Tinh sạch sản phẩm PCR index: Rã đông sinh phẩm AMPure beads ở nhiệt
độ phòng 30 phút và vortex kỹ trước khi dùng. Chuyển tất cả 25 μl sản phẩm PCR index sang tube mới đã có 45 μl AMPure và lắc 1200rpm/ phút trong 5 phút. Sau đó ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút. Đặt lên giá từ 2 phút cho đến khi dung dịch trong suốt. Loại bỏ phần nước trong nhưng không chạm vào bead. Đặt tube trên giá từ, rửa bead bằng 180 μl cồn 80% 2 lần sau đó để khơ trong vịng 5 – 10 phút. Ly giải và thu hồi DNA tinh sạch khỏi hạt từ bằng 26.5μl sinh phẩm RSB.
Đồng đều hóa nồng độ mẫu
Điện di sản phẩm PCR sau tinh sạch trên agarose gel 1% trong vòng 1 giờ ở điện trường 100v để xác định kích thước trung bình của thư viện.
Đo nồng độ DNA từng mẫu bằng Qubit sử dụng bộ kit ssDNA Assay. Sau đó tính tốn nồng độ theo cơng thức:
Pha lỗng nồng độ mẫu về cùng nồng độ 4nM.
Gộp mẫu và xác định nồng độ của thƣ viện: Sử dụng 10 μl mẫu nồng độ
4nm, gộp các mẫu của cùng 1 lần giải trình tự vào trong cùng 1 tube. Xác định lại nồng độ của thư viện bằng Qubit. Tính lại nồng độ sau đó pha lỗng về nồng độ sử dụng.
Pha loãng thƣ viện về nồng độ sử dụng
Nồng độ cuối cùng của thư viện khi đưa vào máy giải trình tự tùy thuộc từng bộ kit, ví dụ bộ Miseq 300V2: nồng độ mẫu pool từ 10-12 pM. Từ nồng độ tính tốn được ở trên cùng với nồng độ cần sử dụng/từng bộ kit, tính mức độ cần pha loãng mẫu pool với dung dịch HT1 để được tổng thể tích là 600μl
Biến tính mẫu: ủ 600μl thư viện ở 96 oC trong 2 phút. Sau đó chuyển ngay mẫu sang đá và giữ trên đá 5 phút.
Bƣớc 3: Chạy máy giải trình tự Illumina-Miseq
Q trình chạy máy bắt đầu bằng việc tạo khóm (cluster) trên follow cell: Các đoạn DNA trong thư viện được gắn cố định trên bề mặt của flowcell thông qua liên kết được hình thành giữa các oligo trên bề mặt flowcell với adapter. Mỗi đoạn DNA sau đó được nhân lên nhiều lần thông qua cầu khuếch đại tạo thành các khóm
cluster khác nhau. Khi cluster hình thành xong, quá trình giải trình tự bắt đầu, sử dụng mạch được tạo thành trong mỗi cluster làm mạch khuôn