CHƢƠNG II : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Vật liệu dụng cụ hóa chất dùng trong nghiên cứu
2.2.1 Trang thiết bị, dụng cụ
- Máy PCR model ABI9700 (Hãng sản xuất ABI – Mỹ) - Bể ủ nhiệt nước Memmert (Đức)
- Kính hiển vi quang học Olympus (Đức) - Máy đo pH (Oakton – Eutech)
- Máy chụp ảnh gel
- Tủ an toàn sinh học cấp 2 Esco.
- Máy giải trình tự gen Miseq System, Model SY-410-108 (Hãng Illumina – Mỹ)
- Tủ ấm 370C Memmert
- Máy li tâm tốc độ cao Eppendrof - Bộ điện di Imupid
2.2.2 Vật tư tiêu hao
- Que cấy,
- Đĩa petri 90mm - Pipet nhựa
- Đầu côn các loại, - Tube PCR- 0.2ml
- Bút đánh dấu
- Giá để ống nghiệm các loại
- Bình cầu hoặc bình nón: 25 ml, 50 ml, 100 ml, 300 ml, 500 ml, 1000 ml - Giấy thấm
2.2.3 Hóa chất, sinh phẩm
Hóa chất sinh phẩm dùng cho ni cấy phân lập
Kit định danh sinh hóa API 20A (Hãng BioMerieux)
Kháng sinh: D-cyloserin (Hãng Wako – Nhật), Trimethoprim và Sulfamethoxazol (Hãng Merck).
Môi trường không chọn lọc: Thạch GAM (Hãng Gifu - Nhật) Môi trường CMM (Hãng Oxoid – Mỹ)
Cồn 100% (Hãng Merck), 70%
Túi tạo kỵ khí Gas Pack (Hãng Mishumishi – Nhật) Chỉ thị kỵ khí (Hãng Oxoid – Mỹ)
Bộ hóa chất nhuộm Gram
Hóa chất sinh phẩm dùng cho PCR
2X Go-taq Master-Mix (GoTaq® DNA Polymerase, Promega) Thang chuẩn DNA: 100bp, 1kb
Thạch điện di,
Dung dịch đệm chạy điện di: TBE 0.5X Các cặp mồi [6] Gen đích Tên mồi Trình tự 5’-3’ Kích thƣớc sản phẩm PCR (bp) bot A Bot Af Bot Ar
AGC TAC GGA GGC AGC TAT GTT CGT ATT TGG AAA GCT GAA AAG G
782
bot B
Bot Bf Bot Br
CAG GAG AAG TGG AGC GAA AA CTT GCG CCT TTG TTT TCT TG
205
bot C
CP3-01 CP3-02
CTG AAA AAG CCT TTC GCA TT TTG TGC CGC AAA AGTATT GT
452
bot D
DS-11 DS-22
GTG ATC CTG TTA ATG ACA ATG TCC TTG CAA TGA AAG GGA TGC
497
Bot Er GCT ATT GAT CCA AAA CGG TGA
bot F
Bot Ff Bot Fr
CGG CTT CAT TAG AGA ACG GA TAA CTC CCC TAG CCC CGT AT
543
Hóa chất sinh phẩm dùng cho giải trình tự
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu:
2.3.1 Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả thực nghiệm và mô tả cắt ngang 2.3.2 Các kỹ thuật nghiên cứu
2.3.2.1 Kỹ thuật thu thập mẫu:
Hóa chất Hãng/mã số
AMPure XP bead Beckman Courter - A63882
Nextera XTDNA samples preparation kit 24 sample
Illumina/USA FC-131-1024
Nextera XT index kit (24 indicate) Illumina/USA FC-131-1001 MiSeq reagent kit 300V2 Illumina/USA MS-102-2002 Qubit Assay kit dsDNA HS Invitrogen- Q32851
Qubit Assay tubes Invitrogen- Q32856
Molecular Water Signma – W4502
TE buffer Sigma - T9285
Cồn tuyệt đối Merk
Đất: dùng xẻng nhỏ gạt lớp đất bề mặt sâu 10cm. Thu thập khoảng 100-200g đất vào túi zip/lọ vô trùng. Mật ong: thu khoảng 50-100g mẫu vào các lọ nhựa vô trùng. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ phòng cho đến khi sử dụng.
Mật ong: Thu mua nguyên lọ tại các cửa hàng, siêu thị hoặc thu thập mật ong tại trang trại nuôi ong. Mật ong được chia vào các lọ nhựa vô trùng, vận chuyển về PTN.
Mẫu thực phẩm: Thu thập mẫu thực phẩm nghi ngờ gây ngộ độc trong các vụ ngộ độc thực phẩm ngi ngờ do C. botulinum hoặc mẫu thực phẩm đóng hộp có dấu hiệu bất thường như phồng rộp, có mùi vị khó chịu ….
2.3.3.2 Kỹ thuật pha môi tr ờng nuôi cấy
Pha chế môi trƣờng thạch GAM
Cân bột thạch GAM theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hòa tan vào nước khử ion (nước cất 2 lần) và đun sôi để hịa tan hồn tồn thạch. Hấp ướt 1150C/15 phút. Để nguội xuống 500C. Trộn đều rồi đổ 15-20ml /1 đĩa 90 mm. Để mặt thạch khơ hồn tồn. Ghi nhãn (tên mơi trường, ngày sản xuất), đóng gói và bảo quản ở 4 – 80C. Sử dụng trong vịng 4 tuần.
Pha chế mơi trƣờng thạch EYA
Thành phần môi trường EYA gồm:
TT Thành phần 100ml 200ml 1 lít 1 Proteose Peptone 4g 8g 40g 2 Agar – Agar 2g 4g 20g 3 Na2HPO4 0.5g 1g 5g 4 KH2PO4: 0.1g 0.2g 1g 5 MgSO4 0.01g 0.02g 0.1g 6 NaCl 0.2g 0.4g 2g 7 Glucose 0.2g 0.4g 2g 8 Hemin (5mg/ml) 100µl 200µl 1000µl 9 Vitamin K1 (10mg/ml) 100µl 200µl 1000µl 10 Nước cất khử ion 95ml 190ml 950ml
11 Egg Yolk Emulsion 5ml 10ml 50ml
Cân các thành phần theo cơng thức từ 1 đến 9, hịa tan bằng nước khử ion và đun sôi để hịa tan hồn tồn thạch. Hấp ướt 1210C/15 phút. Để bình thạch nguội 500C, bổ sung 5% lòng đỏ trứng nhuyễn (Egg Yolk Emulsion - EYE). Trộn đều rồi đổ 15-20ml/1 đĩa 90 mm. Để mặt thạch khơ hồn tồn. Lấy bất kỳ một đĩa trong lô để kiểm tra vô trùng và dinh dưỡng. Số còn lại bảo quản ở 4 – 80C và dùng trong vòng 4 tuần.
Cách làm lịng đỏ trứng nhuyễn EYE
Rửa sạch vỏ ngồi trứng, ngâm trong cồn 70%/1 giờ, dùng panh kẹp vơ trùng tạo lỗ khí ở 2 đầu quả trứng. Mở rộng lỗ khí ở 1 đầu để dốc bỏ lịng trắng ra bên ngoài. Dùng xilanh để hút lấy lịng đỏ, quan sát thể tích lịng đỏ trứng hút được, cho
vào bình bi thủy tinh vô trùng. Cộng thêm 1 thể tích nước muối sinh lý tương đương. Lắc đều tay để nước muối phân tán đều, tạo nhũ tương lòng đỏ trứng (lòng đỏ trứng nhuyễn). Dùng pipet vơ trùng hút lịng đỏ trứng nhuyễn vào lọ thủy tinh hoặc lọ nhựa vô trùng mới. Bảo quản ở 40
C trong 4 tuần tuy nhiên nên sử dụng sản phẩm lòng đỏ trứng nhuyễn tươi (trong ngày) khi pha chế môi trường.
Môi trƣờng CBI là môi trường EYA bổ sung 3 loại kháng sinh: 250.0mg D-
Cycloserine, 76.0mg Sulfamethoxazole và 4.0mg Trimethoprim trong 1 lít thạch.
2.3.3.3 Kỹ thuật ni cấy phân lập vi khuẩn C. botulinum
Kỹ thuật nuôi cấy phân lập C. botulinum từ mẫu mật ong
Cân 20 gam mật ong (tương đương 15 ml) pha loãng 3 lần với dung dịch pepton 1% (45ml) trong ống falcon 50ml. Vortex hoặc lắc mạnh đến đồng nhất mẫu. Li tâm lạnh (5 - 80C) ở tốc độ 12.000 vịng/30 phút. Hút bỏ nước nổi (chú ý khơng chạm cặn), để lại 1-2 ml cặn. Dùng que cấy hoặc que tre vô trùng để làm tan cặn ly tâm, cấy trải 100µl cặn trên mơi trường thạch đĩa CBI. Ủ kỵ khí ở nhiệt độ phịng (khoảng 250C)/48 giờ. Phần cặn còn lại chuyển vào ống mơi trường thịt chín CMM để ni cấy tăng sinh. Ủ kỵ khí ở nhiệt độ phịng (khoảng 250C)/5 ngày. Sau đó dùng que tre vơ trùng phá vỡ hạt thịt, hút 100 µl phần canh thang cấy trải trên môi trường EYA. Ủ kỵ khí ở nhiệt độ phịng (khoảng 250C) trong 48 giờ
Kỹ thuật nuôi cấy phân lập C. botulinum từ mẫu đất
Cân 25 gam đất vào trong ống falcon 50ml, thêm 25g bi thủy tinh kích thước 0.5cm và 25ml đệm Gelatin Phosphat Buffer (GPB). Vortex hoặc lắc mạnh đến đồng nhất mẫu. Ly tâm 2.000 vịng/ 5 phút. Hút tồn bộ nước nổi (khoảng 18-20 ml) sang ống falcon 50 ml mới, đặt vào bể ủ nhiệt nước 650
C/30 phút, sau đó chia lượng nước nổi làm 2 phần bằng nhau:
Phần 1 cho vào ống falcon 15 ml vô trùng, li tâm 12.000 vòng/30 phút, bỏ nước nổi, hịa đều cặn và cấy trải 100 µl cặn trên mơi trường CBI. Ủ kỵ khí ở nhiệt độ phòng và 370C trong 48 giờ.
Phần 2 cho vào ống falcon đã có sẵn 10ml mơi trường CMM, đóng nắp, ủ kỵ khí ở nhiệt độ phịng và 370
C trong 3 ngày để ni cấy tăng sinh. Sau đó dùng que tre dầm nhỏ hạt thịt. Thực hiện sốc cồn phần canh thang tăng sinh trước khi nuôi cấy trên môi trường thạch bằng cách: lấy 500 canh thang + 500µl cồn tuyệt đối, trộn đều và để nhiệt độ phịng 60 phút, cấy trải 100 µl dung dịch sau sốc cồn trên mơi trường CBI. Ủ kỵ khí ở nhiệt độ phịng (khoảng 250C) và 370C trong 48 giờ.
Đọc kết quả ni cấy: Lựa chọn ít nhất 10 khuẩn lạc nghi ngờ có đặc điểm:
hơi dẹt, bề mặt thơ ráp, bờ khơng đều, có kết tủa mờ (lethicinase dương tính) xung quanh khuẩn lạc, có hình ảnh lấp lánh như ngọc trai (phản ứng lipase dương tính) để cấy thuần trên mơi trường CBI. Có thể phải cấy chuyển nhiều lần mới có được khuẩn lạc thuần. Khi có khuẩn lạc thuần trên CBI, chọn 1 khuẩn lạc cấy trên môi trường không chọn lọc GAM để thực hiện kỹ thuật định danh vi khuẩn bằng xác định tính chất sinh vật hóa học và lưu giữ chủng. Chủng thuần được lưu giữ trong môi trường Skim milk 20% ở -800C.
2.3.3.4 Kỹ thuật định danh bằng xác định tính chất sinh vật hóa học
Chuẩn bị hỗn dịch vi khuẩn
Dùng tăm bơng gặt tồn bộ khuẩn lạc trên đĩa thạch GAM. Cho vào lọ môi trường API 20A, xoay trịn tăm bơng hoặc mài vào thành ống để giũ vi khuẩn ra canh thang. Độ đục vi khuẩn tương đương hoặc hơn 3 McFaland (đục như nước vo gạo).
Chuẩn bị thanh sinh hóa
Ghi mã số chủng lên thanh sinh hóa, đặt vào trong khay ủ. Dùng pipet nhỏ huyền dịch vi khuẩn vừa chuẩn bị trong ống môi trường API 20A vào các giếng (hơi nghiêng thanh sinh hóa để dung dịch chảy xuống và tránh tạo bọt khí)
Đối với thử nghiệm GEL: Nhỏ canh khuẩn đầy giếng
Đối với thử nghiệm IND: nhỏ dầu khoáng lên trên để IND khơng bị bay hơi trong q trình ni cấy.
Đậy nắp, tạo độ ẩm và ủ 24h (±2h) ở nhiệt độ 360C ±20C trong điều kiện kỵ khí
Đọc kết quả tính chất sinh vật hóa học
Bromocresol (BCP) có mặt trong các ống sinh hóa bị quá trình lên men của vi khuẩn khử mất màu nếu vi khuẩn dương tính với tính chất sinh hóa này. Vì vậy bước đầu tiên khi đọc kết quả sinh hóa là nhỏ 1 giọt BCP vào tất cả các giếng chứa hidratcacbon. Dương tính nếu canh thang có màu vàng hoặc xanh vàng. Âm tính nếu canh thang khơng đổi màu (màu tím) so với trước khi ni cấy.
Thử nghiệm IND: Nhỏ 1 giọt xylen qua lớp dầu khoáng. Đợi 2-3 phút, nhỏ thêm 1 giọt thuốc thử HER. Đọc kết quả trong vòng 5 phút. Canh thang có màu đỏ hoặc hồng là dương tính. Canh thang khơng có màu là âm tính. Ghi vào bảng kết quả dương tính nếu có màu đỏ.
Đối với thử nghiệm GEL: cang thang chuyển sang màu đen là dương tính. Canh thang khơng đổi màu là âm tính.
Ghi nhận tất cả kết quả vào phiếu đọc kết quả.
Để phân tích kết quả tính chất sinh vật hóa học của chủng cần phải làm thêm thử nghiệm catalase (CAT) và thực hiện nhm soi vi khuẩn dưới kính hiển vi để xác định hình thái vì khuẩn (cầu khuẩn hay trực khuẩn, Gram dương hay Gram âm, sinh nha bào hay khơng) mới có đủ thơng tin để tính điểm.
Thử nghiệm CAT được thực hiện bằng cách: Dùng que cấy nhựa hoặc tăm tre vô trùng lấy vi khuẩn, phết lên lam kính, nhỏ 1-2 giọt hydro peroxyd 3% lên vi khuẩn. Nếu xuất hiện bọt khí thì ghi nhận kết quả dương tính, nếu khơng có bọt khí thì ghi nhận kết quả là âm tính.
Vi khuẩn sinh nha bào là (+), không sinh nha bào là (-). Cầu khuẩn là (+), trực khuẩn là (-).
Các kết quả dương tính cho 1 điểm, kết quả âm tính cho 0 điểm. Ghi kết quả dương âm và điểm số vào bảng ghi chép kết quả.
Hình 5: Phản ứng sinh vật hóa học
Hàng trên: màu sắc các phản ứng sinh hóa dƣơng tính. Hàng dƣới: màu sắc các phản ứng sinh hóa âm tính của kit sinh hóa Api 20A (nguồn: https://www.biomerieux-
usa.com/clinical/api)
Phiên giải kết quả: sử dụng phần mềm apiwebTM để phiên giải kết quả định danh vi sinh vật bằng tính chất sinh vật hóa học.
Ví dụ: Dãy số 4232 602 3 tương ứng kết quả định danh là C.septicum độ tin cậy 99.99%.
2.3.3.6 Kỹ thuật PCR phát hiện gen độc tố
Tách DNA bằng phƣơng pháp nhiệt
Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn, hịa tan trong 200µl đệm TE. Ủ nhiệt khơ 950C trong 15 phút. Ly tâm 14.000 vịng/2 phút. Lấy nước nổi làm DNA khn mẫu. DNA có thể sử dụng ngay hoặc bảo quản ở -200
C.
Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng PCR
Lấy các thành phần của hỗn hợp phản ứng PCR từ -200C ra, để vào khay lạnh hoặc để ở ngăn mát tủ lạnh hoặc hộp đá vụn đến khi tan hoàn toàn, trộn đều bằng cách búng nhẹ vào đáy tube và ly tâm ngắn trước khi mở nắp. Khi sử dụng nên trộn đều các thành phần 2 – 3 lần bằng pipet.
Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng PCR gồm các thành phần theo bảng 2.1, trộn đều, ly tâm ngắn sau đó chia 18µl hỗn hợp phản ứng PCR vào các tube PCR 0.2ml.
Bảng 2 .1 thành phần phản ứng PCR Thành phần Thành phần PCR 1x(µl) Nồng độ cuối cùng PCR Master Mix 2x 10 1x Mồi xi 20µM 0.6 0,3 µM Mồi ngược 20µM 0.6 0,3 µM MgCl2 25mM 0.8 2,5 mM
Nước tinh khiết 6.0
DNA khuôn 2
Bổ sung DNA mẫu và chạy phản ứng PCR
Tra DNA mẫu vào hỗn hợp phản ứng PCR được tiến hành trong tủ an toàn sinh học cấp 2 chuyên dùng để tra DNA. Hỗn hợp thành phần phản ứng PCR sau khi bổ sung DNA mẫu được ly tâm ngắn trước khi đưa vào máy PCR. Chu trình nhiệt: 940
C (5 phút), 35 chu kì: 940C (30 giây), 600C (30 giây), 720C (1 phút), 720C (3 phút), giữ 150C. Điện di sản phẩm trên thạch Agarose nồng độ 1,5%, điện trường 100V trong thời gian 30 phút.
Phân tích kết quả PCR
Mẫu chứng âm (nước cất tinh sạch) không được lên vạch DNA nào, nếu thấy vạch là phản ứng PCR đã bị nhiễm và phải thực hiện lại kỹ thuật. Các mẫu được xác định dương tính khi xuất hiện các vạch có kích thước tương ứng với gen độc tố. Các mẫu khơng có vạch hoặc có vạch khơng đúng kích thước gen độc tố được coi là âm tính.
2.3.3.7 Kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen vi khuẩn
Nguyên lý: DNA tổng số của vi khuẩn được cắt nhỏ thành các mảnh (kích thước trung bình từ 200 – 400bp), các index ngắn sau đó được nối vào 2 đầu của mỗi mảnh DNA. Các index này sẽ làm trình tự mồi cho emPCR và giải trình tự.
Quy trình giải trình tự bằng cơng nghệ Illumina NGS gồm 3 bước thực hiện cơ bản:
Bước 1: Chuẩn bị DNA tổng số của vi khuẩn Bước 2: Chuẩn bị thư viện (library preparation) Bước 3: Chạy máy giải trình tự Illumina-Miseq
Các bƣớc tiến hành:
Bƣớc 1: Chuẩn bị DNA tổng số của vi khuẩn
Tách DNA tổng số của vi khuẩn bằng kit QIAamp DNA Mini Kit
Lấy đầy 1 que cấy 10µl vi khuẩn hịa đều vào 200µl đệm AE. Ly tâm 13.000 vòng/10 phút để loại bỏ nước nổi, thu cặn vi khuẩn. Trộn đều cặn vi khuẩn trong 180µl dung dịch đệm ALT. Nhỏ 20µl protein K trộn đều bằng máy trộn voltex. Ủ 560C/1 giờ trong máy ủ nhiệt đến khi vi khuẩn ly giải hoàn tồn (dung dịch đệm trong, khơng nhầy). Trộn đều bằng máy trộn voltex trong 15 giây, nhỏ 200µl dung dịch đệm AL, trộn đều sau đó nhỏ 200µl cồn tuyệt đối và trộn đều. Hút tồn bộ hỗn hợp nhỏ vào cột DNeasy Mini spin coumn, ly tâm 8000 vòng x 1 phút. Rửa cột bằng cách nhỏ 500µl dung dịch đệm AW1, ly tâm 8000 vòng x 1 phút. Rửa lần 2 bằng 500µl dung dịch AW2, ly tâm 14000 vòng x 3 phút. Chuyển cột sang tube 1.5ml sạch mới, nhỏ 200µl dung dịch đệm AE vào trung tâm cột, để DNA ly giải ở nhiệt độ phòng 5 phút, ly tâm 8000 vịng x 2 phút thu DNA tổng số.
Chuẩn hóa nồng độ đầu vào của DNA tổng số bằng kit Nextera XT DNA Library Preparation Kit
Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ tương đối của DNA sau khi tách bằng đo Nanodrop: Sử dụng 2ul mẫu DNA của từng mẫu sau khi tách để đo Nanodrop; giá
trị tỉ số 260/280 từ 1,8-2,0 là đạt yêu cầu về độ tinh sạch của DNA đầu vào cho quá trình giải trình tự. Nếu nồng độ DNA quá thấp (dưới 50ng/ul) cần tách lại mẫu và tăng lượng tế bào vi khuẩn. Sau đó xác định lại nồng độ DNA của mẫu bằng kit Qubit dsDNA HS và pha loãng DNA mẫu về nồng độ 3.5 ng/ul.
Bƣớc 2: Chuẩn bị thƣ viện
Tagmentation: DNA tổng số của vi khuẩn được cắt ngẫu nhiên thành đoạn
nhỏ bằng ezyme. Rã đông các sinh phẩm ATM, TD and DNA tổng số, để trên khay inox đông lạnh. NT đưa về nhiệt độ phòng. Đảo tube 3-5 lần rồi spin down. Trộn