ 2,5μl đệm NT vào từng ống PCR. Đảo trộn hỗn hợp bằng pipet 5 lần rồi ly tâm ngắn. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
PCR index: hai đầu 3’ và 5’ của các đoạn DNA được gắn adapter và index để
nhận dạng. Các đoạn DNA đã gắn adapter được khuếch đại thông qua phản ứng PCR và sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch